第二章 核酸的結(jié)構(gòu)與功能

第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能

概述：

1、核酸的發(fā)現(xiàn)及命名

核酸是脫氧核糖核酸（DNA）與核糖核酸（RNA）的通稱

2、核酸的分類、分布及生理功用

分類主要分布主要生理功用

DNA

細(xì)胞核遺傳信息的載體

RNA

細(xì)胞質(zhì)參與蛋白質(zhì)的生物合成3、核酸的水解核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解基本結(jié)構(gòu)單位*：核苷酸；基本組成成分*：磷酸、戊糖和堿基一、核酸的化學(xué)組成及特點(diǎn)組成核苷酸的元素：Ｃ，Ｈ，Ｏ，Ｎ，Ｐ與蛋白質(zhì)相比組成上的兩大特點(diǎn)：１核酸不含元素Ｓ，２核酸中Ｐ元素的含量多,且恒定（９％－１０％）

(可用于核酸含量測(cè)定)第一節(jié)核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)(H)OHHHOHOHHOCH2H1’2’3’4’5’OHRAN:-D-核糖DNA:-D-2-脫氧核糖.為區(qū)別堿基中的碳原子的編號(hào),戊糖中的碳原子標(biāo)以C-1’,C-2’...1.戊糖脫氧部位C-2’DNA比RNA穩(wěn)定!二、核酸分子中的基本組成成分2.堿基（base):嘌呤堿

(purine)鳥嘌呤(guanineG)腺嘌呤(adenineA)嘧啶堿(pyrimidine)胞嘧啶(cytosineC)尿嘧啶(uracilU)胸腺嘧啶(thymimeT)堿基都具有芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)特征（含共軛雙鍵）嘧啶環(huán)NN123456嘌呤環(huán)NNNN234986751

腺嘌呤(A)

鳥嘌呤(G)

NH2NNN

NAONNN

NGH2N

胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）胸腺嘧啶（T）NNONH2NNOONNOOCH3CUTRNADNA尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶C鳥嘌呤G腺嘌呤A小結(jié)：DNA、RNA基本組成的異同*

戊糖堿基磷酸

DNA

脫氧核糖

A、G、C、T

磷酸

RNA

核糖

A、G、C、U

磷酸

3、核苷（nucleoside)

1）核苷的定義：堿基與戊糖通過糖苷鍵相連而成的化合物。2）堿基與戊糖的連接部位：

3）分類：核糖核苷脫氧核糖核苷糖苷鍵4、核苷酸(nucleotide)

1）定義：核苷與磷酸通過酯鍵相連而成的化合物2）連接部位：戊糖的第五位碳上的羥基磷酸化3）分類：核糖核苷酸脫氧核糖核苷酸注：一磷酸核苷monophosphate(MP)

二磷酸核苷diphosphate(DP)

三磷酸核苷triphosphate(TP)核苷酸的結(jié)構(gòu)堿基連接（糖苷鍵）酯鍵（對(duì)DNA為H）1`2`3`4`5`

三、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)

1、定義：組成DNA（或RNA）的脫氧核苷酸（或核苷酸）的排列順序

2、連接鍵：3′5′---磷酸二酯鍵（多核苷酸鏈的方向：5′→3′）3、表達(dá)方式：結(jié)構(gòu)式線條式文字式15′端3′端CGAA

G

P5PT

PG

PC

PT

POH35

pApCpTpGpCpT-OH35

ACTGCT

3

第二節(jié)DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能一、DNA堿基組成的特點(diǎn)1、A+T/G+C的比值有物種特異性，且物種親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，差異越大；2、無組織器官特異性:不同組織器官中

的DNA堿基組成相同，而且不因年齡、環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)變化而改變；3、組成的規(guī)律性：DNA分子中四種堿基的摩爾百分比，即A=T、G=C、A+G=T+CDNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)二、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（B型）

1、反向平行的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺距為3.4nm，直徑為2.0nm。每圈10對(duì)堿基，存在大溝、小溝2、主鏈位于螺旋外側(cè)，堿基位于內(nèi)側(cè)。3、兩鏈間A與T互補(bǔ)形成兩個(gè)氫鍵，G與C互補(bǔ)形成三個(gè)氫鍵4、螺旋的穩(wěn)定因素為氫鍵和堿基堆砌力堿基互補(bǔ)配對(duì)

TAGCDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性超螺旋（原核生物）核小體（真核生物）三、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋分子在空間進(jìn)一步折疊或環(huán)繞成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，即DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)。（人體每個(gè)體細(xì)胞DNA長(zhǎng)2m,細(xì)胞直徑0.1mm,細(xì)胞核0.05mm）（一）DNA超螺旋

