實(shí)驗(yàn)高效液相色譜法

實(shí)驗(yàn)高效液相色譜法第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.掌握高效液相色譜法測定飲料中糖精鈉、苯甲酸和山梨酸的原理和方法

2.熟悉高效液相色譜儀的使用方法

3.了解高效液相色譜儀的儀器結(jié)構(gòu)[目的與要求]第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日[方法原理]

在適宜的條件下,高效液相色譜可同時(shí)分離飲料中的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸。樣品超聲除去二氧化碳和乙醇,調(diào)pH至近中性,過濾后進(jìn)高效液相色譜儀,經(jīng)反相C18液相色譜分離后,紫外檢測器230nm波長處檢測。

以色譜峰的保留時(shí)間定性,利用色譜峰面積在一定范圍內(nèi)與濃度呈線性關(guān)系進(jìn)行定量第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.儀器:

高效液相色譜儀,配備二極管陣列檢測器;

超聲波清洗儀;50ml容量瓶;50ml燒杯;50μl微量進(jìn)樣器[儀器與試劑]第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日

糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(10.0mg/ml):

準(zhǔn)確稱取于120℃烘干4h后的糖精鈉(C6H4CONNaSO2·2H2O)0.5000g,加水溶解后定容至50ml

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.0mg/ml):

準(zhǔn)確稱取0.2500g,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶解,

定容至50ml

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.0mg/ml):

準(zhǔn)確稱取0.2500g山梨酸,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶解,定容至50ml

標(biāo)準(zhǔn)混合使用液

(含糖精鈉1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液5.0ml,加水定容至50ml2.試劑:

稀氨水(1+1);碳酸氫鈉溶液:20g/L;甲醇(色譜純)第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日2.配制標(biāo)準(zhǔn)系列:

取9只50ml容量瓶分別編上號碼,按下表配制標(biāo)準(zhǔn)系列。

編號012345標(biāo)混液(ml)0.001.252.551020蒸餾水(ml)50.048.7547.5454030第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日標(biāo)混號苯甲酸(mg/mL)A苯甲酸山梨酸(mg/mL)A山梨酸糖精鈉(mg/mL)A糖精鈉000000010.01254380870.01257343030.02554975620.0258530790.02514735790.05112703330.0516729440.0529072820.1224629940.133921910.159096180.2459902550.267411970.2117674600.49167288

混合標(biāo)樣中各物質(zhì)的濃度第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日樣品苯甲酸山梨酸糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=3×107X-55.2Y=6×107X-37513Y=2×107X-53409r111線性范圍(mg/mL)0～0.20～0.20～0.4第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.樣品處理:吸取10.00～20.00ml汽水,放入50ml燒杯中,超聲除去二氧化碳,用稀氨水調(diào)pH7.0,加水定容至50ml,用濾膜(0.45μm)過濾,備用。[操作步驟]第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.插好電極,打開電源開關(guān),按模式鍵切換到pH測量狀態(tài)2.用兩點(diǎn)法進(jìn)行校正(b=2)(pH4.01,6.86,9.18)3.按模式進(jìn)入b=24.將電極浸入標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中(pH=6.86),按“校正”,當(dāng)?shù)竭_(dá)終點(diǎn)時(shí)顯示屏上顯示相應(yīng)校正結(jié)果;將電極放入第二種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH=4.01或9.18),按“校正”,當(dāng)?shù)竭_(dá)終點(diǎn)時(shí)顯示屏上顯示相應(yīng)校正結(jié)果;按“讀數(shù)”,保存校正結(jié)果并退回到正常的測量狀態(tài)5.將電極插入到被測液中,調(diào)節(jié)pH到所需值pH計(jì)的使用第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日(1)過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。前處理濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水溶劑尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日3.測定色譜條件:

色譜柱:C18,4.6mm×150mm;流動(dòng)相:

甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(5+95);流速:1ml/min檢測波長:230nm

