《血紅蛋白的提取和分離》試題庫2

《血紅蛋白的提取和分離》試題庫題組11.使用凝膠色譜法分離蛋白質實驗中,相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的行進過程,可表示為圖中()解析:本題考查對凝膠色譜法分離蛋白質原理的理解,相對分子質量較大的蛋白質留在顆粒外面,相對分子質量較小的蛋白質進入顆粒內部;相對分子質量大的蛋白質通過凝膠間隙先被洗脫,相對分子質量小的蛋白質進入凝膠內部而后被洗脫。答案:B2.蛋白質提取和分離分為哪幾步?()A.樣品處理、凝膠色譜操作、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳B.樣品處理、凝膠色譜操作、純化C.樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D.樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定解析:A中凝膠色譜操作及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳為實驗操作過程中的技術。答案:C3.在血紅蛋白的整個提取過程中,不斷用磷酸緩沖液處理的目的是()A.防止血紅蛋白被氧化B.血紅蛋白是一種兩性物質,需要酸中和C.磷酸緩沖液會加速血紅蛋白的提取過程D.讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內,維持其結構和功能解析:利用磷酸緩沖液模擬細胞內的pH環(huán)境,保證血紅蛋白的正常結構和功能,便于分離觀察(紅色)和研究(活性)。答案:D4.將人紅細胞置于盛有下列液體的離心管中,10min后離心,得到沉淀物和上清液,則上清液中K+含量最高的離心管內盛有()A.質量分數為10%的氯化鈉溶液B.質量分數為20%的蔗糖溶液C.質量分數為%的氯化鈉溶液D.蒸餾水解析:紅細胞在蒸餾水中滲透吸水漲破,所以細胞中K+流出,使上清液中K+含量較高。答案:D5.凝膠色譜分離法分離蛋白質時,凝膠的種類較多,但其作用都是()A.改變蛋白質分子通過凝膠時的路徑B.吸附一部分蛋白質,從而影響蛋白質分子的移動速度C.將酶或細胞固定在凝膠中D.與蛋白質分子進行化學反應,從而影響其移動速度解析:凝膠的種類較多,但每一種凝膠內部都有孔隙。相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時,相對分子質量小的容易進入凝膠內部的通道,路程較長,移動速度較慢;相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部,只能在凝膠外部移動,路程較短,移動速度較快。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。答案:A聚丙烯酰胺凝膠電泳法加入SDS的作用是()A.增大蛋白質的相對分子質量B.改變蛋白質的形狀C.掩蓋不同種蛋白質間的電荷差別D.減少蛋白質的相對分子質量解析:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所加的SDS可完全掩蓋不同種蛋白質間的電荷差。答案:C7.下列關于血紅蛋白提取和分離實驗中樣品處理步驟的描述,正確的是()A.紅細胞的洗滌:加入蒸餾水,緩慢攪拌,低速短時間離心B.血紅蛋白的釋放:加入生理鹽水和甲苯,置于磁力攪拌器上充分攪拌C.分離血紅蛋白:將攪拌好的混合液離心、過濾后,用分液漏斗分離D.透析:將血紅蛋白溶液裝入透析袋,置于pH為的磷酸緩沖液中透析12h解析:對紅細胞進行洗滌時,應加入生理鹽水,防止細胞破裂;將血紅蛋白從紅細胞中釋放時,需要加入蒸餾水,以便使紅細胞破裂釋放出血紅蛋白;透析時,應將透析袋置于pH為的磷酸緩沖液中透析12h。答案:C8.在蛋白質的提取和分離中,關于對樣品處理過程的分析無誤的是()A.洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機鹽B.洗滌時離心速度過小,時間過短,白細胞等會沉淀,達不到分離的效果C.洗滌過程選用質量分數為%的NaCl溶液D.透析的目的是去除樣品中相對分子質量較小的雜質解析:洗滌紅細胞的目的是去除血漿中雜蛋白;洗滌時離心速度過大,時間過長,白細胞等會沉淀,達不到分離的效果;洗滌過程選用質量分數為%的NaCl溶液。答案:D9.下列有關透析的敘述,錯誤的是()A.用于透析的薄膜要具有選擇透過性B.透析膜一般是用硝酸纖維素制成的C.透析能使小分子自由進出,而將大分子保留在袋內D.透析可用于更換樣品的緩沖液解析:透析袋一般是用硝酸纖維素(又稱玻璃紙)制成的,它沒有生物活性,故不具有選擇透過性(活的生物膜才具有選擇透過性)。透析袋能使小分子自由進出,而將大分子保留在袋內。透析可以去除樣品中相對分子質量較小的雜質,或用于更換樣品的緩沖液。答案:A10.已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種蛋白質分子,其分子大小、所帶電荷的性質和數量情況如下圖所示,下列有關該樣品中蛋白質的分離的敘述,正確的是()A.將樣品裝入透析袋中透析12h,若分子乙保留在袋內,則分子丙也保留在袋內B.若用凝膠色譜柱分離樣品中的蛋白質,則分子甲移動速度最快C.若將樣品以2000r/min的速度離心10min,分子戊存在于沉淀中,則分子甲也存在于沉淀中D.若用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質分子,則分子甲和分子戊形成的電泳帶相距最遠解析:分子乙留在透析袋內,說明其相對分子質量比較大,分子丙的相對分子質量比分子乙大,所以分子丙也留在袋內;分子甲的相對分子質量最小,進入凝膠內部通道而移動速度慢;分子戊比分子甲的相對分子質量大,分子甲可能不存在于沉淀中;SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的樣品,其電泳遷移率完全取決于分子的大小,相對分子質量相差越大,形成的電泳帶相距越遠。答案:A11.在血紅蛋白分離過程中,如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬,與其有關的是()A.血紅蛋白釋放 B.色譜柱的裝填C.洗脫過程 D.樣品的處理解析:如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話,能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整,隨著洗脫液緩慢流出;如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬,說明分離的效果不好,這與凝膠色譜柱的裝填有關。答案:B12.下列對在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作,不正確的是()A.加樣前要使柱內凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊B.讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動,貼壁加樣至色譜柱頂端,不要破壞凝膠面C.打開下端出口,待樣品完全進入凝膠層后,直接連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫D.待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時,每5mL收集一管,連續(xù)收集流出液解析:打開下端出口,待樣品完全進入凝膠層后,關閉下端出口,再小心加入適量的20mmol/L的磷酸緩沖液,然后連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫。答案:C13.下圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實驗裝置,請回答下列問題。(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分,其在紅細胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質具有功能。(2)甲裝置中,B是血紅蛋白溶液,則A是;乙裝置中,C溶液的作用是。(3)甲裝置用于,目的是。用乙裝置分離蛋白質的方法叫,是根據分離蛋白質的有效方法。(4)用乙裝置分離血紅蛋白時,待時,用試管收集流出液,每5mL收集一管,連續(xù)收集。解析:血紅蛋白具有運輸O2和部分CO2的作用。用緩沖液可以保持與體內的pH一致。甲裝置中,B是血紅蛋白溶液,則A是磷酸緩沖液;乙裝置中,C溶液的作用是洗脫血紅蛋白。甲裝置用于透析(粗分離),目的是去除樣品中相對分子質量較小的雜質。用乙裝置分離蛋白質的方法叫凝膠色譜法,是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。答案:(1)運輸(2)磷酸緩沖液洗脫血紅蛋白(3)透析(粗分離)去除樣品中相對分子質量較小的雜質凝膠色譜法相對分子質量的大小(4)紅色的蛋白質接近色譜柱底端14.血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分,負責血液中O2或CO2的運輸。請根據血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。