發(fā)酵工程碩士論文

發(fā)酵工程碩士論文申請(qǐng)學(xué)位學(xué)科專(zhuān)業(yè)：發(fā)酵工程摘要谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，具有去除自由基、解毒、抑制衰老、預(yù)防糖尿病和癌癥、抑制艾滋病毒、提高人體免疫力等重要生理功能，在醫(yī)學(xué)、食品、化裝品等領(lǐng)域具有廣泛的市場(chǎng)前景?，F(xiàn)有GSH生產(chǎn)能力遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，所以采用GSH高產(chǎn)菌株發(fā)酵廉價(jià)原料轉(zhuǎn)化為GSH，建立適合工業(yè)化別離純化GSH的方法會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。本文以富含GSH的啤酒酵母Y-14為材料，分別從以下四個(gè)方面進(jìn)行研究：(1)利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到的最適培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15g/L。對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證(2)利用單因素試驗(yàn)對(duì)啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH發(fā)酵條件進(jìn)行研究，結(jié)果得到搖瓶最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30℃、初始pH6.0、搖床轉(zhuǎn)速180rpm、搖瓶裝液量30mL/300mL、補(bǔ)料培養(yǎng)基添加時(shí)間20h。在此條件下，菌體胞內(nèi)GSH含量到達(dá)31.56mg/g，GSH的產(chǎn)量可達(dá)249.2mg/L，較原來(lái)提高了102%。(3)利用10L自動(dòng)發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)啤酒酵母Y-14，①采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，20h時(shí)添加前體氨基酸和ATP的方法，測(cè)得GSH的產(chǎn)量在52h時(shí)，到達(dá)最大值243mg/L。②采用恒速流加全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，36h時(shí)添加補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法，測(cè)得GSH產(chǎn)量在52h到達(dá)最大值520.742mg/L。比擬發(fā)現(xiàn)，第二批發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體干重、GSH產(chǎn)量較第一批分別提高了122.5%、114.2%。(4)采用D001大孔樹(shù)脂粗別離GSH，得到最正確別離條件為：上樣pH3.0，濃度為61.4mg/100mL，流速為0.5mL/min，洗雜質(zhì)用液為無(wú)水乙醇，洗脫液為1.5%HCl+0.3mol/LNaCl，流速為3mL/min。GSH的平均收得率為69.11%，蛋白質(zhì)去除率為64.8%。然后通過(guò)SephadexG-10脫鹽純化GSH，得到最適條件：Φ1.6cm×25cm玻璃層析柱，上樣濃度為116.66mg/100mL，上樣體積為20mL。結(jié)果GSH的平均收得率為96.21%。最后SephadexG-10分級(jí)別離純化GSH，采用Φ1.6cm×50cm玻璃層析柱，最適上樣體積為2mL，GSH的平均收得率為99.26%，蛋白質(zhì)去除率為56.5%。GSH濃縮倍數(shù)平均為9.07倍，純化倍數(shù)為8.67倍。關(guān)鍵詞：啤酒酵母Y-14，谷胱甘肽，發(fā)酵罐，D001大孔樹(shù)脂，SephadexG-10

AbstractGlutathione(GSH)isatripeptideformedbyglutamicacid,cysteineandglycin,ithasimportantphysiologicalfunctionssuchasremovingfreeradical,detoxification,anti-aging,diabetesandcancerprevention,inhibitionofHIVandimprovetheeffectivenessofthehumanimmunesystem,andhasawiderangeofmarketprospectsinthefieldsofmedical,foodandcosmetics.ButtheexistingproductioncapacityofGSHisfarfromthemarketdemand.UsemicrobialfermentationtotranslatecheaprawmaterialsintohighyieldedGSH,andestablishsuitableindustrializationseparationandpurificationofGSHwillbringenormoussocialandeconomicbenefits.Inthispaper,themainresearchcontentandresultsareasfollows:(1)UsingPlackett-BurmanandBox-BehnkenexperimentaldesignoptimizedmediumofSaccharomycescerevisiaeY-14whichproducingGSH.Theoptimummediumwasglucose20g/mL,yeastextract10g/mL,(NH4)2SO48g/mL,KH2PO43g/mL,MgSO40.15g/mL.TheoptimumexperimentshowedthatGSHyieldreachedto124.77mg/L.(2)UsingsinglefactorteststudiedthefermentationconditionsofyeastY-14producingGSH.Theoptimumshake-flaskfermentationconditionswasculturetemperature30℃,initialpH6.0,shakespeed180rpm,liquidvolume30mL/300mL,mediumbatchaddtime20h.GSHcontentreachedto31.56mg/g,GSHyieldreachedto249.2mg/L,increased102%comparetotheoriginal.(3)Using10Lautomatedfermentor,①u(mài)singsingleconstantspeedfedglucosemedium,addedprecursorsofaminoacidsandATPat20h,andtheGSHyieldreachedtomaximum243mg/Lat52h.②usingconstantflowincreasestotalnutrientmedium,addedfedmediumat36h,GSHyieldmaximumreachedto520.742mg/L.ItshowedthatdrycellweightandGSHyieldincreased122.5%and114.2%respectivelycomparedtothefirstfermentorcultivation.