取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各10μl注入高效液相色譜儀進(jìn)行分離,以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間為依據(jù)進(jìn)行定性。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(或計(jì)算回歸方程),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出(或根據(jù)回歸方程求出)樣液中被測物質(zhì)的含量,按下式計(jì)算:第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日式中:Cx為樣品中被測物的含量,g/kgC為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的相對應(yīng)的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/mlV0為樣品定容體積,mlV為取樣體積,ml第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日[思考題]1.為什么被測溶液需要除去二氧化碳?2.采用230nm為測定波長,對樣品中山梨酸的測定有何影響？第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日[注意事項(xiàng)]1.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)過脫氣。如果流動(dòng)相中含有氣體,在較高的柱壓下會(huì)產(chǎn)生氣泡,使流動(dòng)相流動(dòng)受阻,對分離樣品產(chǎn)生不利影響2.應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整和最后確定流動(dòng)相實(shí)際配比,以使各分析組分的分離效果最佳3.被測溶液pH值對測定和色譜柱使用壽命均有影響,以中性為宜4.苯甲酸、糖精鈉的靈敏波長為230nm,山梨酸靈敏波長為254nm,在此波長測定時(shí)苯甲酸和糖精鈉的靈敏度較低,因此采用230nm為測定波長第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日(2)脫氣：

除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積

2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)A.示差折射率檢測器*使折射率變化B.UV檢測器（200nm以下）*溶解氧氣有吸收C.熒光檢測器*溶解氧氣有消光作用第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日1.吸氣器法（流動(dòng)相抽濾）

*可以抑制制做流動(dòng)相時(shí)產(chǎn)生的氣泡

*只是暫時(shí)的脫氣法

*不能解決因溶解氣體造成的問題2.超聲脫氣法3.使用氟樹脂膜的減壓脫氣法溶劑前處理-脫氣第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日★使用超聲波震蕩器，一般超聲震蕩15分鐘左右★注意流動(dòng)相在超聲震蕩脫氣過程中，溫度會(huì)升高，應(yīng)待其降至室溫后再上機(jī)使用?！镉捎谝后w對氣體的溶解作用，時(shí)間長后氣體會(huì)再溶入流動(dòng)相中，應(yīng)引起注意。溶劑前處理-脫氣第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日溶劑前處理-脫氣使用氟樹脂膜的減壓脫氣法氟樹脂膜真空室真空泵流動(dòng)相往送液泵第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日緩沖液的使用使用前必須過濾使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:

用含5%甲醇的水溶液沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min用純水沖洗泵頭清洗管路易受到細(xì)菌和霉菌的影響不能直接用有機(jī)溶劑沖洗緩沖鹽溶液緩沖液第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日流動(dòng)相的更換不互溶的流動(dòng)相不能直接更換緩沖鹽不能直接用有機(jī)溶劑更換水正己烷異丙醇緩沖鹽有機(jī)溶劑水第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日液相色譜簡易流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理廢液第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日液相系統(tǒng)維護(hù)流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器手動(dòng)進(jìn)樣器檢測器色譜柱第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日泵工作示意圖

凸輪柱塞桿柱塞密封圈單向閥

泵頭流動(dòng)相入口流動(dòng)相出口第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日LC-20AT串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵LC-20AD并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵柱塞泵的基本結(jié)構(gòu)LC-10ATvp

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單向閥單向閥單向閥1_at.flv1_ad.flv第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日單向閥單向閥結(jié)構(gòu)球座吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭拋光面寶石球流動(dòng)相單向閥工作原理第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日單向閥結(jié)構(gòu)請不要分解閥心A和閥心B重新組裝后性能不被保證，輸液可能不穩(wěn)定注意：第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日線路過濾器故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力偏高措施：異丙醇（或5％稀硝酸），超聲波清洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力>0.5MPa，則堵塞。排液閥壓力傳感器線路過濾器流動(dòng)相線路