(1)將實驗流程補充完整:A為,B為。(2)洗滌紅細胞的目的是去除,洗滌次數過少,無法除去;離心速度過高和時間過長會使一同沉淀,達不到分離的效果。洗滌干凈的標志是。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是。(3)在洗脫過程中加入物質的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液(pH為的目的是。如果紅色區(qū)帶,說明色譜柱制作成功。解析:在蛋白質分離與提取過程中包括樣品的處理、粗分離、純化和純度鑒定四步,每一步均應用了不同的操作技術。答案:(1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫(2)雜蛋白(血漿蛋白)血漿蛋白白細胞和淋巴細胞離心后的上清液中沒有黃色蒸餾水和甲苯(3)準確模擬生物體內的生理環(huán)境,保持體外的pH和體內一致均勻一致地移動15.某生物興趣小組在“蛋白質的提取和分離”實驗中,準備從豬的血液中初步提取血紅蛋白,設計的“血紅蛋白提取、分離流程圖”如下。實驗準備(配制緩沖液、血細胞懸液)樣品處理(洗滌、破碎、離心等)蛋白質粗分離(透析)純化、純度鑒定(凝膠色譜法、電泳等)請回答下列有關問題。(1)樣品處理中紅細胞的洗滌要用反復沖洗、離心。向紅細胞懸液中加入一定量的低濃度pH=的緩沖液并充分攪拌,可以破碎紅細胞,破碎細胞的原理是

。(2)血紅蛋白粗分離階段,透析的目的是,若要盡快達到理想的透析效果,可以(寫出一種方法)。(3)電泳利用了待分離樣品中各種分子的等的差異,而產生不同遷移速度,實現(xiàn)各種分子的分離。(4)一同學通過血紅蛋白醋酸纖維薄膜電泳,觀察到正常人和鐮刀型細胞貧血癥患者的血紅蛋白電泳結果如圖所示。由圖可知攜帶者有種血紅蛋白,從分子遺傳學的角度作出的解釋是

。解析:(1)洗滌紅細胞所用的溶液是生理鹽水,根據滲透作用原理,將紅細胞置于低滲溶液中,紅細胞會吸水漲破,釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白粗分離階段,透析的目的是除去樣品中的小分子雜質。可通過增加緩沖液的量或及時更換緩沖液等方法縮短透析時間,盡快達到理想的透析效果。(3)由于各種分子帶電性質以及分子大小、形狀等的差異,在電泳過程中會產生不同的遷移速度,從而實現(xiàn)各種分子的分離。(4)根據圖示可知,鐮刀型細胞貧血癥的攜帶者含有兩種血紅蛋白,原因是攜帶者具有(控制血紅蛋白的)一對等位基因,可以控制合成兩種不同的蛋白質。答案:(1)生理鹽水滲透原理(當外界溶液濃度低于動物細胞內液濃度時,細胞吸水漲破)(2)除去小分子雜質增加緩沖液的量或及時更換緩沖液(3)帶電性質以及分子大小、形狀(4)2攜帶者具有(控制血紅蛋白的)一對等位基因,可以控制合成兩種不同的蛋白質題組21．蛋白質的分離方法——凝膠色譜法凝膠色譜法也稱做________________，是根據________________的大小分離________的有效方法。相對分子質量直徑大小運動方式運動速度運動路程洗脫次序大____凝膠顆?？障吨睆?，被排阻在____垂直向下移動____較短先從凝膠柱洗脫出來小____凝膠顆?？障吨睆?，可以進入顆粒內部垂直向下移動，無規(guī)則擴散進入凝膠顆粒____較長后從凝膠柱洗脫出來2.緩沖液的作用和組成(1)作用在一定范圍內，緩沖溶液能夠抵制外界________和________對溶液________的影響，維持pH基本不變。純水的pH因加入少量的強酸或強堿而發(fā)生很大變化。然而，1滴濃鹽酸加入到1LCH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(從×10－7mol/L增到×10－7mol/L)，pH沒有明顯變化。(2)組成緩沖溶液通常由________種緩沖劑溶解于水中配制而成，調節(jié)緩沖劑的____________就可以制得________________________的緩沖液，其類型主要有3種：①弱酸及其對應鹽，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。②多元弱酸的酸式鹽及其對應的次級鹽，如NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。③弱堿及其對應鹽，如NH3·H2O—NH4Cl。3．電泳(1)概念電泳是指____________在________的作用下發(fā)生________的過程。許多重要的生物大分子，如________、________等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上________或________。在電場的作用下，這些帶電分子會向著________________的電極移動。(2)原理在同一電場下，由于各種分子________性質的差異及分子本身________、______的不同，使帶電分子產生________________，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。(3)常用方法①____________電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場中的遷移速率因各種分子帶電性質的差異、分子大小和形狀不同而不同，從而得以分離。②________________電泳加入SDS作用：使蛋白質發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈；與各種蛋白質結合形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量遠遠超過了蛋白質原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。1．紅細胞的洗滌(1)目的：____________，以利于后續(xù)步驟的分離純化。(2)過程eq\x(①采集血樣)：為防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血劑檸檬酸鈉eq\x(②低速短時)：500r/min，離心2min，這樣做的目的是防止紅細胞與白細胞一同沉淀，達不到分離效果eq\x(③吸去)：用膠頭吸管吸去上層黃色血漿eq\x(④生理鹽水)：向盛有暗紅色紅細胞液體的燒杯中加入五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌10mineq\x(⑤低速短時離心)eq\x(⑥重復③④步驟三次)：直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已經洗滌干凈，否則需重復洗滌(3)操作提示：洗滌次數、離心速度與離心時間十分重要，洗滌次數少，無法除去血漿蛋白，離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，達不到分離效果。2．血紅蛋白的____(1)方法：將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中，加______到原血液的體積，再加40%體積的______，置于磁力攪拌器上充分攪拌10min。(2)目的：使紅細胞吸水____，血紅蛋白釋放出來。(3)原理：滲透作用。3．分離血紅蛋白溶液(1)方法①將攪拌好的混合液轉移到__________中，以2000r/min的速度____10min。②將離心管中的液體部分用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層。③將濾液置于分液漏斗中，靜止片刻后，分出下層的紅色透明液體，即為血紅蛋白溶液。(2)目的：使________與大部分雜質分離開，便于后續(xù)純化。(3)離心后試管中的溶液分為4層，最上面的一層是甲苯層，第二層是脂溶性物質沉淀層，第三層是血紅蛋白水溶液層，最下層是雜質沉淀層。4．粗分離——透析(1)原理：______能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內。(2)過程：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為，透析12h。(3)目的①除去樣品中相對分子質量較小的雜質。②用于更換樣品的緩沖液。1．凝膠色譜柱的制作(1)取長40cm，內徑為1.6cm的________，兩端需用砂紙磨平。(2)柱底部制作：打孔→挖出________→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗將________上部包好。(3)柱頂部制作：打孔→安裝玻璃管。(4)將上述三部分按相應位置組裝成一個整體。2．凝膠色譜柱的裝填(1)計算：根據色譜柱的內體積計算所需凝膠量↓(2)凝膠_______：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸液↓(3)________：將色譜柱垂直固定在支架上↓(4)________：將凝膠懸液一次性裝填入色譜柱內↓(5)________：用20mmol/L的磷酸緩沖液(pH＝洗滌平衡凝膠12h，使凝膠裝填緊密3．