(4)UsingD001macroporousresinroughtoseparateGSH,theoptimumseparationconditionswas:samplepH3.0,sampleconcentrationwas61.4mg/100mL,sampleflowrateof0.5mL/min,impuritieswashingliquidwasabsolutealcohol,eluatewas1.5%HCland0.3mol/LNaCl,elutionflowratewas3mL/min,theaverageyieldofGSHwas69.11%,proteinremovalratewas64.8%.ThenusingSephadexG-10todesaltandpurifyGSH,theoptimumconditionswas:Φ1.6cm×25cmchromatographycolumns,sampleconcentrationwas116.66mg/100mL,samplevolumewas20mL.TheaverageyieldofGSHwas96.21%.Intheend,usingSephadexG-10topurifyGSH,usingΦ1.6cm×50cmchromatographycolumns,theoptimumsamplevolumewas2mL,theaverageyieldofGSHwas99.26%,proteinremovalratewas56.5%.Theaverageofconcentrationmultipleandpurificationmultiplewas9.07and8.67respectively.Keywords：SaccharomycescerevisiaeY-14,Glutathione,Fermentor,D001macroporousresin,SephadexG-10

目錄摘要 IAbstract II目錄 III第1章引言 11.1谷胱甘肽概述 11.1.1谷胱甘肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 11.1.2谷胱甘肽的生理功能及其應(yīng)用 31.2發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài) 41.3本研究的意義、目的及內(nèi)容 91.3.1意義 91.3.2目的 91.3.3研究?jī)?nèi)容 101.4常用研究指標(biāo)的說(shuō)明 10第2章啤酒酵母Y-14發(fā)酵GSH培養(yǎng)基的優(yōu)化 112.1材料 112.1.1菌種： 112.1.2培養(yǎng)基： 112.1.3主要試劑 122.1.4主要儀器 122.2方法 122.2.1菌株活化 132.2.2種子搖瓶培養(yǎng) 132.2.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 132.2.4菌種的保藏 132.2.5DTNB法檢測(cè)GSH含量 132.2.6試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法 132.3結(jié)果與分析 142.3.1顯著影響因素的篩選結(jié)果 142.3.2Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果 162.4結(jié)論 19第3章啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH發(fā)酵條件的優(yōu)化 203.1材料 203.1.1菌種： 203.1.2培養(yǎng)基： 203.1.3主要試劑 213.1.4主要儀器 213.2方法 213.2.1啤酒酵母Y-14生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 213.2.2發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn) 213.2.3發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn) 213.2.4發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗(yàn) 223.2.5發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn) 223.2.6發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn) 223.2.7搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH的進(jìn)程試驗(yàn) 223.3結(jié)果與分析 223.3.1啤酒酵母Y-14生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制 223.3.2發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 233.3.3發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 243.3.4發(fā)酵初始pH值的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 243.3.5發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 253.3.6發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 263.3.7搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH進(jìn)程曲線(xiàn)的繪制 