DNA甲基化檢測方法教學(xué)課件

DNA甲基化檢測方法2021/8/231精品PPT模板DNA甲基化檢測方法總覽2021/8/232精品PPT模板

主要檢測途徑基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法(金標(biāo)準(zhǔn))不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法2021/8/233精品PPT模板基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法質(zhì)譜分析水解核苷酸質(zhì)譜分析2021/8/234精品PPT模板基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理12021/8/235精品PPT模板基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理22021/8/236精品PPT模板

應(yīng)用一:直接測序法（Directsequencing)

用于甲基化分析的樣本常常是混合樣本，不適合直接直接進(jìn)行sanger測序分析2021/8/237精品PPT模板

直接測序法2021/8/238精品PPT模板圖6PMVK基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測序結(jié)果2021/8/239精品PPT模板圖7TRIB3基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測序結(jié)果2021/8/2310精品PPT模板應(yīng)用二：重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序(Bisulfite-sequencePCR，BSP)2021/8/2311精品PPT模板2021/8/2312精品PPT模板

注：A：癌組織；B：癌旁組織；○-：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆測序結(jié)果2021/8/2313精品PPT模板BSP克隆測序甲基化率三維圖形2021/8/2314精品PPT模板優(yōu)點:能準(zhǔn)確的檢測出每個DNA分子單倍體型的

甲基化狀態(tài)，同時能分析不同CpG位點之間

的甲基化狀態(tài)的聯(lián)系。缺點：需要對PCR產(chǎn)物克隆，操作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)

力，克隆子的數(shù)目影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

測序重復(fù)性差。2021/8/2315精品PPT模板應(yīng)用三：甲基化特異性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)2021/8/2316精品PPT模板2021/8/2317精品PPT模板2021/8/2318精品PPT模板UMUMUMladder100150200250MSP法檢測抑癌基因RASSF1A啟動子區(qū)的甲基化圖MSP檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，U為非甲基化，M為甲基化。2021/8/2319精品PPT模板

MSP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖研究結(jié)果注：M表示甲基化，U表示未甲基化

B1-B6為高脂血癥組六例標(biāo)本，D1-D5為正常對照組五例標(biāo)本；H2O為陰性對照；m為50bpMarker。SREBP-1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)2021/8/2320精品PPT模板甲基化特異性PCR優(yōu)點：①操作簡便；②敏感性高；③Nested-MSP提高靈敏度，便于分析微量檢材缺點：①引物設(shè)計要求高；②只能作定性研究；③存在重亞硫酸鹽處理不完全導(dǎo)致的假陽性；④只能了解部分位點的甲基化狀態(tài)。2021/8/2321精品PPT模板MethyLight對MSP的產(chǎn)物用Taqman探針進(jìn)行qPCR，從而實現(xiàn)甲基化的定量分析。優(yōu)點：增加了重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和DNA復(fù)性的質(zhì)控對照

避免了電泳、酶切等操作缺點：PCRbias2021/8/2322精品PPT模板應(yīng)用四：結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)2021/8/2323精品PPT模板結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法2021/8/2324精品PPT模板基于限制性內(nèi)切酶的工具酶甲基化特異性的限制性內(nèi)切酶(MDRE)：可以識別甲基化的胞嘧啶甲基化敏感性的限制性內(nèi)切酶(MSRE)：可以識別甲基化的胞嘧啶2021/8/2325精品PPT模板基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法2021/8/2326精品PPT模板MSRE-PCR原理圖1-1MSRE-PCR原理圖注：左圖DNA無甲基化,DNA被切斷,無法得到PCR產(chǎn)物;右圖DNA有甲基化,DNA保持完整,可以獲得PCR產(chǎn)物.2021/8/2327精品PPT模板應(yīng)用舉例二：采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶技術(shù)結(jié)合PCR的方法（MSRE-PCR）篩選在肝癌與癌旁組織中有甲基化差異的基因。2021/8/2328精品PPT模板圖1-3：DNM基因瓊脂糖凝膠電泳圖M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶體系；A：癌組織；B：癌旁組織；空：水空白2021/8/2329精品PPT模板酶識別位點內(nèi)含有一個及以上CpG位點應(yīng)用條件：2021/8/2330精品PPT模板結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法優(yōu)點：①方法相對簡單；②可進(jìn)行甲基化水平的定量研究；③需要樣本量少。2021/8/2331精品PPT模板缺點：①由于CG僅限于內(nèi)切酶識別序列中，因此非識別序列的CG將被忽略；②只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點的甲基化狀態(tài)時，該檢測方法的結(jié)果才有意義；④存在酶消化不完全引起的假陽性的問題；結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法2021/8/2332精品PPT模板應(yīng)用五：RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qAMP)2021/8/2333精品PPT模板基本步驟2021/8/2334精品PPT模板舉例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmousePrimeraredesigned

