實(shí)驗(yàn)四濃度測(cè)定及酶切

實(shí)驗(yàn)四濃度測(cè)定及酶切第一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日1、學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測(cè)定DNA溶液濃度和純度的原理和方法2、學(xué)習(xí)利用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA濃度的方法3、學(xué)習(xí)利用限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA的方法，并通過(guò)電泳檢測(cè)酶切的效果，為以后的連接作準(zhǔn)備。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡诙?yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日DNA的吸收光譜峰在260nm處，測(cè)定此波長(zhǎng)下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時(shí)，雙鏈DNA含量約為50g/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處，在測(cè)定DNA含量時(shí)，還常計(jì)算OD260/OD280之值，如該值為時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)含雜質(zhì)較多，可能影響酶切反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)I型、II型和III三類(lèi)不同的限制性?xún)?nèi)切酶，其中II型能專(zhuān)一識(shí)別堿基順序，并在該處切斷雙鏈DNA，因而在基因工程中得到廣泛應(yīng)用。DNA經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶作用產(chǎn)生兩種斷裂狀態(tài)：粘性末端或平末端。限制性?xún)?nèi)切酶HindIII識(shí)別的堿基序列為：酶切反應(yīng)需Mg2+及其它一些輔助離子和一定的鹽離子濃度，不同內(nèi)切酶對(duì)鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量過(guò)高(>5%)，會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性(staractivity)。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度37℃，也有個(gè)別要求在50~65℃。二、實(shí)驗(yàn)原理第三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日不同核酸樣品在OD260=1時(shí)的濃度1、OD260：估算核算濃度2、OD280：估算核算濃度3、OD260：估算核算濃度4、OD260：估算核算濃度OD（opticaldensity，光密度）：表示被測(cè)物吸掉的光密度。第四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日不同核酸樣品在OD260=1時(shí)的濃度1、dsDNA=50g/ml(ng/l)2、ssDNA=37g/ml3、RNA=40g/ml4、oligo=30g/mlOD（opticaldensity，光密度）：表示被測(cè)物吸掉的光密度。第五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)材料（上次實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒pSK和MP3）第六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日四、儀器設(shè)備五、實(shí)驗(yàn)用具Eppendorf分光光度檢測(cè)儀NanoDrop分光光度檢測(cè)儀電泳儀

微型電泳槽

BioRad凝膠成像儀

紫外透射檢測(cè)儀

恒溫培養(yǎng)箱

冰盒微量離心管移液器微量離心管（1.5ml1）

吸管頭若干

點(diǎn)樣板第七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日NanoDrop分光光度檢測(cè)儀第八頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日NanoDrop測(cè)定結(jié)果DNA樣品純度好DNA樣品純度差DNA樣品純度差第九頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日比色皿Eppendorf分光光度檢測(cè)儀第十頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日六、試劑瓊脂糖5TBE電泳緩沖液

10載樣緩沖液（loadingbuffer）

GoldViewI型核酸染色劑（10000）DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAmarker）：MarkerIII已知系列濃度的λDNA（線性DNA分子，長(zhǎng)約50kb）(10、20、50、100ng/l)第十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日七、實(shí)驗(yàn)步驟（一）分光光度計(jì)法測(cè)定DNA的濃度和純度

（二）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA濃度（1%agarosegel）

（三）質(zhì)粒DNA的小量酶切（四）酶切質(zhì)粒DNA的電泳（1.5%agarosegel）（五）MP3質(zhì)粒的大量酶切第十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日1、Eppendorf分光光度檢測(cè)儀：取質(zhì)粒DNA2l（約100-200ng）至一干凈的離心管，加入198l蒸餾水稀釋?zhuān)浞只靹?。先?00l蒸餾水至比色杯，進(jìn)行紫外光空白測(cè)定，然后倒掉蒸餾水，加入200l已稀釋的DNA溶液，測(cè)定260nm及280nm的光吸收值（OD260及OD280），計(jì)算DNA濃度、OD260/OD280（估計(jì)核酸純度）及OD260/OD230（估計(jì)去鹽程度）比值。（自配溶液提取的質(zhì)粒DNA）2、NanoDrop分光光度檢測(cè)儀：先加1l蒸餾水進(jìn)行紫外光空白測(cè)定，然后用濾紙吸掉蒸餾水，加入1lElute溶液，測(cè)定上述數(shù)值。（制劑盒提取的質(zhì)粒DNA）（一）分光光度計(jì)法測(cè)定DNA的濃度和純度

第十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日1、利用ddH2O將質(zhì)粒DNA稀釋到濃度為10-100ng/l之間，然后分別取稀釋的DNA樣品和已知濃度的λDNA各1l于點(diǎn)樣板小孔中，再加入8lTE和1l的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔，藍(lán)色樣品混合物將沉入點(diǎn)樣孔下部。同時(shí)點(diǎn)5lMarkerⅢ作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。2、打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約半個(gè)小時(shí)后即可觀察。3、將電泳好的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，戴上防護(hù)觀察罩，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到綠色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)和熒光強(qiáng)度，對(duì)比已知濃度的λDNA條帶的粗細(xì)和熒光強(qiáng)度，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過(guò)線性DNA條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。（二）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA濃度（1%agarosegel）