樣品的加入和洗脫(1)調整緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，調整緩沖液與凝膠面________(2)________透析樣品：關閉下端出口，用吸管小心將1mL樣品加到色譜柱頂端(3)樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(4)再調整________：關閉出口，小心加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度(5)________：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫(6)收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集四、實驗操作提示1．紅細胞的洗滌：________________________________。2．凝膠的預處理：_________________________________________________________。3．色譜柱的裝填：___________________________________________________________。4．色譜柱成功的標志：________________________。五、蛋白質純度鑒定及實驗結果分析與評價1．純度鑒定——________________________________判斷純化的蛋白質是否達到要求，需要進行蛋白質純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。2．結果分析與評價項目分析血液樣品的處理分層____→樣品處理完成eq\a\vs4\al(分層不明,顯的原因)eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(洗滌次數少，未能除去血漿蛋白,離心速度過高和時間過長))凝膠色譜柱的裝填放一個與凝膠柱垂直的日光燈→直接檢查；加入大分子有色物質如藍色葡聚糖或紅色葡聚糖，若色帶均勻、狹窄、平整→裝填成功血紅蛋白的分離血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出→分離成功1．利用凝膠色譜法分離蛋白質時，蛋白質洗脫出來的順序是()①相對分子質量最大的②相對分子質量最小的③相對分子質量適中的A．①②③B．③②①C．①③②D．②①③2．凝膠色譜法是分離蛋白質分子的一種常用方法，但并非所有的蛋白質都可以用此方法進行分離，能分離的蛋白質分子之間必須()A．具有相同的相對分子質量B．相對分子質量不同，但都是相對分子質量較大的分子C．相對分子質量不同，但都是相對分子質量較小的分子D．具有不同的相對分子質量知識點二分離蛋白質的實驗操作3．對在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作，不正確的是()A．加樣前要使柱內凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊B．讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動，貼壁加樣至色譜柱頂端，不要破壞凝膠面C．打開下端出口，待樣品完全進入凝膠層后，直接連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫D．待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，每5mL收集一管，連續(xù)收集流出液4．在蛋白質的提取和分離中，關于對樣品處理過程的分析無誤的是()A．洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機鹽B．洗滌時離心速度過小，時間過短，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果C．洗滌過程選用%的生理鹽水D．透析的目的是去除樣品中相對分子質量較小的雜質1．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷________方向的電極移動()A．相同B．相反C．相對D．相向2．在血紅蛋白分離過程中，使用緩沖液的作用是()A．維持溶液濃度不變B．維持溶液酸堿度不變C．催化蛋白質分離過程順利完成D．無實際意義3．下列有關提取和分離血紅蛋白的敘述，錯誤的是()A．樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液B．通過透析可以去除樣品中分子質量較大的雜質，此為樣品的粗提取C．可通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化D．可通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度4．凝膠色譜分離法分離蛋白質時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是()A．改變蛋白質分子通過凝膠時的路徑B．吸附一部分蛋白質，從而影響蛋白質分子的移動速度C．將酶或細胞固定在凝膠中D．與蛋白質分子進行化學反應，從而影響其移動速度5．下列各項中，除哪項外均為電泳使樣品中各分子分離的原因()A．分子帶電性質的差異 B．分子的大小C．分子的形狀 D．分子的變性溫度6．下列關于樣品的加入和洗脫的敘述，正確的是()A．先加入1mL透析后的樣品B．加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出C．如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功D．洗脫時可以用緩沖液也可以用清水7．凝膠柱制作的順序一般是()①橡皮打孔②挖凹穴③裝玻璃管④蓋尼龍網⑤蓋尼龍紗⑥將橡皮塞插入玻璃管⑦接尼龍管、裝螺旋夾⑧柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞A．①③④⑤⑥⑧⑦② B．①②③④⑤⑥⑦⑧C．①②③④⑥⑤⑧⑦ D．①②③⑦⑥⑤⑧④8．凝膠色譜柱制作成功的標志是()A．凝膠裝填緊密、均勻B．凝膠色譜柱中有氣泡C．洗脫中，紅色區(qū)帶均勻一致移動D．洗脫中，紅色區(qū)帶偏向左邊移動9．凝膠色譜技術是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果，目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關領域廣泛應用，不但應用于科學實驗研究，而且已經大規(guī)模地用于工業(yè)生產。據圖回答問題：(1)a、b均為蛋白質分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是________，原因________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結構可由__________________________替代。(3)裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內不能有氣泡存在，原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)若選用SephadexG－100，則“G”表示_________________________________________，100表示______________。10．紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關問題：(1)血紅蛋白提取和分離的過程可分為四步：__________、________、________和________。(2)實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。①加入檸檬酸鈉的目的是____________________________________________________。②以上所述的過程即是樣品處理，它包括__________________________、______________、收集血紅蛋白溶液。(3)洗滌紅細胞的目的是___________________________________________________。(4)你如何知道紅細胞已洗滌干凈？________________________________________________________________________。(5)分離紅細胞時的離心速度及離心時間分別是____________________________________________________________________________。(6)若離心速度過高和時間過長結果會怎樣？_________________________________________________________________________________________________________________________________________。(7)將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進行透析，即樣品的粗分離。