toflankNotl(N),Hhal(Hh),andMcrBc(M)RestrictionsitesintheDMRregion.2021/8/2335精品PPT模板LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestionwithnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.2021/8/2336精品PPT模板ThedifferenceintheCt

valueofanenzyme-digestedtemplaterelativetothesham-digestedtemplatedeterminatesthelevelsofDNAmethylationineachtissue.MSREMDRE2021/8/2337精品PPT模板

應(yīng)用六：基于親和純化的甲基化分析方法

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基于親和純化的甲基化分析方法

2021/8/2339精品PPT模板2021/8/2340精品PPT模板應(yīng)用七：ChIP-Seq技術(shù)

2021/8/2341精品PPT模板ChIP-Seq

2021/8/2342精品PPT模板應(yīng)用八：芯片技術(shù)在甲基化檢測中的應(yīng)用2021/8/2343精品PPT模板啟動子區(qū)甲基化芯片技術(shù)2021/8/2344精品PPT模板基因芯片雜交信號圖2021/8/2345精品PPT模板2021/8/2346精品PPT模板2021/8/2347精品PPT模板應(yīng)用九、質(zhì)譜技術(shù)（MassSpectromericAnalysisofCytosineMethylationbyBase-SpecificCleavageandPrimerExtensionMethods）2021/8/2348精品PPT模板如圖所示切下的每個片段含有一個或兩個CpG位點，在質(zhì)譜圖上甲基化片段和未甲基化片段大小相差16Da或32DaBase-SpecificCleavage2021/8/2349精品PPT模板PrimerExtensionMethods2021/8/2350精品PPT模板如圖所示，用ddC和ddT終止延伸后，在質(zhì)譜圖上顯示出甲基化組（ddC）和未甲基化組(ddT)的質(zhì)譜峰,二者相差16Da。2021/8/2351精品PPT模板Base-SpecificCleavage檢測的是一個酶切后片段的甲基化狀態(tài)，用于在長片段DNA序列（如基因啟動子區(qū)域）中篩選甲基化位點并確定每個甲基化位點的甲基化程度，而在基因的甲基化譜確定后可以用PrimerExtensionMethods精確的對每個CpG位點的甲基化程度進(jìn)行定量檢測，PrimerExtensionMethods最多可以實現(xiàn)25個位點同時檢測。2021/8/2352精品PPT模板質(zhì)譜法檢測的優(yōu)勢：靈敏度準(zhǔn)確性高。操作較簡便。局限性：DNA樣本要求純度較高，提取過程中的小離子，未消化完全的蛋白，RNA對結(jié)果有干擾作用。需用質(zhì)譜儀。2021/8/2353精品PPT模板應(yīng)用十、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法（methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension(Ms-SNuPE)）2021/8/2354精品PPT模板擴(kuò)增基因組DNA樣本重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ExoSAP消化PCR引物延伸加入SNP引物和SNaPshotMixSNP引物延伸(加入ddT或ddC)SAP處理分析310/3100樣本準(zhǔn)備加入GS120LIZ內(nèi)標(biāo)ABI310/3100電泳選用E5和POP4膠數(shù)據(jù)分析（GeneScan）樣本分型（Genotyper或GeneMapperID）步驟2021/8/2355精品PPT模板123456這是一個多重SNaPshot的檢測結(jié)果，總共檢測了6個CpG位點，陰影峰代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位點1、2和4顯示大約50%的甲基化率，而位點3、5和6顯示0的甲基化率。2021/8/2356精品PPT模板應(yīng)用十一：高分辨熔解曲線分析

