質(zhì)粒DNA的小量快速提取

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茫茫人海你我相遇就是緣分，歡迎下載！質(zhì)粒DNA的小量快速提取22021/4/26

質(zhì)粒DNA提取是基因克隆中的常規(guī)工作，他包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增，收集和裂解細(xì)菌，分離和純化質(zhì)粒DNA。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒DNA的抽提過程。32021/4/26實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各主要試劑的作用。42021/4/26實(shí)驗(yàn)原理堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。堿裂解法基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來。52021/4/26

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。62021/4/26質(zhì)粒檢測(cè)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。72021/4/26質(zhì)粒DNA的提取方法1.堿裂解法2.煮沸法1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。3、將菌體沉淀懸浮于120mlSTET溶液中,渦旋混勻。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),渦旋振蕩3秒鐘。5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。6、用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10分鐘。7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。82021/4/263.酚氯仿裂解法①從瓊脂平板上挑取轉(zhuǎn)化菌陽性克隆，接種到標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)液中（含有卡那霉素30μg/mL）搖菌12h；收集1.5mL菌液，8000g/min離心3min，棄上清，沉淀加入200μLTE，充分混勻；加入400μL酚氯仿（1∶1體積）混合液，劇烈振動(dòng)10s，混勻；12000g/min離心5min，1mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉淀層；上清經(jīng)國(guó)產(chǎn)0.22μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內(nèi)加入2倍體積無水乙醇，振蕩10s，12000g/min離心5min；沉淀溶于20μL的RTE溶液中，37℃水浴.②按PstI內(nèi)切酶說明書進(jìn)行酶切反應(yīng)（37℃，1h）.酶切產(chǎn)物10μL，10g/L瓊脂糖凝膠電泳.③PCR引物根據(jù)參考文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為714bp.④常規(guī)制備感受態(tài)菌E.coliDH5a，提取質(zhì)粒DNA常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂于含有卡那霉素（30μ/mL）LB培養(yǎng)平板中，37℃培養(yǎng)，15h后觀察篩選克隆情況.92021/4/264.堿變性法5.SDS法6.羥基磷灰石層析法102021/4/261.器材

高壓滅菌器，恒溫?fù)u床，高速離心機(jī)，微量可調(diào)式移液器，

1.5mL離心管等。2.試劑1、LB液體培養(yǎng)基：稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，去離子水950mL，待溶質(zhì)完全溶解后，用NaOH調(diào)pH至7.0，加去離子水至總體積1000mL，121℃，1.01×105Pa高壓下蒸氣滅菌20分鐘。2.氨芐西林：100mg/mL

實(shí)驗(yàn)試劑和器材112021/4/269、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2月-232月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。17:02:3117:02:3117:022/3/20235:02:31PM11、人總是珍惜為得到。2月-2317:02:3117:02Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。17:02:3117:02:3117:02Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2月-232月-2317:02:3117:02:31February3,202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20235:02:31下午17:02:312月-2315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月235:02下午2月-2317:02February3,202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/317:02:3117:02:3103February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。5:02:31下午5:02下午17:02:312月-23

3.溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L

Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L

EDTA(pH8.0）。配制方法：1M

Tris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5M

EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高壓滅菌15min，貯存于4℃。4.溶液Ⅱ（新鮮配置）：0.2MNaOH，1%

SDS。配制方法：2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置。5.溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。配制方法：5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?32021/4/26

6.酚/氯仿：將酚和氯仿等體積混合，用Tris-HCl平衡至pH7.6，至棕色瓶中4℃。

7.TE緩沖液pH(8.0)：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。8.RNaseA(10mg/mL)9.70%乙醇,無水乙醇。142021/4/26實(shí)驗(yàn)步驟1.細(xì)菌培養(yǎng)將含有pQE30質(zhì)粒的大腸埃希菌TG1接種到10mL含有氨芐西林（100μg/mL）的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖過夜。2.收集菌體取1.5ml菌液轉(zhuǎn)入離心管中，10000r/min離心1min，棄上清。3.懸浮細(xì)菌將細(xì)菌沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩使細(xì)菌沉淀懸浮。注意：細(xì)胞懸液必須懸浮均勻，無可見沉淀塊，否則提取DNA的純度和得率會(huì)大大降低。（溶液I的作用是分散細(xì)胞，并螯合金屬離子使能夠破壞質(zhì)粒DNA的DNase失活。152021/4/264.堿液裂解加入新配制的溶液Ⅱ200μl，輕緩顛倒離心管6-8次，使管內(nèi)容物混均，禁止劇烈振蕩。置冰浴中放置2min。（溶液Ⅱ的作用是使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂釋放內(nèi)容物，核酸和蛋白質(zhì)在堿性條件下變性。）

5.中和與復(fù)性加入150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，輕緩顛倒數(shù)次，使溶液III在粘稠的菌液裂解物中分散均勻，在冰浴中放置5min。（溶液Ⅲ的作用是使pH恢復(fù)中性，質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物形成白色沉淀。）6.離心沉淀用臺(tái)式高速離心機(jī)12000r/min離心5min,將含有質(zhì)粒DNA的上清轉(zhuǎn)入另一離心管中。7.酚/氯仿抽提除蛋白加入等體積的酚-氯仿，劇烈振蕩混勻,靜置3min待其分層后，12000r/min離心10min，將上層液轉(zhuǎn)入另一離心管中。162021/4/268.乙醇沉淀質(zhì)粒DNA加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻，靜置5min使質(zhì)粒DNA形成沉淀。12000r/min離心10min，收集質(zhì)粒DNA沉淀，棄上清液。9.乙醇洗鹽質(zhì)粒DNA沉淀里含有一定量的鹽分需出去。加入1ml70％乙醇，輕緩搖動(dòng)數(shù)次，12000r/min離心2min。棄上清液。10.溶解質(zhì)粒DNA待殘存乙醇揮發(fā)干凈后，加30μlTE緩沖液(pH8.0）溶解沉淀，加2μlRnaseA（10mg/L)，37℃保溫30min以去除RNA。所得質(zhì)粒DNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?72021/4/26注意事項(xiàng)1.提取過程應(yīng)盡量保持低溫。2.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。182021/4/26思考題1.溶液I,II,III的作用分別是什么？加溶液I,II,III使要注意哪些問題？2.實(shí)驗(yàn)中加入酚-氯仿、無水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分別是什么？192021/4/269、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2月-232月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。17:02:3117:02:3117:022/3/20235:02:31PM11、人總是珍惜為得到。2月-2317:02:3117:02Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。17:02:3117:02:3117:02Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2月-232月-2317:02:3117:02:31