①透析的目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________②透析的原理是__________________________________________________________________________________________________________________________________(8)然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。樣品純化的目的是_____________________________________________________________________________________________________________________________知識清單一、1.分配色譜法相對分子質量蛋白質大于外面較快小于較慢2．(1)酸堿pH(2)1～2使用比例在不同pH范圍內使用3．(1)帶電粒子電場遷移多肽核酸正電負電與其所帶電荷相反(2)帶電大小形狀不同的遷移速度(3)①瓊脂糖凝膠②聚丙烯酰胺凝膠二、1.(1)去除雜蛋白(2)②離心③血漿④洗滌2．釋放(1)蒸餾水甲苯(2)漲破3．(1)①離心管離心(2)血紅蛋白4．(1)透析袋三、1.(1)玻璃管(2)凹穴橡皮塞2．(2)溶脹(3)固定(4)裝填(5)洗滌平衡3．(1)平齊(2)滴加(4)緩沖液面(5)洗脫四、1.洗滌次數不能過少；低速、短時離心2．沸水浴法不但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物和氣泡3．裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流4．紅色區(qū)帶均勻一致地移動五、—聚丙烯酰胺凝膠電泳2.明顯對點訓練1．C[分子很大，完全不能進入凝膠內的任何孔隙的蛋白質洗脫出來的時間最短；分子大小適中，能進入凝膠內孔隙中孔徑大小相應部分的蛋白質，洗脫出來的時間次之；分子很小，能進入分子篩全部孔隙內的蛋白質，洗脫出來的時間最長。]聯(lián)想凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法，相對分子質量很小，能進入分子篩的全部孔隙，運動速度最慢，路程最長；相對分子質量較大的，不能進入凝膠顆粒內，運動速度最快，路程最短。所以，蛋白質可以按不同順序洗脫出來。規(guī)律鏈接凝膠色譜中分子彼此間較易分開的原因在凝膠色譜中會有三種情況：一是分子很小，能進入分子篩的全部內孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分。三類分子彼此間較易分開。2．C[若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內的各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的，分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠。]3．C[打開下端出口，待樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口，在用同樣的方法小心加入適量的20mmol/L的磷酸緩沖液，然后連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫。]規(guī)律鏈接血紅蛋白提取與分離過程中的注意事項1．紅細胞的洗滌(1)離心速度與離心時間十分重要，離心轉速要低，時間要短，否則白細胞等會一同沉淀，達不到分離的效果。(2)重復洗滌三次，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數，否則無法清除血漿蛋白。2．血紅蛋白的釋放(1)蒸餾水的作用：使紅細胞的細胞膜和核膜破裂。(2)甲苯的作用：溶解細胞膜。3．色譜柱填料的處理為了加速干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，通常只需1～2h。這種方法不僅節(jié)約時間，還可除去凝膠中可能帶有的微生物，排出膠粒內的空氣。4．凝膠色譜柱的裝填在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。(1)在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。(2)在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。5．蛋白質的分離滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。根據紅色區(qū)帶的移動狀況判斷收集流出液的時間。4．D[洗滌紅細胞的目的是去除血漿中除血紅蛋白以外的雜蛋白；洗滌時離心速度過大，時間過長，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果；洗滌過程選用%的生理鹽水。]達標測試1．B[在一定pH作用下，生物大分子中有某些可解離的基團，這些基團會帶上正電荷或負電荷，在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。]2．B[分離蛋白質時加入緩沖液，其原因是緩沖液在一定范圍內能抵制外界酸和堿對反應溶液pH的影響，保持pH基本不變。]3．B[血紅蛋白的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。其中樣品處理又包括紅細胞的洗滌、血紅蛋白釋放、分離血紅蛋白溶液等步驟，其目的是獲得血紅蛋白溶液；粗分離即透析，其目的是除去樣品中相對分子質量較小的雜質，故B項描述錯誤。]4．A[凝膠的種類較多，但每種凝膠內部都有孔隙。相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量較小的蛋白質分子可以進入凝膠內部，通過的路程較長，洗脫時從凝膠柱中出來的較晚，相反相對分子質量較大的蛋白質分子則可以較早的洗脫出來，從而達到分離蛋白質的目的。]5．D[電泳是指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程，樣品分子的帶電性質不同、分子的大小和形狀不同都會影響帶電粒子在電場中的遷移速度，與分子的變性溫度無關，故選D項。]6．C[加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面齊平，關閉出口之后，用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端。]7．B[凝膠柱制作的一般流程是：選擇玻璃管→選擇合適的橡皮塞→打孔→挖凹穴→蓋尼龍網→蓋尼龍紗→將橡皮塞插到玻璃管→接尼龍管→裝螺旋夾→柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞。]8．C[洗脫過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。]9．(1)aa相對分子質量大，無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快(2)尼龍網和尼龍紗(3)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果(4)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍凝膠得水值解析用凝膠色譜法分離各種大分子物質時，大分子物質先洗脫出來，然后是小分子物質。大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而落后于大分子物質洗脫出來。在色譜柱中填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。二是凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。10．(1)樣品處理粗分離純化純度鑒定(2)①防止血液凝固②紅細胞的洗滌血紅蛋白的釋放(3)去除血漿蛋白(4)離心后的上清液沒有黃色(5)低速500r/min；短時間如2min(6)離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度(7)①去除分子量較小的雜質②透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內(8)通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去題組31．凝膠色譜法分離蛋白質的原理依據是()A．蛋白質分子與凝膠的親和力的大小B．蛋白質相對分子質量的大小C．蛋白質所帶電荷的多少D．蛋白質溶解度的大小解析：凝膠色譜法所用的凝膠實際上是一些微小多孔的球體，在小球體內部有許多貫穿的通道，相對分子質量小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢；相對分子質量較大的蛋白質只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快，相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。答案：B2．在血紅蛋白的整個提取過程中，不斷用磷酸緩沖液處理的目的是()A．