273.4結(jié)論 28第4章10L自動(dòng)發(fā)酵罐擴(kuò)大發(fā)酵的初探 294.1材料 294.1.1菌種： 294.1.2培養(yǎng)基 294.1.3主要試劑 304.1.4主要儀器 304.2方法 304.2.1斜面種子培養(yǎng) 304.2.2一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng) 314.2.3二級(jí)種子搖瓶培養(yǎng) 31發(fā)酵罐流加培養(yǎng)試驗(yàn) 314.2.5分析方法 314.3結(jié)果與討論 324.3.1第一批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) 324.3.2第二批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) 364.4結(jié)論 40第5章啤酒酵母Y-14中復(fù)原型GSH的別離純化 415.1材料 415.1.1菌種 415.1.2主要材料 425.1.3主要設(shè)備 425.2方法 425.2.1GSH提取液的制備 425.2.2檢測(cè)方法 425.2.3相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算公式 425.2.4D001大孔樹(shù)脂離子交換柱的試驗(yàn)流程 435.2.5D001大孔樹(shù)脂別離GSH的研究 435.2.6SephadexG-10凝膠柱的試驗(yàn)流程 445.2.7SephadexG-10純化GSH的研究 455.3結(jié)果與分析 465.3.1D001大孔樹(shù)脂別離GSH的研究結(jié)果 465.3.2SephadexG-10脫鹽純化GSH的研究結(jié)果 505.3.3SephadexG-10分級(jí)別離純化GSH的研究結(jié)果 535.4結(jié)論 56第6章總結(jié)與展望 576.1總結(jié) 576.2創(chuàng)新點(diǎn) 586.3展望 58參考文獻(xiàn) 59致謝 64第1章引言據(jù)報(bào)道，人體內(nèi)有一種神奇的物質(zhì)，它和人的健康狀況有直接的關(guān)系。這種神奇的物質(zhì)，科學(xué)上稱(chēng)之為谷胱甘肽(GSH)。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過(guò)肽鍵縮合而成，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有保肝、抗氧化的作用，含有豐富的氨基酸、肽類(lèi)物質(zhì)、維生素、微量元素。近日，據(jù)有關(guān)病毒學(xué)家介紹：每天補(bǔ)充50毫克GSH，可快速產(chǎn)生復(fù)原性免疫細(xì)胞，增強(qiáng)人體免疫力。如果人體免疫能力強(qiáng)，就算被感染上病毒，也會(huì)將病毒的侵害降低到最低限度。美國(guó)著名的醫(yī)學(xué)專(zhuān)家古特曼博士這樣預(yù)測(cè)：“谷胱甘肽很快就會(huì)像膽固醇一樣，成為人們衡量健康指標(biāo)之一。1.1谷胱甘肽概述谷胱甘肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì)谷胱甘肽，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的生物活性三肽化合物[1]，廣泛存在于生物體內(nèi)的最豐富的非蛋白硫醇化合物[2]。其化學(xué)名為γ-L-谷氨酰-半胱氨酸-甘氨酸[3](英文名：γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，簡(jiǎn)寫(xiě)為GSH)，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示：圖1.1GSH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖Fig1.1Chemicalstructuralofglutathione1888年P(guān)ailbode首先發(fā)現(xiàn)GSH，1921年Hopkins[4]從酵母抽提物和動(dòng)物肝臟中首先別離得到GSH結(jié)晶并命名，1929年Hopkins、Kendall等提出GSH為三肽并初步提出它的結(jié)構(gòu)，1935年由Harington和Mead說(shuō)明其化學(xué)結(jié)構(gòu)并加以化學(xué)合成[5]，隨后在1936年被DuVigneaud和Miller驗(yàn)證[6]，1938年利用酵母制備GSH的最早專(zhuān)利發(fā)表。Bloch最早在肝臟中研究了GSH的生物合成，并證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)的GSH是由L-Glu、L-Cys和Gly在ATP的存在下，經(jīng)過(guò)γ-L-谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶催化的序貫反響合成的。如圖1-2所示[7]：圖1.2GSH細(xì)胞內(nèi)合成途徑Fig1.2IntracellularsynthesispathwaysofGSHGSH的相對(duì)分子量為307.33，熔點(diǎn)189～193℃，等電點(diǎn)為5.93，晶體呈無(wú)色透明細(xì)長(zhǎng)柱狀。