第十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）質(zhì)粒DNA的小量酶切20l反應(yīng)體系（1.5ml離心管）：質(zhì)粒DNA（pSK、MP3）3~5

l（0.5-1g）酶切Buffer

2.0

l

Hind

III酶1.0

l滅菌ddH2O

to

20l加樣順序：水、buffer、DNA、酶37℃恒溫箱中放置數(shù)小時(shí)或者酶切過(guò)夜

第十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日1、配制1.5%的瓊脂糖凝膠2、酶切的DNA中加入2l的10×loadingbuffer，混勻后取20l上樣，同時(shí)點(diǎn)未酶切質(zhì)粒DNA（50-100ng）進(jìn)行遷移率對(duì)比，取5lMarkerⅢ點(diǎn)樣作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。3、電泳結(jié)束后分析酶切后質(zhì)粒條帶的變化、遷移率和不同條帶之間的亮度差異；同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過(guò)線性DNA條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。（三）酶切質(zhì)粒DNA的電泳第十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日（四）MP3質(zhì)粒的大量酶切100l反應(yīng)體系（1.5ml離心管）：

MP3質(zhì)粒DNA

2-4

g（試劑盒抽提）酶切Buffer

10

l

Hind

III酶2-4

l滅菌ddH2O

upto

100l加樣順序：水、buffer、DNA、酶37℃恒溫箱酶切過(guò)夜

第十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日MP3和pSK（+）質(zhì)粒DNA的HindIII酶切結(jié)果第十八頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日MP3和pSK（+）質(zhì)粒DNA的HindIII酶切結(jié)果第十九頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日第二十頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日2，

完成檢測(cè)后合上滑蓋，關(guān)閉電源。

第二十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日第二十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日第二十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日分光光度計(jì)法測(cè)定大腸桿菌液體培養(yǎng)物的OD600值細(xì)菌OD的測(cè)定原理是細(xì)菌顆粒的遮光，可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，而通過(guò)數(shù)量能反映出細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)。菌液濃度太高，用培養(yǎng)基稀釋可以降低OD值，但是太高濃度OD值的菌液可能細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)不符合要求，比如死的菌體會(huì)比較多等。1、在使用分光光度計(jì)時(shí)，測(cè)得的OD值在0

.1-0.4這個(gè)區(qū)間內(nèi)最可靠，最好不要超過(guò)1.0。因此OD盡量控制在0.1-1之間，最多不要超過(guò)2.0。取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)最好。2、空白用不接種的培養(yǎng)基，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)，以求條件一致。3、OD與體積或者說(shuō)稀釋倍數(shù)不一定成正比，如果OD大于2.0，一般要稀釋后再測(cè)，而不能根據(jù)之前的檢測(cè)結(jié)果稀釋?zhuān)驗(yàn)镺D太大了就會(huì)超過(guò)檢測(cè)范圍，靈敏度顯著降低。4、OD值是透光率，跟體積沒(méi)關(guān)系，只跟菌濃度有關(guān)系，而且只有在一定的吸光值范圍內(nèi)成線性關(guān)系，一般在范圍內(nèi)。第二十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日雙酶切時(shí)不要選擇識(shí)別位點(diǎn)有部分重疊或者太靠近的酶！M13F：5’-gTAAAACgACggCCAgTg-3’

M13R：5’-ggAAACAgCTATgACCATg-3’第二十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日載體單酶切：酶切后需要進(jìn)行脫磷，防止載體自連，而且連接后外源片段插入的方向不能固定，只能通過(guò)酶切檢測(cè)或者測(cè)序判斷。載體雙酶切：外源片段插入的方向是固定的，由目的片段兩側(cè)的酶切位點(diǎn)（往往通過(guò)PCR引物加入的酶切位點(diǎn)所確定，但要注意選擇的兩種酶在多克隆位點(diǎn)里有一定的距離，最好識(shí)別位點(diǎn)不要相互重疊，否則會(huì)造成酶切困難。載體單酶切和雙酶切的注意事項(xiàng)NotI：GCGGCCGCXbaI：TCTAGASpeI：ACTAGTCGCCGGCGAGATCTTGATCA第二十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日NotI：GCGGCCGCXbaI：TCTAGASpeI：ACTAGTCGCCGGCGAGATCTTGATCACleavageClosetotheEndofDNAFragments(linearizedvector)"BasePairsfromEnd"referstothenumberofdouble-strandedbasepairsbetweentherecognitionsiteandtheterminusofthefragment;thisnumberdoesnotincludethesingle-strandedoverhangfromtheinitialcut.第二十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日外源片段克隆到載體里的策略和步驟1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的載體；2、分析外源目的片段的酶切位點(diǎn)（找absentsite，分析軟件：如