防止血紅蛋白被氧氣氧化B．血紅蛋白是一種堿性物質，需磷酸中和C．磷酸緩沖液會加速血紅蛋白的提取過程D．讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持其結構和功能解析：利用磷酸緩沖液模擬細胞內的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于分離觀察和研究。答案：D3．洗滌紅細胞時，離心所采用的方法是()A．低速長時間離心 B．低速短時間離心C．高速長時間離心 D．高速短時間離心解析：高速或長時間離心，會導致白細胞和淋巴細胞一同沉淀，得不到純凈的紅細胞，進而影響血紅蛋白的提取純度。答案：B4．右圖表示對某蛋白質溶液進行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果(相似于紙層析法分離色素)，下列相關敘述不正確的是()A．蛋白質上某些基團解離后可使蛋白質帶電，電場中帶電的蛋白質分子(或多肽)會向著與其所帶電荷相反的電極移動B．蛋白質在SDS－聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度完全取決于其所帶凈電荷多少C．蛋白質在SDS－聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度基本取決于其相對分子質量的大小D．電泳結果表明溶液中蛋白質可能有兩種，但也可能只有一種解析：蛋白質的氨基與羧基可發(fā)生解離，使其帶正電或負電，在電場中發(fā)生遷移。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳所加的SDS可完全掩蓋蛋白質本身所帶電荷，故其移動速度與本身所帶電荷無關，而由其分子大小決定。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳會使蛋白質水解成肽鏈，故結果所示可能只有一種蛋白質(有兩種肽鏈)，也可能是兩種蛋白質。答案：B5．血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，負責血液中O2或CO2的運輸。請根據下面血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。(1)將實驗流程補充完整。(2)凝膠色譜法的基本原理是根據________分離蛋白質。(3)洗滌紅細胞的目的是去除________，洗滌干凈的標志是____________________。(4)分離血紅蛋白時，由上到下第_______________層是血紅蛋白水溶液。(5)下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的加入示意圖，正確的加樣順序是______。(6)如果紅色區(qū)帶____________，說明色譜柱制作成功。解析：(1)樣品處理包括：紅細胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液和透析。凝膠色譜操作包括：凝膠色譜柱的制作、凝膠色譜柱的裝填、樣品的加入和洗脫。(2)凝膠色譜法的基本原理是根據相對分子質量的大小分離蛋白質。(3)洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，洗滌干凈的標志是上清液中沒有黃色。(4)分離血紅蛋白時，可明顯看到試管中的溶液分為4層：第一層為無色透明的甲苯層；第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層；第3層是紅色透明液體，是血紅蛋白的水溶液；第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。(5)加樣順序是：調整緩沖液面、滴加透析樣品、樣品滲入凝膠床、再調整緩沖液面。(6)如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。答案：(1)血紅蛋白的釋放凝膠色譜柱的裝填(2)相對分子質量的大小(3)雜蛋白(或血漿蛋白)離心后的上清液中沒有黃色(4)三(5)④①②③(6)均勻一致地移動題組41．用凝膠色譜法分離蛋白質時，相對分子質量大的蛋白質()A．路程較長，移動速度較慢B．路程較長，移動速度較快C．路程較短，移動速度較慢D．路程較短，移動速度較快解析：凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法，當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。答案：D2．凝膠色譜分離法分離蛋白質時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是()A．改變蛋白質分子通過凝膠時的路徑B．吸附一部分蛋白質，從而影響蛋白質分子的移動速度C．將酶或細胞固定在凝膠中D．與蛋白質分子進行化學反應，從而影響其移動速度解析：凝膠的種類很多，但所有凝膠均是一些微小的多孔球體，小球內部有許多貫穿的通道，由于不同蛋白質相對分子質量不同，在凝膠中走過的路徑不同，因而得以分離。答案：A3．相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的分離過程可表示為下圖中哪一個()解析：根據分子篩效應可知，相對分子質量較大的蛋白質分子通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量小的分子后流出。答案：B4．血紅蛋白的提取和分離一般分為四步，符合要求的是()A．粗分離→樣品處理→純化→純度鑒定B．粗分離→純化→樣品處理→純度鑒定C．樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定D．純化→純度鑒定→粗分離→樣品處理解析：血紅蛋白的提取和分離一般可分為四大步，包括樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。答案：C5．樣品的加入和洗脫的操作不正確的是()A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面[B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠柱內C．等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口D．用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面解析：加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊。答案：A6．使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于()A．電荷的多少 B．分子的大小C．肽鏈的多少 D．分子形狀的差異解析：由于SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。答案：B7．(2011·廣東高考)以下關于豬血紅蛋白提純的描述，不正確的是()A．洗滌紅細胞時，使用生理鹽水可防止紅細胞破裂B．豬成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核，提純時雜蛋白較少C．血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測D．在凝膠色譜法分離過程中，血紅蛋白比分子量較小的雜蛋白移動慢解析：豬的成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核，提純時雜蛋白較少，是提純血紅蛋白的理想材料。提純血紅蛋白分四步：紅細胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液、透析，其中洗滌紅細胞時，要用生理鹽水反復洗滌，既要將紅細胞洗滌干凈，又要不破壞紅細胞，然后再用蒸餾水和甲苯使紅細胞破裂，血紅蛋白是根據相對分子質量的大小來分離的，相對分子質量大的蛋白質移動速度較快。血紅蛋白的顏色可用于觀察紅色區(qū)帶的移動情況，據此判斷分離效果答案：D8．已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種蛋白質分子，其分子大小、電荷的性質和數量情況如圖所示，下列有關蛋白質分離的敘述正確的是()A．將樣品裝入透析袋中透析12h，若分子乙保留在袋內，則分子丙也保留在袋內B．若用凝膠色譜柱分離樣品中的蛋白質，則分子甲移動速度最快C．若將樣品以2000r/min的速度離心10min，分子戊存在于沉淀中，則分子甲也存在于沉淀中D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質分子，則分子甲和分子戊形成的電泳帶相距最遠解析：分子丙的相對分子質量大于分子乙，所以若分子乙保留在袋內，則丙也保留在袋內；甲相對分子質量最小，容易進入凝膠內部，則移動速度最慢；分子戊的相對分子質量大于甲，所以若分子戊存在于沉淀中，分子甲不一定存在于沉淀中；SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，蛋白質的遷移速度完全取決于分子的大小，因此，分子甲與丙形成的電泳帶相距最遠。答案：A9．