比旋光度[α]EQ\S(20,D)為+17.60°(C=0.05，H2O)，它易溶于水、稀醇、液氨和N,N'-二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等有機(jī)溶劑。GSH在高水分活性下不易保存，只有將水分活性控制在0.3以下才能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。早在1921年，Hopkins首先發(fā)現(xiàn)GSH，它分為復(fù)原型GSH和氧化型GSSH兩類(lèi)[8]。通常人們所指的谷胱甘肽是復(fù)原型谷胱甘肽，GSH固體較為穩(wěn)定，但其水溶液在空氣中極易被氧化成GSSH。GSSH是由兩分子GSH經(jīng)氧化脫氫而形成的以二硫鍵連接的二聚體，一般以水合物的形式存在。它可以由谷胱甘肽復(fù)原酶利用NADPH作為電子供體復(fù)原成GSH，如圖1.3所示[9]:GSSH+NADPH+H+2GSH+NADP+圖1.3GSH與GSSG之間的相互轉(zhuǎn)換方程式Fig1.3TheinterconversionformulaofGSHandGSSG酵母細(xì)胞中氧化型和復(fù)原型谷胱甘肽之間的相互轉(zhuǎn)化過(guò)程，如圖1.4所示：圖1.4GSH與GSSG之間的相互轉(zhuǎn)換過(guò)程圖Fig1.4TheinterconversionprocessofGSHandGSSG谷胱甘肽的生理功能及其應(yīng)用單態(tài)氧、超氧化物陰離子、羥基離子、過(guò)氧化氫等物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為活性氧簇，(Reactiveoxygenspecies簡(jiǎn)稱(chēng)為ROS)[10]，即自由基。機(jī)體內(nèi)新陳代謝產(chǎn)生的許多自由基會(huì)損傷細(xì)胞膜，侵襲大分子，促進(jìn)機(jī)體衰老，并誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。GSH可作為抗氧化劑通過(guò)氧化復(fù)原反響系統(tǒng)去除自由基[11]，被稱(chēng)為長(zhǎng)壽因子和抗衰老因子。GSH分子中含有一個(gè)特異的γ-肽鍵，由谷氨酸的γ-羧基與半胱氨酸的α-氨基縮合而成，并且半胱氨酸側(cè)鏈基團(tuán)上連有一個(gè)活潑巰基，是GSH許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)根底。GSH這個(gè)積極的多肽化合物擁有著多功能的特性，被稱(chēng)為最重要的可自我產(chǎn)生的防衛(wèi)分子[12]，主要表現(xiàn)在三個(gè)方面：抗氧化劑[13]、提高免疫力[14]、高等真核生物有機(jī)體的解毒劑[15]等。GSH在臨床應(yīng)用上具體表現(xiàn)為：(1)保護(hù)肝臟，治療各種肝類(lèi)疾病[16]。GSH強(qiáng)大的復(fù)原作用使肝細(xì)胞膜對(duì)氧自由基的耐受性增加，從而使GSH具有促進(jìn)肝功能，保護(hù)肝細(xì)胞膜，提高肝臟酶的活性，加快黃疸的消退，增強(qiáng)肝臟解毒等功能，可用于輔助治療重型病毒性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝，對(duì)藥物性腎和肝損害也有保護(hù)作用[17]。(2)治療腫瘤，減輕化療和放療的副作用[18]。GSH能激活多種酶(如巰基-SH酶)，從而促進(jìn)糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝，并影響細(xì)胞的代謝過(guò)程，同時(shí)通過(guò)巰基與體內(nèi)自由基結(jié)合，可以轉(zhuǎn)化成容易代謝的酸類(lèi)物質(zhì)，從而加速了放化療產(chǎn)生的自由基的排泄。(3)解除中毒，減輕空氣污染和食物中的有毒成分對(duì)人體造成的傷害。GSH能與進(jìn)入機(jī)體的有毒化合物(如：丙烯腈、氟化物、CO)、重金屬離子等直接結(jié)合，并促其排出體外，起到中和解毒的作用[19]。(4)可以防止皮膚黑色素沉積，防止新的黑色素形成并減少其氧化[20]。(5)治療眼科疾病，特別是應(yīng)用于白內(nèi)障的治療[21]。GSH高濃度存在于眼組織的水晶體、角膜、視神經(jīng)、視網(wǎng)膜及睫狀體內(nèi)，有益于角膜或水晶體透明性的維持以及組織再生與修復(fù)。(6)其他功能。人體中如缺乏GSH可以引起肺部疾病、胃腸疾病、胰臟炎癥、神經(jīng)變性疾病、加速衰老等病癥[22]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，GSH的缺乏還會(huì)導(dǎo)致小兒惡性營(yíng)養(yǎng)不良癥、癲癇發(fā)作、帕金森綜合癥、囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞性貧血、人體免疫缺損病毒入侵、艾滋病、癌癥、心臟病、中風(fēng)、糖尿病等疾病[23]。因此GSH正代表著一個(gè)巨大的潛在價(jià)值在臨床治療戰(zhàn)略中發(fā)揮舉足輕重的作用[24]。1.2發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)由于GSH具有重要的生理功能和廣泛的市場(chǎng)前景，因此GSH的工業(yè)化生產(chǎn)越來(lái)越受到關(guān)注。GSH的生產(chǎn)方法主要有萃取法、化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法。其中發(fā)酵法是最具潛力的方法。利用特定微生物的代謝將廉價(jià)原料轉(zhuǎn)化為GSH的方法。