實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒酶切質(zhì)粒限制性?xún)?nèi)切酶消化酶切

實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒酶切質(zhì)粒限制性?xún)?nèi)切酶消化酶切第一頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日背景知識(shí)一、質(zhì)粒圖譜的閱讀二、限制性?xún)?nèi)切酶第二頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日

第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類(lèi)型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）

第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。

Ampr水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

tetr可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

camr生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。

neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活

hygr

使潮霉素β失活。一、質(zhì)粒圖譜的閱讀第三頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。

一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即：?jiǎn)?dòng)子——核糖體結(jié)合位點(diǎn)——克隆位點(diǎn)——轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。

這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體的。克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。第四頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日農(nóng)桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)加尾信號(hào)，終止位點(diǎn)潮霉素抗性基因多克隆位點(diǎn)終止子加尾信號(hào)綠色熒光蛋白基因第五頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日二、限制性?xún)?nèi)切酶1)概念2)命名原則3)類(lèi)型4)基本特性及用途5)影響核酸限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素6)Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)第六頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日1)概念限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionednonuclease)是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶（endonuclease)的總稱(chēng)。

至2006年2月共發(fā)現(xiàn)3773種限制性?xún)?nèi)切酶，I、II、III型各有68、3692、10種，甲基化指導(dǎo)的3種，商品化的609種，II型中共有223種特異性。第七頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日2)命名原則1973年和D.Nathams首次提出命名原則，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)分類(lèi)①限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母（大寫(xiě)，斜體）代表該酶的宿主菌屬名(genus)；第二、三個(gè)字母(小寫(xiě)，斜體)代表宿主菌種名(species)。②第四個(gè)字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。

屬名種名株系Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶第八頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日3)類(lèi)型

據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三類(lèi)。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)應(yīng)用多功能異源三聚體ATP、Mg2+、SAM距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割不常用單功能同源三聚體Mg2+

4~6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割常用雙功能異源二聚體ATP、Mg2+距識(shí)別序列下游24~26bp處隨機(jī)性切割數(shù)量很少，無(wú)實(shí)際作用第九頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日4)基本特性及用途

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5′端為P，3′端為OH，識(shí)別序列一般為4～6個(gè)堿基對(duì)，通常是反轉(zhuǎn)錄重復(fù)順序，具有180°的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)性即迴文結(jié)構(gòu)。Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口。5′粘性末端3種切口3′粘性末端平頭末端第十頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日第十一頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日第十二頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日第十三頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途

①在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構(gòu)建基因文庫(kù)。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質(zhì)粒。第十四頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日5)影響核酸限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素

①DNA樣品純度②DNA樣品甲基化程度③酶的星活性(staractivity)第十五頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日①DNA樣品純度

A）樣品雜有RNA

雖不影響酶反應(yīng)速度，但RNA很易與酶蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾DNA片段電泳觀(guān)察。

B）少量的蛋白質(zhì)污染對(duì)酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質(zhì)污染時(shí)，會(huì)干擾酶切反應(yīng)，并影響酶解產(chǎn)物。

C）樣品中雜有其他DNA

如質(zhì)粒DNA中雜有染色體DNA，雖不影響酶解作用，但干擾酶解產(chǎn)物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應(yīng)。

D）其他雜質(zhì)如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，會(huì)影響酶切速度，甚至改變酶的識(shí)別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。第十六頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日②DNA樣品甲基化程度

限制性?xún)?nèi)切核酸酶的識(shí)別序列若被修飾酶產(chǎn)生了修飾反應(yīng)，則該DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，DNA甲基化現(xiàn)象廣泛的存在于原核和真核生物中。如：AccⅠ識(shí)別序列能切割不能切割注意此處的區(qū)別dam甲基化酶識(shí)別序列AccⅠTCCGGAGAT×CCGG6mATC采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來(lái)制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。第十七頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日③酶的星活性(staractivity)

又稱(chēng)第二活力，是指改變了酶切反應(yīng)條件后特異序列識(shí)別特性降低的一種現(xiàn)象。由于識(shí)別特異性的降低，可能對(duì)原識(shí)別序列相似的序列也產(chǎn)生切割反應(yīng)。高濃度甘油、高pH、低離子強(qiáng)度、巰基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能導(dǎo)致酶產(chǎn)生星活性。第十八頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日6)Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)

①商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)使用新的吸頭去取酶；加入酶的體積應(yīng)不超過(guò)總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過(guò)5%時(shí)酶易產(chǎn)生星活性。②整個(gè)操作應(yīng)在0℃進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。③當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采用延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，減少酶的用量。④當(dāng)DNA需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液；若沒(méi)有通用緩沖液時(shí)，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng)。第十九頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康模保┝私饷盖性?，掌握酶切體系建立原則２）用EcoRⅤ

切割質(zhì)粒pCAMBIA13023）用EcoRⅤ切割銀杏基因組DNA第二十頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。第二十一頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日

限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅤ特異性識(shí)別位點(diǎn)為：

GATATCCTATAGGATATCCTATAG產(chǎn)生平末端：第二十二頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日

則pCAMBIA1302經(jīng)EcoRⅤ酶切后產(chǎn)生大小分別為：1600bp、2624bp和6325bp的三條DNA片段第二十三頁(yè)，共二十六頁(yè)，2022年，8月28日

基因組DNA中由于有較多的EcoRⅤ識(shí)別位點(diǎn)，因此，經(jīng)EcoRⅤ酶切后產(chǎn)生大小不一的條帶，電泳后整個(gè)泳道呈現(xiàn)均一的亮帶。