(18分)蛋白質分子中，氨基酸的α－氨基和α－羧基雖然大部分都能結合形成肽鍵，但是蛋白質分子內仍含有各種酸性基團和堿性基團，如肽鏈末端的α－氨基和α－羧基、天冬氨酸和谷氨酸殘基中的羧基、賴氨酸和組氨酸殘基中的各種堿性基團，所以蛋白質是兩性電解質。在酸性溶液中，堿性基團的解離程度增大，使蛋白質帶正電荷；在堿性溶液中，酸性基團的解離程度加強，使蛋白質帶負電荷。當溶液到達某一pH時，蛋白質可因內部酸性或堿性基團的解離程度相等而呈等電狀態(tài)，這時溶液的pH叫做蛋白質的等電點。不處于等電點狀態(tài)的蛋白質分子的正、負電荷量是不相同的。試回答下列問題。(1)多數蛋白質的等電點近于5，一般含堿性基團較多的蛋白質的等電點________(“偏高”還是“偏低”)(2)根據等電點的不同，可用________方法將不同種類的蛋白質分子分開。(3)簡述根據等電點分離不同種類的蛋白質分子的原理。_________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)在血紅蛋白提取和分離實驗中，對分離得到的血紅蛋白溶液要進行透析，除去相對分子質量較小的雜質蛋白質。請利用所給的實驗材料對該透析實驗進行驗證。實驗目的：驗證透析的基本原理和操作。實驗原理：①_______________________________________________________________________；②_____________________________________________________________________。實驗材料：①透析管或透析袋②燒杯③玻璃棒④電磁攪拌器⑤試管及試管架實驗試劑：①1mL血紅蛋白溶液②300mL的物質的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液(pH為實驗步驟：①________________________________________________________________________________________________________________________________________________；②_____________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：含堿性基團較多的蛋白質溶液，在pH近于5時解離程度較大，蛋白質帶正電荷。要使蛋白質內部酸性和堿性基團解離程度相等，呈等電狀態(tài)，必須提高溶液的pH，使酸性基團解離程度增大，故蛋白質的等電點提高。根據等電點不同，可以利用電泳法將特定的蛋白質分離出來。透析是應用半透膜的選擇性，去除分子質量相對較小的雜質，從而達到對血紅蛋白的粗分離。答案：(1)偏高(2)電泳(3)調節(jié)電泳槽中緩沖液的pH，使某種蛋白質處于等電點狀態(tài)，而其他蛋白質帶有電荷，在電場作用下，帶有正、負電荷的蛋白質分別移向兩極，而不帶電荷的蛋白質留在原處。(4)實驗原理：①蛋白質是大分子物質，不能透過透析袋，而小分子物質可以自由透過②在分離提純蛋白質的過程中，常利用透析的方法使蛋白質與其中夾雜的小分子物質分開實驗步驟：①取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液的燒杯中②不斷更換燒杯中的緩沖液，并用電磁攪拌器不斷攪動緩沖液，以加速透析過程，透析12h題組51．利用凝膠色譜法先洗脫出來的蛋白質是()。A．相對分子質量大的 B．溶解度高的C．相對分子質量小的 D．所帶電荷多的解析相對分子質量較小的蛋白質能進入凝膠內部通道，路程較長，移動速度較慢；相對分子質量大的蛋白質，路程較短，移動速度較快，首先洗脫出來。答案A2．將經處理破裂后的紅細胞混合液以2000r/min的速度離心10min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是()。A．血紅蛋白、甲苯層、脂溶性物質層、沉淀層B．甲苯層、沉淀層、血紅蛋白、脂溶性物質層C．脂溶性物質層、血紅蛋白、甲苯層、沉淀層D．甲苯層、脂溶性物質層、血紅蛋白、沉淀層解析混合液經離心后，按密度大小排列，在離心管中從上到下的順序依次是：第1層為無色透明的甲苯層；第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質沉淀層；第3層為紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液；第4層為暗紅色沉淀物，主要是紅細胞破碎物沉淀。答案D3．下列關于電泳的說法不正確的是()。A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動C．蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少D．用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質的電泳遷移率完全取決于分子的大小解析蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。答案C4．已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種物質，其分子大小、電荷的性質和數量情況如下圖所示。下列敘述正確的是()。A．將樣品裝入透析袋中透析12h，若分子乙保留在袋內，則分子甲也保留在袋內B．若五種物質為蛋白質，則用凝膠色譜柱分離時，甲的移動速度最快C．將樣品以2000r/min的速度離心10min，若分子戊存在于沉淀中，則分子丙也存在于沉淀中D．若五種物質為蛋白質，用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質分子，則分子甲和分子戊形成的電泳帶相距最近解析透析的原理是相對分子質量小的物質能透過半透膜，相對分子質量大的物質不能透過，乙保留在袋內，甲則不一定保留在袋內；凝膠色譜柱分離時，相對分子質量小的物質路程長、移動慢；離心時相對分子質量大的物質先沉淀，戊沉淀，則乙、丁、丙均已沉淀；用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質時，電泳遷移率主要取決于分子大小。答案C5．下面說法不正確的是()。A．在一定范圍內，緩沖溶液能夠抵制外界的酸、堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變B．緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成C．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程D．透析袋能使大分子自由進出，而將小分子保留在袋內解析透析袋一般是用硝酸纖維素(又叫玻璃紙)制成的。透析袋能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內。透析可以除去樣品中相對分子質量較小的雜質。答案D6．(10分)血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，負責血液中O2或CO2的運輸。請根據血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。(1)將實驗流程補充完整：A為________，B為________。凝膠色譜法是根據______________________而達到蛋白質分離的有效方法。(2)洗滌紅細胞的目的是去除________，洗滌次數過少，無法除去________；離心速度過高和時間過長會使________一同沉淀，達不到分離的效果。洗滌干凈的標志是__________。釋放血紅蛋白的過程中起作用的是__________。(3)在洗脫過程中加入物質的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液(pH為的目的是__________________。如果紅色區(qū)帶__________，說明色譜柱制作成功。解析凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法，在蛋白質分離與提取過程中包括樣品的處理、粗分離、純化和純度鑒定四步，每一步均應用了不同的操作技術，需要注意。答案(1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫相對分子質量的大小(2)雜蛋白(血漿蛋白)血漿蛋白白細胞和淋巴細胞離心后的上清液中沒有黃色蒸餾水和甲苯(3)準確模擬生物體內的生理環(huán)境，保持體外的pH和體內一致均勻一致地移動7．(8分)蛋白質分子中，氨基酸的α-氨基和α-羧基雖然大部分結合成為肽鍵，但是蛋白質分子內仍含有各種酸性基團和堿性基團，如肽鏈末端的α-氨基和α-羧基、天冬氨酸和谷氨酸殘基中的羥基、賴氨酸和組氨酸殘基中的各種堿性基團，所以蛋白質是兩性電解質。在酸性溶液中，堿性基團的解離增大，使蛋白質帶正電荷；在堿性溶液中，酸性基團的解離加強，使蛋白質帶負電荷。當溶液到達某一pH時，蛋白質可因內部酸性和堿性基團的解離相等而呈等電狀態(tài)，這時的溶液pH叫做蛋白質的等電點。不處于等電點狀態(tài)的蛋白質分子的正、負電荷量是不相同的。試回答下列問題。(1)多數蛋白質的等電點近于5，一般含堿性基團較多的蛋白質的等電點________(填“偏高”或“偏低”)。