即構(gòu)建GSH合成能力強(qiáng)和胞內(nèi)含量高的微生物，篩選和優(yōu)化培養(yǎng)組分，改良提取工藝，最終提高GSH的產(chǎn)率和質(zhì)量。自1938年實(shí)現(xiàn)了由酵母制備GSH以來(lái)，發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的工藝及方法不斷得到改良，且發(fā)酵使用的細(xì)菌或酵母容易培養(yǎng)，原料容易獲得，條件容易控制，因此發(fā)酵法已成為目前生產(chǎn)GSH最普遍的方法。目前實(shí)現(xiàn)GSH規(guī)模生產(chǎn)的國(guó)家是日本。世界主要的氨基酸制造商Kyowa、Aji-nomoto和Deguss等都相繼投巨資于氨基酸的研究與開(kāi)發(fā)，僅Kyowa1998年氨基酸的研究與開(kāi)發(fā)就消耗達(dá)1.9億美元，而GSH是其重點(diǎn)之一，Kyowa目前是GSH主要的供給商(中國(guó)發(fā)酵網(wǎng)〕。GSH市場(chǎng)需求較大，但由于酵母細(xì)胞的GSH含量較低(僅為細(xì)胞干重的0.5%～1.0%)、酵母用量大、收率低等缺點(diǎn)，現(xiàn)有生產(chǎn)能力不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，所以加緊對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的研究已成為國(guó)內(nèi)當(dāng)務(wù)之急。下面著重對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)：富含GSH菌種的選育、發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化與放大及GSH的別離提取工藝等詳述。一、菌種選育普通酵母菌體中GSH的含量一般不超過(guò)細(xì)胞干重的1.0%，但有一些酵母菌，如Saccharomycesglyoxalphilus、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)和Saccharomycescystinovolens、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其菌體內(nèi)GSH含量較高，且能長(zhǎng)時(shí)間保持合成GSH的能力[17]。Kimura等[25]采用亞硝基胍和紫外線(xiàn)誘變大腸桿菌B355，獲得高產(chǎn)GSH的優(yōu)良突變株，GSH的含量到達(dá)2.43mg/g。浙江工業(yè)大學(xué)賈建萍、裘娟萍[26]以編號(hào)為346的釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外線(xiàn)和60Co射線(xiàn)誘變處理，選育到1株抗氯化鋅和乙硫氨酸的突變株0.5Eth400-5，該菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵GSH產(chǎn)量到達(dá)165.96mg/L，較出發(fā)菌株提高350%，GSH的含量19.76mg/g，較出發(fā)菌株提高318.6%。陜西省微生物研究所詹谷宇等[27]在酵母菌的誘變育種中用GSH的代謝類(lèi)似物乙硫氨酸作為抗性篩選物，篩得抗代謝類(lèi)似物突變株KllUE126，其胞內(nèi)累計(jì)GSH的含量到達(dá)26.9mg/g，比出發(fā)菌株高出49.7%，這是我國(guó)目前通過(guò)常規(guī)誘變方法獲得的GSH含量最高的菌株。Kono等[28]用產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)紫外線(xiàn)、x射線(xiàn)或亞硝基胍作用，得到的蛋氨酸耐性突變株，再經(jīng)同樣處理，得到同時(shí)耐亞硫酸鹽和乙硫氨酸的變異株，其胞內(nèi)GSH含量可達(dá)4.0%，而出發(fā)菌株僅為0.52%。這是目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中GSH含量最高的。二、發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化及放大①培養(yǎng)基碳源日本學(xué)者Sakato[29]研究說(shuō)明，葡萄糖添加是工業(yè)化生產(chǎn)GSH的關(guān)鍵因素之一。通過(guò)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中溶氧和乙醇的濃度，運(yùn)用前饋/反響控制系統(tǒng)控制葡萄糖的流加速率，GSH產(chǎn)量到達(dá)2360mg/L，細(xì)胞內(nèi)GSH含量到達(dá)37mg/g，這是所查文獻(xiàn)報(bào)道中GSH產(chǎn)量最高的。Chi-Hsien等[30]認(rèn)為葡萄糖是啤酒酵母()生長(zhǎng)的最正確碳源，蛋白胨是最正確氮源。衛(wèi)功元，李寅等[31]針對(duì)假絲酵母的生長(zhǎng)特征以及GSH生物合成的要求，選擇葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉等物質(zhì)進(jìn)行考察，結(jié)果顯示C.utilisWSH02～08根本上不能利用乙酸和可溶性淀粉，葡萄糖更有利于促進(jìn)GSH的合成，且可以將胞內(nèi)GSH含量一直保持在較高水平。由于葡萄糖是速效碳源,它的初始濃度對(duì)GSH的積累非常重要，時(shí)麗萍，郭學(xué)武等[32]考察不同的葡萄糖初始濃度對(duì)酵母中GSH積累的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)初糖濃度逐漸升高時(shí)，生物量在增加，但GSH的含量卻在降低。