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文檔簡介

第5章植物的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握植物組織培養(yǎng)基(MS)的配制(MurashigeandSkoog)

2.通過實(shí)驗(yàn),掌握無菌操作方法,熟悉煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立的整個過程。3.學(xué)習(xí)再生體系的建立方法,為掌握其他植物的組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ);同時為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供一個平臺。植物組織培養(yǎng)基的配制煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立實(shí)驗(yàn)用品:1.儀器和用品:500ml試劑瓶1個;100ml試劑瓶5個;250ml試劑瓶4個;高壓滅菌鍋;電子天平;燒杯(大、中、小各2個)、玻璃棒、移液管、搪瓷缸、培養(yǎng)瓶、電爐、pH計(jì)或精密pH試紙、容量瓶(大、中、小各1個)2.化學(xué)藥品及試劑漢語名分子式生產(chǎn)公司分子量純度硝酸銨NH4NO3上海通亞精細(xì)化工廠80.04分析純磷酸二氫鉀KH2PO4中國江蘇南京中山集團(tuán)公司化工廠136.09硝酸鉀KNO3上海鑫達(dá)精細(xì)化工有限公司101.10硫酸鎂MgSO4.7H2O山東省化工研究院246.47氯化鈣CaCl2.2H2O(上海)四聯(lián)化工廠147.03

硫酸錳MnSO4.4H2O上海試劑工廠169.02硫酸鋅ZnSO4.7H2O山東濰坊市試劑廠287.54硼酸H3BO3濟(jì)南化學(xué)試劑廠61.83碘化鉀KI上?;瘜W(xué)采購站166.064鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O北京五十六0一化工廠241.95分析純氯化鈣CaCl2.6H2O濟(jì)南試劑總廠237.93五水硫酸銅CuSO4.5H2O濟(jì)南化學(xué)試劑廠249.68

漢語名分子式生產(chǎn)公司分子量純度乙二胺四乙酸鈉Na2-EDTA.2H2O濟(jì)南試劑總廠372.24分析純硫酸亞鐵FeSO4.7H2O山東博山化學(xué)試劑廠278.01分析純

甘氨酸C2H5NO2中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所75.07分析純鹽酸吡哆醇C8H11O3N.HCl中國醫(yī)藥上?;瘜W(xué)試劑站205.64鹽酸硫胺素C12H17ClH4OS.HCl中國新興化工試劑研究所337.27煙酸C6H5NO2北京芳草醫(yī)藥化工研制公司123.11化學(xué)純肌醇C6H12O6中國政翔化學(xué)試劑研究所180.16

3-吲哚乙酸IAA(b-Indoleaceticacid)天津天泰精細(xì)化工品有限公司125.1分析純萘乙酸NAAC12H10O2中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司186.21化學(xué)純?nèi)~酸C19H19O6N7上?;瘜W(xué)試劑廠441.422,4-D(2,4-dichlorophenoxyaceticacid)上海雪滿生物科技有限公司6-BA(N6-benzylaminopurine)上海伯奧生物科技有限公司225.25蔗糖sucrose天津市廣成化學(xué)試劑有限公司342.29分析純瓊脂Agar國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司B.RMS培養(yǎng)基配制表母液化合物含量(終濃度)mg/L母液稱量(mg)配制量(ml)吸取量(ml/L)1號NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500(擴(kuò)大20倍)502號CaCl24404400同上503號ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500(擴(kuò)大100倍)104號Na2-EDTAFeSO4.7H2O37.327.8746556100(擴(kuò)大200倍)55號VB1VB6甘氨酸煙酸(VB3)0.40.520.5202510025500(擴(kuò)大100倍)106號肌醇1001000100107蔗糖3%30g8瓊脂0.6%-1.2%8g