(2)根據等電點的不同，你能用________方法將不同種類的蛋白質分子分開。(3)簡述根據等電點分離不同種類的蛋白質分子的原理。解析本題深入到蛋白質內部，從蛋白質分子帶電性質及數量的角度，引導學生理解電泳法分離蛋白質的原理。含堿性基團較多的蛋白質溶液，在pH近于5時解離程度較大，蛋白質帶正電荷。要使蛋白質內部酸性和堿性基團解離相等呈等電狀態(tài)，必須提高溶液的pH，使酸性基團解離增加，故蛋白質的等電點提高。根據等電點不同，可以利用電泳法將特定的蛋白質分離出來。答案(1)偏高(2)電泳(3)調節(jié)電泳槽中緩沖液的pH，使某種蛋白質處于等電點狀態(tài)，而其他蛋白質帶有電荷，在電場作用下，帶有正、負電荷的蛋白質分別移向兩極，而不帶電荷的蛋白質留在原處。8．(12分)凝膠色譜技術是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果，目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關領域廣泛應用，不但應用于科學實驗研究，而且已經大規(guī)模地用于工業(yè)生產。據圖回答下面的問題。(1)a、b均為蛋白質分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是______，原因是________________________。(2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結構可由________替代。(3)裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內不能有氣泡存在，原因是________________________。(4)洗脫用的液體應盡量與浸泡凝膠所用的液體______(填“相同”或“不同”)，洗脫時，對洗脫液的流速要求是________。解析用凝膠色譜法分離各種大分子物質時，大分子物質先洗脫出來，然后是小分子物質。大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠內，在向下移動的過程中，從一個凝膠顆粒內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質從而落后于大分子物質洗脫出來。在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以減少凝膠顆粒之間的空隙。在裝填凝膠色譜柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果；凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。答案(1)aa的相對分子質量大，無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快(2)尼龍網和尼龍紗(3)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果(4)相同保持穩(wěn)定題組61．使用凝膠色譜法分離蛋白質實驗中，相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的行進過程，可表示為下圖中()解析：凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。相對分子質量較小的蛋白質能進入凝膠內部通道，路程較長，移動速度較慢；相對分子質量大的蛋白質，路程較短，移動速度較快，首先洗脫出來。答案：B2．使用SDS—聚丙烯酰胺電泳的過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于()A．電荷的多少B．分子的大小C．肽鏈的多少D．分子形狀的差異解析：SDS能與各種蛋白質形成蛋白質SDS復合物，SDS所帶的負電荷量大大超過蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。答案：B3．在血紅蛋白的整個提取過程中，不斷用磷酸緩沖液處理的目的是()A．防止血紅蛋白被氧氣氧化B．血紅蛋白是一種堿性物質，需磷酸中和C．磷酸緩沖液會加速血紅蛋白的提取過程D．讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持其結構和性質解析：磷酸緩沖液的作用是穩(wěn)定pH，從而維持血紅蛋白的結構和性質。答案：D4．電泳過程中，什么樣的分子遷移速度最快？()A．纖維狀、大分子B．纖維狀、小分子C．球狀、大分子D．球狀、小分子答案：D5．用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是()A．相對分子質量較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B．相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C．相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D．二者根本無法比較答案：A6．蛋白質提取和分離分為哪幾步()A．樣品處理、凝膠色譜操作、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳B．樣品處理、凝膠色譜操作、純化C．樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D．樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定解析：蛋白質的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A中凝膠色譜操作及SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳為實驗操作過程中的技術。答案：C7．電泳技術可分離和分析氨基酸和核苷酸等有機物，下圖是把含有21個氨基酸的多肽進行水解，將氨基酸混合物進行電泳的結果。據圖分析該多肽由多少種氨基酸組成？()A．6B．4C．5D．3解析：電泳分離方法主要就是根據大分子的相對分子質量及電性差異將大分子在電場中彼此分離開來。由于組成多肽的氨基酸的相對分子質量、所帶電荷不同，會形成不同的電泳帶，而題圖顯示形成四條電泳帶，所以該多肽由四種不同氨基酸組成。答案：B8．在血紅蛋白的提取和分離實驗中，下列操作正確的是()A．分離紅細胞時需去除上層透明的黃色血漿B．紅細胞釋放出血紅蛋白時只需加入蒸餾水C．分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心D．洗脫時，待紅色蛋白質下移即開始收集流出液解析：分離紅細胞時要及時除去血漿蛋白。釋放紅細胞時需要加入蒸餾水和甲苯。分離血細胞時，要短時低速離心，即一般為500r/min，離心2min，否則白細胞會一同沉淀，達不到分離效果。分離血紅蛋白時要高速長時間離心，以2000r/min的速度離心10min。洗脫時待紅色的蛋白質接近色譜柱底端用試管收集流出液。答案：A9．以下關于豬血紅蛋白提純的描述，不正確的是()A．洗滌血紅細胞時，使用生理鹽水可以防止紅細胞破裂B．豬成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核，提純時雜蛋白較少C．血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測D．在凝膠色譜法分離過程中，血紅蛋白比分子量較小的雜蛋白移動慢解析：在凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質量較大的分子無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。所以血紅蛋白分子比相對分子質量較小的雜分子移動速度要快。答案：D10．分離血紅蛋白時，將攪拌好的混合液轉移到離心管中，以2000r/min的速度離心10min后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層。下列描述中，正確的是()A．第1層為無色透明的甲苯層B．第2層為紅色透明層，含血紅蛋白C．第4層為白色薄層固體，是脂溶性沉淀物D．第3層為暗紅色沉淀物，含未破裂的細胞解析：采集的血樣先經處理分離出紅細胞，然后在蒸餾水和甲苯的作用下，使紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血紅蛋白時，將攪拌好的混合液轉移到離心管中，以2000r/min的速度離心10min后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層：第1層為無色透明的甲苯層；第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層；第3層是紅色透明液體，是血紅蛋白的水溶液；第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性雜質沉淀層，于分液漏斗靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體即血紅蛋白溶液。答案：A11．下列試劑可用于血紅蛋白釋放的是()A．生理鹽水B．甲苯C．磷酸緩沖液D．