—原核生物DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)正超螺旋:盤旋方向與DNA雙螺旋方向相同負(fù)超螺旋：盤旋方向與DNA雙螺旋方向相反超螺旋核小體核心組蛋白H2A，H2B，H3，H4

各兩分子,146bpDNA纏繞----核心顆粒2.組蛋白H1+60bpDNA

----

連接區(qū)（二）DNA在真核細(xì)胞內(nèi)的組裝DNA四級(jí)結(jié)構(gòu)有人把染色體稱為DNA的四級(jí)結(jié)構(gòu)四、DNA的功能:基因：DNA分子中有功能的特定區(qū)段基因組：泛指一個(gè)有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。

DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。人類的遺傳物質(zhì)是DNA，它的總和就是人類基因組，由大約30億堿基對(duì)組成，分布在細(xì)胞核的23對(duì)染色體中。“人類基因組計(jì)劃”的核心，就是測(cè)定人類基因組的全部DNA序列人類基因組核基因組線粒體基因組

2-2.5萬個(gè)基因

37個(gè)基因4.6x109堿基對(duì)（bp）16.6x103堿基對(duì)雙鏈線狀雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)基因只占3%幾乎全是結(jié)構(gòu)基因基因組學(xué)(genomics)就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能?；蚪M學(xué)的概念:基因組學(xué)包括3個(gè)不同的亞領(lǐng)域

亞領(lǐng)域研究?jī)?nèi)容結(jié)構(gòu)基因組學(xué)整個(gè)基因組的遺傳制圖、物理制圖、DNA測(cè)序

功能基因組學(xué)認(rèn)識(shí)、分析整個(gè)基因組所包含的

基因、非基因序列及其功能比較基因組學(xué)比較不同物種的整個(gè)基因組，增

強(qiáng)對(duì)各個(gè)基因組功能及發(fā)育相

關(guān)性的認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）

1.轉(zhuǎn)錄組:是指轉(zhuǎn)錄后的所有mRNA的總稱。

2.研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的

類型與拷貝數(shù)。

3.與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。RNA的種類、分布、功能第三節(jié)RNA的空間結(jié)構(gòu)與功能

主要RNA的分類及功用

分類主要功用

mRNA蛋白質(zhì)生物合成的模板

tRNA

氨基酸的搬運(yùn)工具

rRNA

與蛋白結(jié)合成核蛋白體，為蛋白質(zhì)生物合成提供場(chǎng)所

RNA的總體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：以單鏈形式存在；局部可形成雙螺旋；堿基組成比例無規(guī)律性一、

信使RNA（

mRNA）蛋白質(zhì)合成的直接模板5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7GpppNm)3’端多聚A尾(AAA…A)mRNA前體

hnRNA（真核生物）成熟mRNA只有外顯子內(nèi)含子外顯子真核細(xì)胞mRNA原核生物的mRNA是多順反子：一條mRNA可編碼幾種蛋白質(zhì)。真核生物的mRNA是單順反子：一條mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)

真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1）mRNA含量少、更新快、分子大小不一

2)mRNA可形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。3)mRNA在真核生物中的初級(jí)產(chǎn)物稱為HnRNA

4)5’-端有7-甲基鳥苷三磷酸(m7GTP)的帽子結(jié)構(gòu)5)3’-端有多聚腺苷酸(PolyA)尾巴結(jié)構(gòu)

二、tRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1)分子最??；大小均一；含有稀有堿基最多

2)局部雙鏈形成莖-環(huán)樣結(jié)構(gòu)/發(fā)夾結(jié)構(gòu)

3)二級(jí)結(jié)構(gòu)：呈“三葉草”型。包括：氨基酸臂、DHU環(huán)、反密碼環(huán)、附加環(huán)、TψC環(huán)等

4）三級(jí)結(jié)構(gòu)：倒“L”型N,N二甲基鳥嘌呤N6-異戊烯腺嘌呤雙氫尿嘧啶4-巰尿嘧啶

稀有堿基

tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草形結(jié)構(gòu)反密碼子TψC環(huán)反密碼環(huán)DHU環(huán)氨基酸臂額外環(huán)*tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)——倒L形*tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白體成為蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所三、核蛋白體RNA（rRNA）：：大分子物質(zhì)在超速離心沉降中的一個(gè)物理學(xué)單位，反映分子質(zhì)量的大小S

小亞基大亞基原核生物70S含：30S50S真核生物80S含：40S60S

rRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1）rRNA是含量最多的RNA，占總量的80％。2）rRNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成核蛋白體（由大、小亞基組成）原核生物：5S,