GSH的產(chǎn)量和含量在葡萄糖初始濃度為30g/L時(shí)到達(dá)最高。饒志明，艾麗靜等[33]分別選擇葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉作為碳源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以甘油為碳源的培養(yǎng)基上，重組畢赤氏酵母的生物量及GSH含量均達(dá)最高值。經(jīng)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，重組酵母的GSH產(chǎn)量是98.5mg/L，為優(yōu)化前的2.33倍，生物量最大值到達(dá)19.6g/L。在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后GSH產(chǎn)量、重組菌的生物量分別為97.9mg/L，18.7g/L與搖瓶發(fā)酵結(jié)果根本吻合。江南大學(xué)陳堅(jiān)等[34]考察了葡萄糖濃度對(duì)面包酵母(Saccharomycescerevisiae)WSH-J發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響，結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)葡萄糖起始濃度超過(guò)12g/L時(shí)，胞內(nèi)GSH含量減少，葡萄糖總濃度為30g/L的發(fā)酵液中，GSH總量達(dá)90.2mg/L，而葡萄糖總濃度為10g/L時(shí)，發(fā)酵液中GSH總量?jī)H為65.6mg/L。應(yīng)用計(jì)算得出的一種以控制比生長(zhǎng)速率為目的的搖瓶補(bǔ)糖策略，在總糖濃度為26.2g/L下發(fā)酵12h，最終細(xì)胞胞內(nèi)GSH含量到達(dá)13.6mg/g，發(fā)酵罐內(nèi)GSH總產(chǎn)量到達(dá)119.4mg氮源氮源是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中的氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。GSH是一種含氮量(13.68%)較高的物質(zhì)，因此在生物合成GSH的過(guò)程中，適宜的氮源供給是非常必要的。時(shí)麗萍，郭學(xué)武等[32]分別考察了有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源對(duì)酵母積累GSH的影響，結(jié)果顯示，酵母粉為最適宜的有機(jī)氮源，可能是因?yàn)榻湍阜壑泻卸喾N生長(zhǎng)因子和氨基酸，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH的合成。酵母粉的添加對(duì)酵母的生長(zhǎng)和GSH的積累均有利。當(dāng)酵母粉的濃度超過(guò)9g/L時(shí)，對(duì)GSH的積累產(chǎn)生了一定的抑制作用。因此，最適的酵母粉添加濃度為9g/L。硫酸銨為最適的無(wú)機(jī)氮源，硫酸銨濃度為9g/L時(shí)，GSH的產(chǎn)量和含量明顯高于其他濃度，故此濃度為最適濃度。經(jīng)培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件優(yōu)化后GSH的產(chǎn)量為96.72mg/L，GSH含量為18.85mg/g，為初始含量的1.33倍。江南大學(xué)陳堅(jiān)等[34]考察了氨基酸和酵母膏的添加對(duì)面包酵母(S.cerevisiae)WSH-J發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響，結(jié)果說(shuō)明培養(yǎng)基中添加L-半胱氨酸、蛋氨酸能提高細(xì)胞內(nèi)GSH的含量；L-半胱氨酸的效果更顯著，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用；添加由L-半胱氨酸、谷氨酸與甘氨酸組成的混合物也能提高細(xì)胞胞內(nèi)GSH的含量。賀小賢，趙少欣等[35]通過(guò)正交試驗(yàn)，對(duì)啤酒酵母搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GSH的培養(yǎng)基的組成進(jìn)行研究，研究結(jié)果說(shuō)明，在蔗糖濃度2%、酵母膏濃度1%、(NH4)2SO4濃度0.6%、半胱氨酸濃度為4mmol/L時(shí)，優(yōu)化發(fā)酵條件，GSH產(chǎn)量可達(dá)248mg/L，比發(fā)酵條件優(yōu)化前提高了37%。Alfafara[36]等研究了半胱氨酸的補(bǔ)加策略，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，連續(xù)流加后期，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和GSH比生產(chǎn)速率皆下降，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中GSH含量與不加半胱氨酸相比，無(wú)顯著提高；而一次性補(bǔ)加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生產(chǎn)速率。