檢本熒光免疫技術

熒光免疫技術教學目的要求：掌握免疫熒光顯微鏡技術掌握時間分辨熒光免疫技術了解熒光免疫測定的臨床應用1、概述

熒光免疫技術是將抗原抗體反應的特異性與熒光技術的敏感性結(jié)合起來的一種方法，是免疫標記技術中發(fā)展最早的一種檢測方法。

近年來，隨著科學技術的發(fā)展，一系列新的儀器和技術問世，使熒光技術不斷完善，已從原來僅限于檢測固定標本，如檢測組織切片或細胞表面的抗原，擴大到進行活細胞分類檢測及多種成分定量檢測。熒光技術已被廣泛應用于臨床檢測和科學研究。2、技術分類：⑴熒光抗體技術(熒光顯微鏡技術)

抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。⑵免疫熒光測定技術：抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法第一節(jié)熒光免疫技術的特點熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光（fluorescence）。一、熒光的基本知識（一）發(fā)射光譜指固定激發(fā)波長，在不同波長下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的相對強度。（二）激發(fā)光譜指固定檢測發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到的相應的熒光發(fā)射強度。（三）熒光的效率：熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率熒光效率﹦發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）（四）熒光壽命熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。（五）熒光的淬滅

熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退成為熒光淬滅。例如紫外線照射、高溫、苯胺、硝基苯、酚、I-等。（六）熒光偏振二、熒光物質(zhì)第二節(jié)熒光抗體的制備一、抗體要求二、熒光素要求三、熒光素標記抗體的方法四、熒光素標記抗體的純化五、熒光抗體的鑒定六、熒光抗體的保存第三節(jié)免疫熒光顯微技術免疫熒光顯微技術的基本原理是：熒光抗體可與標本切片中組織或細胞表面的抗原結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光，即可對標本中的抗原物質(zhì)進行鑒定。一、標本的制作熒光顯微技術主要是靠觀察切片標本上熒光抗體的染色結(jié)果來對抗原進行鑒定和定位。因此，標本制作的好壞直接影響到檢測結(jié)果。常見的臨床標本有：組織、細胞和細菌三大類，可分別制成切片、印片和涂片。組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織

涂片：各種體液、穿刺液、細菌培養(yǎng)物和細胞懸液培養(yǎng)細胞：單層培養(yǎng)細胞（人喉癌上皮細胞HEP-2)標本的固定和保存：固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20℃二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷于已固定的標本上滴加經(jīng)適當稀釋的熒光抗體置25-37℃

30min或4℃過夜用PBS充分洗滌鏡檢。試驗類型

1直接法

2間接法

3雙標記法兩種熒光素分別標記的兩種不同的特異性抗體，與同一標本反應，熒光顯微鏡觀察兩種顏色。返回熒光抗體染色結(jié)果判斷

設立實驗對照:陽性對照和陰性對照

區(qū)分特異和非特異染色

陽性細胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型

抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(斑點型)抗核抗體(核膜型)

“-”：無或僅見極微弱熒光。

“+”：熒光較弱但清楚可見。“++”：熒光明亮。“+++”：耀眼強熒光。特異熒光強度“+”以上判定為陽性，對照光應呈“-”或“±”。根據(jù)呈"+"的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。

三、熒光顯微鏡檢查

利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

經(jīng)熒光抗體染色的標本，需要在熒光微鏡下觀察。一般要求染色后立刻鏡檢，以防熒光消褪，造成假陰性結(jié)果。

熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素燈濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護眼睛。返回透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)透射光：照明光線從標本下經(jīng)聚光器透過標本進入物鏡。落射光：照明光線從標本上經(jīng)垂直照明器落射到標本，經(jīng)標本反射進入物鏡?；驹恚簩⒖乖贵w反應與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復合物中特異性熒光強度，對液體標本中微量或超微量物質(zhì)進行定量測定。第四節(jié)熒光免疫分析熒光免疫測定的方法類型非均相熒光免疫測定：

時間分辨熒光免疫測定、熒光酶免疫測定均相熒光免疫測定：

熒光偏振免疫測定時間分辨熒光免疫測定(TR-FIA)基本原理：是用鑭系稀土元素螯合物（如Eu3+）標記抗體或抗原，檢測標本中的抗原或抗體。此螯合物具有較長熒光壽命，得用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間，可排除標本中非特異性熒光的干擾，所得信號完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒光。時間分辨檢測原理示意圖自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖方法評價和臨床應用靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L標記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化易受污染，本底增高因此,是很有發(fā)展前途的超微量物質(zhì)免疫分析技術。第五節(jié)熒光免疫技術的應用

熒光抗體技術在臨床上可用作腫瘤細胞的診斷；細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的協(xié)助診斷等方面。一、熒光顯微鏡技術的應用二、熒光免疫測定的應用思考題1．熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是什么？2．常用的熒光物質(zhì)有哪些？3．熒光免疫技術有哪些類型？4．熒光抗體技術的基本原理是什么？3．什么是熒光抗體？如何制備、純化和鑒定熒光抗體？4．熒光抗體染色有哪些方法？各自的反應原理是什么？5．熒光免疫測定的基本原理是什么？有哪些方法類型?課堂練習1、用于標記熒光抗體的熒光素應符合下列要求，除外A與蛋白質(zhì)分子形成離子鍵B熒光效率高，與蛋白結(jié)合后仍能保持較高的熒光效率C熒光色澤與背景組織色澤對比鮮明D與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化和免疫學性質(zhì)E標記方法簡單，安全無毒（A）2、熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)中，與普通光學顯微鏡相同的是A光源B濾板C聚光器D目鏡E物鏡（D）3、不能作為熒光顯微鏡光源的是A高壓汞燈B氚燈C紫外燈D氙燈E鹵素燈（C）4、熒光抗體染色技術中，特異性最高，非特異性染色最低的方法是A直接法B間接法C補體結(jié)合法D雙標記法E以上都不對(A)5、目前公認的最有效的檢測抗核抗體的方法是AELISAB放射免疫技術C直接凝集實驗D直接熒光法E間接熒光法(E)6、FITC在紫外光的激發(fā)下，所產(chǎn)生的熒光為A灰藍色B黃綠色C橙色D暗紅色E橙紅色（B）7、雙標記熒光抗體技術的主要用途是A提高熒光強度B提高熒光效率C可同時檢測同一標本中兩種抗原D使用一種標記物可檢測多種抗原E減少非特異性熒光（C）8、時間分辨熒光免疫測定特點中不包括A標記物熒光衰變時間長B測定范圍狹窄C標記物為鑭系元素D能排除非特異性熒光的干擾E熒光強，靈敏度高（B）9、下列有關時間分辨熒光免疫測定的敘述中，錯誤的是