16S,23S

小亞基含：16S

大亞基含：5S和23S真核生物：5S，5.8S，18S，28S

小亞基含：18S

大亞基含：5.8S，5S，28S

第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)、變性和復(fù)性及其應(yīng)用

一、核酸的一般理化性質(zhì)（一）為兩性電解質(zhì)；呈酸性；分子大，粘度高（二）紫外吸收特性：1、最大紫外吸收峰：260nm

2、產(chǎn)生原因：堿基中的共扼雙鍵3、應(yīng)用：定量分析；鑒定純度

A260=1.0相當(dāng)于:50ug/ml雙鏈DNA40ug/ml單鏈DNA或RNA20ug/ml寡核苷酸A260/A280=1.8（DNA純品）

=2.0（RNA純品）OD260的應(yīng)用*1.DNA或RNA的定量2.判斷核酸樣品的純度

三、核酸變性（DNA變性）1、定義：在理化因素作用下，DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開變成單鏈的過程。2、變性的因素：①高溫（常用）②強(qiáng)酸、強(qiáng)堿③有機(jī)溶劑等3、變性的實(shí)質(zhì)：氫鍵斷裂（磷酸二酯鍵完好）

4、主要性質(zhì)改變：

1)紫外吸收值增加-增色效應(yīng)

增色效應(yīng):指DNA變性后對(duì)260nm紫外光的光吸收度增加的現(xiàn)象。

2)旋光性下降3)粘度降低4)原有生物功能部分或全部喪失Tm解鏈溫度OD260TDNA熱變性曲線呈S型50％DNA變性四、DNA的熱變性1、定義：將DNA稀鹽溶液加熱使之變性的過程2、解鏈溫度Tm（meltingtemperature):使50%DNA分子變性的溫度----TmTm大小與其所含堿基中的G+C比例相關(guān)Tm=69.3+0.41(%G+C)Tm=4(G+C)+2(A+T)(用于小于20bp的寡核苷酸片段）此外,Tm大小還與核酸分子大小,溶液離子強(qiáng)度有關(guān)五、DNA復(fù)性/退火（annealing)復(fù)性：變性DNA在適當(dāng)條件下可重新配對(duì)，恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)像的現(xiàn)象。退火：熱變性的DNA隨著溫度的緩慢降低再重新形成雙螺旋的過程。復(fù)性過程：成核反應(yīng)→拉鏈反應(yīng)

DNA的變性與復(fù)性高溫變性緩慢冷卻急速冷卻熱復(fù)性復(fù)性失敗

七、核酸雜交(hybridization)

1、具有一定互補(bǔ)序列的多核苷酸鏈按堿基配對(duì)規(guī)則結(jié)合成異質(zhì)雙鏈的過程。

2、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：有互補(bǔ)序列

3、分類：

DNA-核酸探針—Southern雜交待測(cè)者

RNA-核酸探針—Northern雜交

選用已知順序片段作為探針，經(jīng)放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后，再與未知的目的核酸鏈進(jìn)行雜交反應(yīng)。通過標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)對(duì)未知的目的核酸鏈進(jìn)行定性、定量分析。放射性同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記的已知序列的核酸片段

探針的種類:

根據(jù)探針的來源及核酸性質(zhì)不同:可分為DNA探針、

cDNA探針、RNA探針及寡核苷酸探針等幾類。

根據(jù)標(biāo)記物的不同分為：

放射性探針：32p、35s、3H

非放射性探針:生物素、地高辛、熒光素

放射性探針：32p、35s、3H

優(yōu)點(diǎn)：靈敏性高、特異性高、方法簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：半衰期短，必須經(jīng)常標(biāo)記；費(fèi)用高；檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；放射性同位素對(duì)人體有害，實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境易被污染，放射性廢物處理困難。非放射性探針:生物素、地高辛、熒光素

優(yōu)點(diǎn)：1、無放射性污染；

2、穩(wěn)定性好；

3、探針可長(zhǎng)時(shí)間保存。缺點(diǎn)：靈敏度及特異性不高。

(一)Southern印跡雜交1、待測(cè)核酸樣品的制備（1）裂解或破碎細(xì)胞（2）抽取純化基因組DNA

（3）限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段2、待測(cè)DNA樣品的電泳分離（1）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠（2）凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子

DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快，大小相同的分子處于同一條帶

3、凝膠中核酸的變性（堿變性）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈

DNA。

4、Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程

（1）常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈、雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高

（2）印跡的常用方法

毛細(xì)管虹吸印跡法:

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。電轉(zhuǎn)移法:

利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。真空轉(zhuǎn)移法:

利用真空作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。

5、Southern雜交（1）預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn);

預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液（2）雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交;雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交（3）洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA。

6、雜交結(jié)果檢測(cè)

（1）放射自顯影：

適用于放射性核素標(biāo)記的探針

（2）比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針

Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)：

1、變性：RNA電泳前加熱變性