實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

生物選修（1）

生物技術(shù)實踐

IB模塊選修模塊設(shè)計的指導思想

“選修模塊是為了滿足學生多樣化發(fā)展的需要而設(shè)計的，有助于拓展學生的生物科技視野、增進學生對生物科技與社會關(guān)系的理解、提高學生的實踐和探究能力?！?/p>

課程設(shè)計思路中的表述

“選修1生物技術(shù)實踐”模塊重在培養(yǎng)學生設(shè)計實驗、動手操作、收集證據(jù)等科學探究的能力，增進學生對生物技術(shù)應(yīng)用的了解。本模塊適于繼續(xù)學習理工類專業(yè)或?qū)嶒灢僮鞲信d趣的學生學習。

生物技術(shù)概述1-1什么是生物技術(shù)1-2傳統(tǒng)生物技術(shù)1-3現(xiàn)代生物技術(shù)1-1什么是生物技術(shù)生物技術(shù)=生物工程應(yīng)用自然科學及工程學原理，以微生物體、動物體、植物體或其組成部分作為生物反應(yīng)器將物料進行加工，以提供產(chǎn)品來為社會服務(wù)的技術(shù)。1-2傳統(tǒng)生物技術(shù)傳統(tǒng)生物技術(shù)指主要通過微生物的發(fā)酵來生產(chǎn)商品.如:醬、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等1-3現(xiàn)代生物技術(shù)一般而言，現(xiàn)代生物技術(shù)可以分成以下五種：一、細胞工程二、發(fā)酵工程 三、蛋白質(zhì)工程四、酶工程五、基因工程

一、細胞工程

按照人們的需要和科學設(shè)計改變細胞的遺傳基礎(chǔ)，并通過細胞(組織)培養(yǎng)，細胞雜交(融合)，核移植和胚胎移植等技術(shù)，重組細胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。細胞工程包括動物細胞工程和植物細胞工程植物細胞工程:植物組織培養(yǎng)和植物細胞雜交動物細胞工程:細胞培養(yǎng)、細胞融合、胚胎移植、核移植、胚胎分割、干細胞等二、發(fā)酵工程

微生物的無氧呼吸叫發(fā)酵1.定義：利用DNA重組技術(shù)對不同生物的遺傳基因，根據(jù)人們的意愿，進行基因的切割、拼接及重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型。蛋白質(zhì)工程主要包括了解合成蛋白質(zhì)的DNA編碼序列、蛋白質(zhì)的分離純化、蛋白質(zhì)的序列分析和結(jié)構(gòu)功能分析、蛋白質(zhì)結(jié)晶和結(jié)構(gòu)力學分析等。三、蛋白質(zhì)工程

酶工程即利用基因工程等手段，改變酶或蛋白質(zhì)的折疊方式、空間結(jié)構(gòu)、催化活性和穩(wěn)定性等四、酶工程五、基因工程

1.定義：又叫DNA重組技術(shù)，即針對不同生物的遺傳基因，根據(jù)人們的意愿，進行基因的切割、拼接及重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型?；蚬こ痰臈l件（1）工具酶（2）基因的分離（3）基因的載體（4）受體

選修1需學習的實驗實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗4果汁中的果膠和果膠酶實驗5加酶洗衣粉的使用條件很效果實驗6α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測實驗8果酒及果醋的制作實驗10泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測定實驗11植物的組織培養(yǎng)實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第一部分:微生物的利用一、基礎(chǔ)知識1微生物2培養(yǎng)基3無菌技術(shù)二、實驗操作2微生物的接種技術(shù)1操作步驟微生物包括哪五類：病毒細菌和藍細菌放線菌真菌原生動植物特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小。通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu)。原核生物界原生生物界真菌界病毒界一基礎(chǔ)知識（一）微生物

1放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細胞原核分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素

微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的

應(yīng)用:2病毒的結(jié)構(gòu)2病毒

SARS病毒、禽流感病毒朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）病毒的增殖：3真菌如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母菌和霉菌青霉4細菌的外形與大小細菌：單細胞不分枝的原核微生物。細菌細胞微小而透明，通常用適當染料染色（革蘭氏染色）后顯微鏡觀察圖1-1常見的三種細菌典型形態(tài)A.球菌