北京化工大學(xué)譚天偉等[37]在S.cerevisiaeT65發(fā)酵生產(chǎn)GSH過(guò)程中，采取先參加半胱氨酸再參加谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸混合物的策略，含量到達(dá)1875mg/L，比不加谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸混合物的產(chǎn)量提高了55.2%。②培養(yǎng)條件時(shí)麗萍，郭學(xué)武等[38]對(duì)面包酵母BY-14產(chǎn)GSH的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，其最適的培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵時(shí)間22h，溫度28℃，接種量10%，裝液量50mL。在優(yōu)化的條件下，GSH的含量到達(dá)16.04mg/g，為初始條件下的1.48倍。衛(wèi)功元，李寅等[39]在7L發(fā)酵罐中研究了溶氧和pH對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母分批發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響。結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)葡萄糖濃度為30g/L且通氣量控制在5L/min時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速到達(dá)300r/min，即可滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)和GSH合成對(duì)溶解氧的需求。不同pH控制方式對(duì)GSH分批發(fā)酵的影響有較大差異。研究了將pH控制在4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的GSH分批發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在pH5.5時(shí)GSH總產(chǎn)量最高。同時(shí)研究了24～32℃范圍內(nèi)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)GSH的分批發(fā)酵過(guò)程，發(fā)現(xiàn)較高溫度(30℃)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而較低溫度(26℃)那么更有利于GSH產(chǎn)量的提高。采用兩階段溫度培養(yǎng)方式，用較高溫度(30℃)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，較低溫度(26℃)促進(jìn)GSH形成，GSH產(chǎn)量較26℃培養(yǎng)提高5%，較30℃培養(yǎng)提高了23%，GSH含量也上升到2.5%。③培養(yǎng)方式衛(wèi)功元，李寅等[40]考察了重復(fù)補(bǔ)料、恒速流加和指數(shù)流加等不同培養(yǎng)方式對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母中GSH發(fā)酵生產(chǎn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這幾種培養(yǎng)方式都可以實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞和GSH的高產(chǎn)。綜合比擬，無(wú)論是從細(xì)胞還是從GSH的產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度的角度來(lái)看，指數(shù)流加都是較為理想的選擇。經(jīng)過(guò)48h的指數(shù)流加培養(yǎng)，細(xì)胞干重到達(dá)40.9g/L，GSH產(chǎn)量和胞內(nèi)GSH含量分別到達(dá)857.2mg/L和2.25%。三、GSH的別離純化工藝GSH的粗提物進(jìn)一步別離純化的方法主要有4種：(1)銅鹽法，具有使用價(jià)值，但污染較大。(2)離子交換樹(shù)脂法Kimura等[41]發(fā)表的專(zhuān)利中報(bào)道了從大腸桿菌發(fā)酵液中提取GSH的方法，發(fā)酵液離心取菌體，破碎細(xì)胞，離心取上清液，用硫酸調(diào)節(jié)pH3.0，上陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如DiaionPK-228H.sup+，用0.5mol/l的氨水洗脫，洗脫液用硫酸調(diào)節(jié)pH到4.5，上陰離子交換樹(shù)脂如DuoliteA2CH3COO.sup-，用0.5mol/l的硫酸洗脫，參加50%的乙醇到洗脫液中得到GSH晶體。蔡俊，邱雁臨[42]對(duì)使用732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法提取GSH時(shí)的提取條件進(jìn)行了研究，確定最正確提取工藝條件上柱pH3.0，洗脫用氫氧化鈉濃度0.25mol/L，洗脫流速30cm/min，此條件下GSH的平均回收率為53.06%，產(chǎn)品GSH含量為2.953%?？梢灾频肎SH淡黃色晶體。邱雁臨，胡靜等[43]對(duì)大孔樹(shù)脂D001別離啤酒廢酵母中的GSH進(jìn)行了研究。其最正確試驗(yàn)條件為：pH4.5的0.02mol/L磷酸緩沖液平衡，pH7.5的0.02mol/L磷酸緩沖液洗脫，洗脫流速為2.0mL/min。