第8章 基因工程

《生物技術(shù)概論》CorrespondingE-mail:ygwu@第八章基因工程主講：李繼杰CollegeofChemicalEngineering,GuiZhouUniversity

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DNA與遺傳物質(zhì)

DNA與基因

基因工程技術(shù)及應(yīng)用FromDNAtoHuman一.DNA與遺傳物質(zhì)1.DNA的化學(xué)本質(zhì)DNA就是脫氧核糖核酸(長鏈)核酸：核苷酸通過3’5-磷酸二酯鍵聯(lián)在一起;核苷酸：核苷的磷酸酯;核苷：堿基(AGTC四種)與戊糖(DNA在2’位脫氧,RNA不脫氧)通過糖苷鍵形成。核苷酸☉堿基Nitrogenousbases嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines胸腺嘧啶胞嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤堿基配對原則：A——TG——CDNA中的堿基類型☉核苷(nucleotide)糖苷鍵Glycosidicbond嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子核糖是戊糖RNA－核糖核苷

DNA－脫氧核糖核苷☉核苷酸(nucleotideacid)核苷的磷酸酯脫氧核糖核苷酸

核糖核苷酸其中α和β、β和γ之間是高能磷酸鍵Deoxynucleotides91’αβγ2.DNA的結(jié)構(gòu)(1)X-raydiffractiondatashowedthatDNAhastheformofaregularhelix,makingacompleteturnevery34?(3.4nm),withadiameterof~20?(2nm).Sincethedistancebetweenadjacentnucleotidesis3.4?,theremustbe10nucleotidesperturn.

(2)ThedensityofDNAsuggeststhatthehelixmustcontaintwopolynucleotidechains.Theconstantdiameterofthehelixcanbeexplainedifthebasesineachchainfaceinwardandarerestrictedsothatapurineisalwaysoppositeapyrimidine,avoidingpartnershipsofpurine-purine(toothick)orpyrimidine-pyrimidine(toothin).(3)TheproportionofGisalwaysthesameastheproportionofCinDNA,andtheproportionofAisalwaysthesameasthatofT.SothecompositionofanyDNAcanbedescribedbytheproportionofitsbasesthatisG+C.Thisrangesfrom26%to74%fordifferentspecies.WatsonandCrickproposedthatthetwopolynucleotidechainsinthedoublehelixassociatebyhydrogenbonding

betweenthenitrogenousbases.GcanhydrogenbondspecificallyonlywithC,whileAcanbondspecificallyonlywithT.Thesereactionsaredescribedasbasepairing,andthepairedbases(GwithC,orAwithT)aresaidtobecomplementary.Themodelrequiresthetwopolynucleotidechainstoruninoppositedirections(antiparallel).Lookingalongthehelix,therefore,onestrandrunsinthe5’→3’direction,whileitspartnerruns3’→5’.Eachbasepairisrotated~36oaroundtheaxisofthehelixrelativetothenextbasepair.So~10basepairsmakeacompleteturnof360o.Thetwistingofthetwostrandsaroundoneanotherformsadoublehelixwithanarrowgroove(~12?across)andawidegroove(~22?across).Thedoublehelixisright-handed;theturnsrunclockwiselookingalongthehelicalaxis.ThesefeaturesrepresenttheacceptedmodelforwhatisknownastheB-formofDNA.DNA染色體3.DNA是遺傳物質(zhì)

(1)貯藏遺傳信息的功能

(2)傳遞遺傳信息的功能

(3)表達(dá)遺傳信息的功能

由此，克里克提出中心法則,確定遺傳信息由DNA通過RNA流向蛋白質(zhì)的普遍規(guī)律。DNADNARNA蛋白質(zhì)中心法則中心法則：遺傳信息儲存在DNA中，DNA通過轉(zhuǎn)錄生成mRNA，mRNA再通過翻譯生成蛋白質(zhì)，從而完成遺傳信息的表達(dá)過程。二.DNA與基因基因(gene)：是一個遺傳信息單位，其對應(yīng)著一段編碼多肽氨基酸順序的不連續(xù)DNA片斷。外顯子：基因的編碼序列。內(nèi)含子：基因的間隔序列。?大多數(shù)生物體通常由

一對遺傳因子(后來稱為兩個等位基因)控制同一性狀。這樣的生物體稱為2n個體。

?