B.桿菌C.弧菌細菌細胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、擬核，細胞質(zhì)中又有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等。細菌的構(gòu)造圖

細菌的結(jié)構(gòu)細胞膜擬核*細胞壁成分：肽聚糖細胞壁有哪些功能？①固定細胞外形；

②保護細胞免受外力的損傷；

③阻攔大分子物質(zhì)進人細胞；④使細胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細胞壁中含毒素芽孢有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌.菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細菌的菌落特征因種而異5細菌的營養(yǎng)物質(zhì)

碳源

氮源

水無機鹽生長因子即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶6細菌的營養(yǎng)類型根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌（autotroph）異養(yǎng)菌（heterotroph）腐生菌寄生菌大部分病原菌了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進行無菌技術(shù)的操作，進行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難點：三、技能目標：（二）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等，而液體培養(yǎng)基一般用于工業(yè)生產(chǎn)。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按化學成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長按物理狀態(tài)來分固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔按物理狀態(tài)來分半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)觀察細菌的運動、厭氧菌的分離和菌種鑒定按物理狀態(tài)來分選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導入了目的基因的受體細胞按功能來分鑒別培養(yǎng)基伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基按功能來分天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;天然培養(yǎng)基：按化學成分來分

根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。合成培養(yǎng)基:按化學成分來分血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分

人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。按化學成分來分3.培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質(zhì)一般營養(yǎng)物質(zhì)(1)水(2)碳源(3)氮源(4)無機鹽其他物質(zhì)pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。

2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方

.(2)碳源可作為碳源的物質(zhì)有:含碳無機物:、、含碳有機物：蛋白質(zhì)脂肪酸碳酸鹽碳酸氫鹽糖類（主要）葡萄糖乳糖二氧化碳不同微生物所利用的碳源不同異養(yǎng)型微生物的碳源為自養(yǎng)型微生物的碳源為含碳有機物（有機碳）含碳無機物（無機碳）(3)氮源可作為氮源的物質(zhì)有:含氮無機物：、、、含氮有機物：蛋白胨牛肉膏尿素固氮微生物所利用的氮源是氮氣氨氣硝酸鹽氨鹽氮氣3培養(yǎng)基配制原則：營養(yǎng)要協(xié)調(diào)目的要明確PH要適宜（三）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。從制備培養(yǎng)基到接種與培養(yǎng)等全部實驗過程要無菌操作

（１）消毒定義：利用化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。區(qū)分為高程度消毒（High-levelDisinfection）、中程度消毒（Intermediate-levelDisinfection）、低程度消毒（Low-levelDisinfection）三種方式。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

消毒1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min如牛奶的消毒3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(2)消毒的方法：滅菌概念：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼燒滅菌b

干熱滅菌c

高壓蒸汽滅菌灼燒滅菌微生物的接種工具(接種環(huán)、接種針)或其他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒注意適用范圍干熱滅菌

160－170℃；1－2h能耐高溫的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)高壓蒸汽滅菌100kPa121℃15-30min通常用于培養(yǎng)基的滅菌

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計的。

大腸桿菌的培養(yǎng)和分離菌種保存培養(yǎng)基的配制滅菌超凈工件臺倒平板接種液體培養(yǎng)劃線分離培養(yǎng)3.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手

答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考二、實驗操作1制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基2純化大腸桿菌3將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h和24h后，觀察并記錄二、實驗操作

1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟8．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。倒平板技術(shù)1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。2、純化大腸桿菌接種方法有：劃線分離法和涂布分離法劃線分離法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。涂布分離法純種的菌種稀釋一般采取最簡單常規(guī)的稀釋涂布平板法。將菌種用接種環(huán)蘸取，放入培養(yǎng)液內(nèi)進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)即可。

涂布分離法(1)系列稀釋操作:涂布平板操作接種微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣?！镜淅馕觥坷?．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于