MS-HRM

2021/8/2357精品PPT模板HRM技術(shù)：用于篩選大量樣本，獲得感興趣的CpG位點鑒定感興趣的CpG島。2021/8/2358精品PPT模板HRM技術(shù)原理2021/8/2359精品PPT模板HRM技術(shù)原理2021/8/2360精品PPT模板HRM特點高靈敏性：可檢測低達(dá)0.1%甲基化程度。高通量：1次可同時檢測不超過384樣本，適用于大樣本多位點甲基化掃描。高重復(fù)性：重復(fù)性100%。使用范圍廣：不受堿基位點局限。

操作簡便：只需設(shè)計特異引物，無須序列特異性探針，無需測序。標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測。

缺點：檢測序列長度不應(yīng)超過100bp；

只能進(jìn)行半定量檢測2021/8/2361精品PPT模板應(yīng)用十二：焦磷酸測序法2021/8/2362精品PPT模板焦磷酸測序法（Pyrosequencing）2021/8/2363精品PPT模板焦磷酸測序法（Pyrosequencing）2021/8/2364精品PPT模板焦磷酸測序2021/8/2365精品PPT模板焦磷酸測序2021/8/2366精品PPT模板焦磷酸測序2021/8/2367精品PPT模板焦磷酸測序的優(yōu)勢：靈敏度高，可測到鄰近CpG區(qū)域的單個甲基化水平，甚至包括測序的引物區(qū)域。除常規(guī)的檢測位點變化情況外，還可準(zhǔn)確計算頻率變化。

對于檢測位點要求低，可檢測未知序列信息，覆蓋到人類基因組的所有CpG位點；對于樣品要求低，適用于新鮮、冷凍和FFPE樣本。2021/8/2368精品PPT模板2021/8/2369精品PPT模板應(yīng)用十三：QuantificationofMethylatedDNAbyHeavyMethylDuplexPCR2021/8/2370精品PPT模板PrincipleofHeavyMethyl(A)WhentheDNAismethylated,theblockeroligonucleotides(solidblack)donotbind,leavingtheprimerbindingsiteaccessiblefortheprimers(grayarrows)tobindandamplifythetarget.Theamplicationisdetectedwithamethylationspecificoligonucleotideprobe[solidblack,labeledwithfuorescentdye(F)andquencher(Q)ina5’-exonucleaseassay,usedhereasanexampleforareal-timedetectionmethod].(B)WhentheDNAisunmethylated,theblockeroligonucleotidesbind,blockingtheaccessoftheprimerstotheirbindingsites.NoPCRproductisgenerated.2021/8/2371精品PPT模板samplethroughputversusgenomecoverage.AplotofsamplethroughputagainstgenomecoverageforvariousDNAmethylationtechniques.Throughputisdeterminedbythenumberofsamplesthatcanbeanalysedperexperiment,basedonlargeeukaryoticgenomes.CoverageisdeterminedbythenumberofCpGsinthegenomethatcanbeanalysedperexperiment.不同甲基化檢測方法的檢測通量2021/8/2372精品PPT模板1.篩選Differentiallymethylatedregion；課題流程：2.對篩選出的DMR進(jìn)行測序，驗證是否具有甲基化差異性，同時篩選出隨齡變化相關(guān)性強(qiáng)的CpG位點；3.檢測每個樣本CpG位點的甲基化率，做回歸分析。做回歸分析需要的樣本量很大，每個樣本需要檢測多個CpG位點。基于克隆的Sanger測序需要多個克隆子，操作繁瑣，重復(fù)性差，成本會很高；焦磷酸測序需要對多個片段進(jìn)行測序，樣本量太大，成本會不小。對單個位點甲基化進(jìn)行定量分析的方法有很多，個人覺得質(zhì)譜法或者M(jìn)s-SNuPE可以考慮，RD-qAMP可以避免重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，也可以考慮.其它的幾個我感覺不太適合，譬如MS-PCR只能半定量，MethyLight存在PCRbias，BioCOBRA要求甲基化位點酶切位點內(nèi)，MS-HRM和芯片檢測的是片段甲基化狀態(tài)，CHIP-sequence要求illumina平臺。易老師你認(rèn)為呢？2021/8/2373精品PPT模板9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。03-2月-23