遺傳因子可以區(qū)分為顯性和隱性。

?控制不同性狀的遺傳因子是各自獨立的。同源染色體分別帶著控制同一性狀的兩個等位基因顯性等位基因純合子隱性等位基因純合子雜合子減數(shù)分裂時發(fā)生：染色體交叉/基因重組。基因重組服從這樣的規(guī)則：兩個基因在染色體離得越遠(yuǎn)，重組頻率越高；兩個基因在染色體上離得越近，重組頻率越低。重組頻率

一個基因一個性狀？不一定。例如膚色的控制至少有三個基因參與。

基因決定性狀，環(huán)境還起不起作用？在基因型確定的基礎(chǔ)上,環(huán)境常常會影響表型。產(chǎn)生黑色素的酶在較高溫度下失活，所以毛色在端點位置體溫較低處呈黑色環(huán)境影響表型三.基因工程技術(shù)及應(yīng)用1、基因工程技術(shù)★★★

基因工程是生物技術(shù)的核心部分。基因工程的操作可以簡述如下：基因工程的操作流程基因工程的操作包含以下步驟：

獲得目的基因

構(gòu)造重組DNA分子

轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染

表達(dá)

蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離純化基因工程基本技術(shù)路線★★★將外源基因(又稱目的基因，是一段DNA片斷)組合到載體DNA

分子中去，再把它轉(zhuǎn)到受體細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)中去，使外源基因在寄主細(xì)胞中增殖和表達(dá)，從而得到期望的由這個外源基因所編碼的蛋白質(zhì)?；蚬こ痰幕静僮鳎褐亟MDNA技術(shù)的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢(1)獲得目的基因到哪里去找目的基因？一般來說，人的基因,要從人體的組織細(xì)胞中去找；小鼠的基因要從小鼠的組織細(xì)胞中去找。

從組織細(xì)胞中可以分離得到人/小鼠的全套基因,稱為基因文庫。文庫中基因總數(shù)就人來說約有3萬個基因。如何從中把需要的基因找出來？

采取“釣”的辦法。這個辦法通常稱為印跡法。Southern印跡雜交(southernblot)★★★

Southernblot是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性(NaOH)，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干(80℃烤4~6h)固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交(雜交一般在高鹽濃度和68℃下進(jìn)行數(shù)小時或十幾小時)，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。由英國分子生物學(xué)家E.M.Southern發(fā)明Southernblottingprocess內(nèi)切酶切開DNA電泳分離DNA片段印跡轉(zhuǎn)移與放射性探針雜交放射自顯影樣品(血液)中的DNA分子將變性DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上探針可以是DNA，也可以是RNA；可以用放射性同位素標(biāo)記，也可以用生物素或熒光素標(biāo)記。(1)基因文庫－DNA用限制性內(nèi)切酶處理。

(2)DNA片斷混合物通過電泳分離。

(3)電泳后，通過印跡技術(shù)轉(zhuǎn)到酯酰纖維薄膜上，以便操作。

(4)用已知小片斷DNA作為探針，互補(bǔ)結(jié)合需要找的基因片斷。

(5)探針DNA片斷已用放射性元素標(biāo)記，使膠片感光后可看出。印跡法的主要步驟：印跡法的關(guān)鍵是“分子雜交”：利用堿基配對的原則，用一段小的已知的DNA片斷去尋找(“釣”)大的未知的基因片斷。