蒸餾水解析：在蒸餾水中紅細胞吸水脹破，甲苯作為有機溶劑能夠溶解細胞膜，加速細胞的破裂。答案：BD12．用凝膠色譜法分離蛋白質時，分子量大的蛋白質()A．路程較長B．路程較短C．移動速度較慢D．移動速度較快解析：在小球體內部有許多貫穿的通道，當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。答案：BD13．紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成的。我們可以選用豬、牛、羊等動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關問題：(1)實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。①其中加入檸檬酸鈉的目的是__________________________________________________________。②此過程即是樣品處理，它應包括紅細胞洗滌、________________、分離血紅蛋白溶液。③洗滌紅細胞的目的是__________________________________________________________。解析：檸檬酸鈉是一種抗凝劑，加入檸檬酸鈉可以防止血液凝固；樣品處理包括紅細胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液；洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。答案：①防止血液凝固②血紅蛋白的釋放③去除雜蛋白(2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中透析，這就是樣品的粗分離。①透析的目的是__________________________________________________________。②透析的原理是________________________________________________________________________________________________________________。解析：透析袋一般是用硝酸纖維素制成的，透析袋能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內，透析可以去除樣品中分子量較小的雜質或用于更換樣品的緩沖液。答案：①去除相對分子質量較小的雜質②透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內(3)然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。其中通過凝膠色譜法將樣品純化的目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________解析：凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的方法，因此，通過用凝膠色譜法去除相對分子質量較大的雜質。答案：通過凝膠色譜法去除相對分子質量較大的雜質14．血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，負責血液中O2或CO2的運輸。請根據血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問題。(1)將實驗流程補充完整。(2)凝膠色譜法的基本原理是根據__________________分離蛋白質。(3)洗滌紅細胞的目的是去除________，洗滌干凈的標志是_____________________________________________________________________(4)分離血紅蛋白時，由上到下第________層是血紅蛋白水溶液。(5)下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的加入示意圖，正確的加樣順序是________。(6)如果紅色區(qū)帶________________，說明色譜柱制作成功。解析：(1)樣品處理包括：紅細胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液。凝膠色譜操作包括：凝膠色譜柱的制作、凝膠色譜柱的裝填、樣品的加入和洗脫。(2)凝膠色譜法的基本原理是根據相對分子質量的大小分離蛋白質。(3)洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，洗滌干凈的標志是上清液中沒有黃色。(4)分離血紅蛋白時，可明顯看到試管中的溶液分為4層：第一層為無色透明的甲苯層；第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層；第3層是紅色透明液體，是血紅蛋白的水溶液；第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。(5)加樣順序是：調整緩沖液面、滴加透析樣品、樣品滲入凝膠床、再調整緩沖液面。(6)如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。答案：(1)血紅蛋白的釋放凝膠色譜柱的裝填(2)相對分子質量的大小(3)雜蛋白(或血漿蛋白)離心后的上清液中沒有黃色(4)三(5)④①②③(6)均勻一致地移動題組71．凝膠色譜法是根據以下哪項分離蛋白質的()A．對凝膠的吸附性 B．相對分子質量的大小C．帶電荷的多少 D．溶解度解析：凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。答案：B2．(2011·廣東高考)以下關于豬血紅蛋白提純的描述，不正確的是()A．洗滌紅細胞時，使用生理鹽水可防止紅細胞破裂B．豬成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核，提純時雜蛋白較少[C．血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測D．在凝膠色譜法分離過程中，血紅蛋白比分子量較小的雜蛋白移動慢解析：相對分子質量越大的通過凝膠色譜柱的速度越快。答案：D3．下列關于蛋白質的提取與分離的敘述正確的是()A．在凝膠色譜柱內，分子質量較大的蛋白質路程較長，但移動速度較快B．從凝膠色譜柱中最后分離出來的是分子質量較小的蛋白質C．蛋白質的分離使用最多的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法D．分離血紅蛋白溶液時，離心管的第三層是脂類物質解析：在凝膠色譜柱內，分子質量大的蛋白質不能進入凝膠內，路程短，移動速度快，而分子質量小的蛋白質會進入凝膠內，路程長，移動速度慢，最后洗脫出來的是分子質量較小的蛋白質；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法是蛋白質純度鑒定使用最多的方法；分離血紅蛋白溶液時，離心管中將出現(xiàn)四層，其中第三層就是血紅蛋白溶液，而不是脂類物質。答案：B4．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中決定蛋白質或多肽移動速度的主要因素是()A．蛋白質分子所帶的電荷B．蛋白質分子的形狀C．蛋白質分子的相對分子質量D．緩沖溶液的pH解析：在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成單條肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白質-SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異，從而達到僅根據蛋白質相對分子質量的不同來分離蛋白質的目的。答案：C5．紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成的，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2或CO2。我們可以選用豬、牛、羊或其他哺乳動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關問題：(1)血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步：________、________、________和________。(2)實驗前取新鮮的血液，切記要在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，立即進行離心，收集血紅蛋白溶液。以上所述的過程即是樣品處理，它包括紅細胞的洗滌、________、收集血紅蛋白溶液。答案：(1)樣品處理粗分離純化純度鑒定(2)血紅蛋白的釋放1．下列有關“血紅蛋白的提取和分離”的相關敘述中，正確的是()A．用蒸餾水進行紅細胞的洗滌，其目的是去除細胞表面的雜蛋白B．將血紅蛋白溶液進行透析，其目的是去除相對分子質量較大的雜質C．血紅蛋白釋放時加入有機溶劑，其目的是使血紅蛋白溶于有機溶劑D．血紅蛋白的提取和分離一般分為樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定解析：A項是用生理鹽水洗滌；B項中的血紅蛋白質為大分