MS母液配制用量g.L-1每升培養(yǎng)基取用量mL/L大量元素(20倍)KNO338

NH4NO33350MgSO4·7H2O7.4KH2PO43.4CaCl·2H2O8.8微量元素(200倍)MnSO4·4H2O4.465ZnSO4·7H2O1.72H3BO31.24KI0.166NaMoO4·2H2O0.05CuSO4·5H2O0.005CoCl·6H2O0.005鐵鹽Na2-EDTA·2H2O7.465FeSO4·7H2O5.56有機(jī)附加物(200倍)甘氨酸(氨基乙酸)0.25VB60.05VB10.01煙酸0.05肌醇0.01生長素類在組培中的作用:誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。常用種類及作用:IAA(吲哚乙酸)、NAA、IBA、NOA(萘氧乙酸)、2.4-D、2.4.5-T(三氯苯氧乙酸)使用時先配成母液,母液的濃度一般為0.1mg/ml或1mg/ml;配時一般先將其粉末溶于95%乙醇或0.1mol/L的NaOH中,再定容。細(xì)胞分裂素類在組培中的作用:促進(jìn)細(xì)胞分裂和由callus或器官上分化不定芽。常用種類及作用:BAP(芐氨基嘌呤)、6-BA(芐基腺嘌呤),zip(異戊烯氨基嘌呤)和KN(激動素)使用時先配成母液,母液的濃度一般為0.1mg/ml或1mg/ml;配時一般溶于0.5或1mol/L的HCl或稀薄的NaOH中,再定容。實(shí)驗(yàn)步驟:1.母液的配制:見MS培養(yǎng)基配制表2.培養(yǎng)基的配制:1)稱取一定量的蔗糖,溶解于適量蒸餾水中(不能太多),倒入500ml容量瓶中。2)吸取各種母液(吸取量根據(jù)培養(yǎng)基的最終體積決定),加入到上述容量瓶中。3)吸取各種激素(所配制的培養(yǎng)基是:MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L),加入到上述容量瓶中。4)定容到500ml。5)將上述溶液調(diào)pH值到5.8-6.0。6)將上述溶液加入瓊脂后,于電爐上煮沸。7)將上述培養(yǎng)基冷卻至40-50攝氏度后,將其分裝到100ml三角瓶中。8)將三角瓶用封口膜封口。并對不同的培養(yǎng)基做好標(biāo)記。3.滅菌:通常培養(yǎng)基應(yīng)在汽相121攝氏度的條件下在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20min。在高壓滅菌鍋的加熱過程中,在氣壓指針上升到0.05Mpa時,放一次氣,然后在溫度達(dá)121攝氏度時,保持此壓力滅菌15-20min。滅菌完成后,待滅菌鍋的壓力降到0時,打開滅菌鍋,取出培養(yǎng)基,放平,待培養(yǎng)基凝固后備用。注意事項(xiàng):1.實(shí)驗(yàn)中所用的各種容器一定要洗凈、烘干。2.用電子天平稱量藥品時,一定要用稱量紙,對于有腐蝕性的藥品,應(yīng)將其放在小燒杯中稱量。3.各種母液應(yīng)保存在2-4攝氏度的冰箱中,以免變質(zhì)、長霉。4.用高壓滅菌鍋時,一定要先檢查一下其中的水是否合適。接種:在無菌的條件下,取煙草無菌苗的葉片,剪成(0.5~1cm)*(0.5~1cm)大小的小塊,接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L中誘導(dǎo)愈傷組織,在此培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出愈傷組織并能夠誘導(dǎo)出不定芽。不定芽生根:將在愈傷組織中生成的不定芽移栽到1/2MS培養(yǎng)基中,其目的是誘導(dǎo)不定芽生根,使其發(fā)育成煙草小植株。植物材料滅菌的常用藥品和原理1.乙醇:原理:脫水作用和溶脂性,從而使Protein脫水、變性、沉淀及質(zhì)膜破損、透性增加,使微生物致死。使用濃度:70%(V/V)滅菌時間:5-60s2.次氯酸鹽:原理:在水中形成次亞氯酸(HClO),HClO分解后形成鹽酸和新生態(tài)氧(HClO→HCl+〔O-〕),〔O-〕具有很強(qiáng)的氧化性而具有殺菌作用。使用濃度:0.5%-2.5%的有效氯滅菌時間:5-15min3.升汞(HgCl2):原理:汞離子可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,使菌體蛋白變性,酶失活。其殺菌效力極強(qiáng)。使用濃度:0.1-0.2%(W/V)滅菌時間:10min4.新潔爾滅:原理:廣譜表面活性滅菌劑。使用濃度:1:200(V/V)滅菌時間:30min或更長

接種第一天

接種第二

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