探針DNA片斷從何而來？根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15～20個氨基酸序列，按三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)為40～60核苷酸序列，人工合成，即為探針DNA片斷。Northern印跡雜交和Western印跡法應(yīng)用類似的方法也可用于分析RNA。即將RNA變性后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上再進(jìn)行雜交。這種方法稱為Northern印跡雜交。用類似的方法，根據(jù)抗原與抗體可以結(jié)合的原理，也可以分析蛋白質(zhì)，這種方法稱為Western印跡法。(2)目的基因的擴(kuò)增用上面的方法“釣”出的目的基因，數(shù)量極少，所以，接下來必須經(jīng)過擴(kuò)增，亦稱為基因克隆。獲得相當(dāng)數(shù)量的目的基因后，才能繼續(xù)下一步操作?！褜ふ夷康幕蚝蛿U(kuò)增目的基因兩步操作并成一步。PCR技術(shù)★★★聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR

)又稱為PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效、快速、特異性的體外DNA聚合程序。1985年，美國PE-cetus公司人類遺傳研究室的Kary

mullis發(fā)明了具有劃時代意義的PCR技術(shù)；1993年，Kary

mullis因發(fā)明PCR技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎。PCR操作流程90

0C500C700C第一步

——90℃高溫下，使混合物的DNA片斷因變性而成單鏈。

第二步

——50℃

溫度下，引物DNA結(jié)合在適于配對的DNA片斷上。

第三步

——70℃溫度下，由合成酶(DNA高溫聚合酶)催化，從引物開始合成目的基因DNA。PCR反應(yīng)分三步完成：PCR的三個步驟為一次循環(huán)，約需5～10分鐘。每經(jīng)一次循環(huán)，所找到的目的基因擴(kuò)充一倍。經(jīng)過20次循環(huán)，即可擴(kuò)增

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倍，總共只需幾個小時。(3)構(gòu)造重組DNA分子首先要有載體。

載體有好幾種，常用的有：

質(zhì)?！h(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因的載體。

噬菌體DNA——線狀雙鏈DNA，適于做大片斷基因的載體。用質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子用噬菌體DNA構(gòu)建重組DNA分子其次要把目的基因“裝”到載體中去?！鞍惭b”的過程，需要的關(guān)鍵酶叫限制性內(nèi)切酶。

此酶識別一定堿基序列，有的還可切出“粘性”末端，使得目的基因和載體的連接非常容易。限制性內(nèi)切酶識別特定的堿基序列限制性內(nèi)切酶造成粘性末端有利于重組DNA分子的構(gòu)建把構(gòu)造好的重組DNA分子送進(jìn)寄主細(xì)胞，亦需要適當(dāng)?shù)募夹g(shù)方法。若受體細(xì)胞是細(xì)菌，通常稱轉(zhuǎn)化；若受體細(xì)胞是動/植物細(xì)胞，通常稱轉(zhuǎn)染。(4)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)化(5)目的基因表達(dá)及蛋白質(zhì)分離進(jìn)入到寄主細(xì)胞的目的基因還要能表達(dá)產(chǎn)生有活性的目的蛋白，這些目的蛋白可以是某種蛋白質(zhì)藥物，也可以表達(dá)某種抗性性狀(如植物的抗病性和抗旱性)。蛋白質(zhì)的分離純化——生物分離技術(shù)重組DNA分子進(jìn)入寄主細(xì)胞后，其中的目的基因能否表達(dá)，表達(dá)效率高低，還有很大差別。表達(dá)通常是指目的基因編碼的蛋白質(zhì)合成?；蚬こ痰淖詈笠徊?，是把所獲得的蛋白質(zhì)分離純化，得到蛋白質(zhì)產(chǎn)品?；蚬こ叹蚬こ谭磻?yīng)器2.基因工程應(yīng)用(1)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)——肽類藥物。胰島素1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素干擾素1200升人血2－3萬美元/病人

1升發(fā)酵液200－300美元/病人(2)提高奶酪產(chǎn)量生產(chǎn)奶酪的凝乳酶傳統(tǒng)上來自哺乳小牛