在最正確別離條件下，大孔樹(shù)脂D001別離GSH的平均收得率為20.03%，產(chǎn)品中GSH的含量為28.47%，產(chǎn)品顏色為白色。趙睿，王滿(mǎn)意等[44]利用大孔苯乙烯樹(shù)脂改性合成含硫樹(shù)脂，考察了修飾條件對(duì)GSH吸附的影響，并對(duì)其在GSH別離中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。結(jié)果說(shuō)明采用pH3.0的緩沖液進(jìn)行吸附，自制的含硫樹(shù)脂最大吸附容量可達(dá)22mg/g濕樹(shù)脂。選擇質(zhì)量濃度為0.5%的NaOH溶液洗脫GSH，解吸率可達(dá)70%以上。采用真實(shí)發(fā)酵液進(jìn)行別離純化，收率為35%。蘇曉晉，王淼等[45]確定了GSH最正確的洗脫條件：先用pH3.0的去離子水洗滌柱子，直到洗滌液中無(wú)GSH和蛋白質(zhì)流出。再采用濃度為1.5%HCl溶液進(jìn)行洗脫，速度為0.5mL/min，最終的GSH回收率到達(dá)80.2%，蛋白質(zhì)去除率60%，GSH濃縮倍數(shù)達(dá)2.5倍(頂峰時(shí)到達(dá)8.3倍)，純化倍數(shù)為3.9倍，獲得了良好的別離效果。(3)電滲析法TakeshiGotoh[46]等用電滲析法從酵母提取液中別離GSH，由于GSH在堿性條件下易于被氧化，電滲析是在pH值3～6進(jìn)行，克服了GSH的不穩(wěn)定性。(4)雙水相分配結(jié)合溫度誘導(dǎo)相別離可以省去細(xì)胞破碎后的固液別離操作，并且利用溫度誘導(dǎo)相別離能實(shí)現(xiàn)聚合物的循環(huán)利用。梅樂(lè)和等選用環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷無(wú)規(guī)共聚物(EOPO)/羥丙基淀粉(PES)雙水相系統(tǒng)，在EOPO400013%，PES10010%，pH10.5的條件下，結(jié)合溫度誘導(dǎo)相別離技術(shù)從酵母細(xì)胞中提取GSH，GSH的總萃取率達(dá)80%以上，但因雙水相組成系統(tǒng)一般比擬昂貴，此法目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。1.3本研究的意義、目的及內(nèi)容意義GSH具有去除自由基、維持DNA生物合成、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收、維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、維持紅細(xì)胞的完整性、細(xì)胞免疫等生理功能。在臨床應(yīng)用上，主要表現(xiàn)在肝炎治療、減輕化療副作用、有機(jī)物及重金屬的解毒、抗過(guò)敏、眼疾病的改善等作用。在化裝品領(lǐng)域中，它有抗衰老、增白、祛斑等作用。在食品加工領(lǐng)域，GSH具有防褐變、使食品增鮮、營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)等成效。日本早在1985年就取得了中國(guó)衛(wèi)生部的原料藥進(jìn)口許可證號(hào)，根本壟斷中國(guó)市場(chǎng)。目前GSH的主要生產(chǎn)廠家有美國(guó)的Sigma、JTBaker、Fluka等公司，日本有協(xié)和公司、和光純藥公司等，德國(guó)有默克和BDH公司等。實(shí)現(xiàn)GSH的國(guó)產(chǎn)化，不僅可以改變我國(guó)GSH原料藥依賴(lài)進(jìn)口的局面，而且對(duì)我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)均具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。目的研究目的：在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的根底上，用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的富含GSH的啤酒酵母Y-14進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)GSH工藝的優(yōu)化及放大試驗(yàn)、采用離子交換法及凝膠雙柱精制GSH的方法，最終到達(dá)提高GSH的回收率及產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

研究?jī)?nèi)容1、利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)富含GSH啤酒酵母Y-14搖瓶發(fā)酵GSH工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用SAS軟件進(jìn)行回歸分析確定發(fā)酵培養(yǎng)基最正確組成成分。2、利用單因素試驗(yàn)對(duì)啤酒酵母Y-14生產(chǎn)GSH發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定搖瓶發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速及裝液量的最優(yōu)值。3、將上述最正確試驗(yàn)條件運(yùn)用到10L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)GSH的擴(kuò)大重復(fù)試驗(yàn)當(dāng)中，以確定最有利于工業(yè)生產(chǎn)的試驗(yàn)方案。4、以GSH吸附率、GSH回收率、蛋白質(zhì)去除率、濃縮倍數(shù)、純化倍數(shù)為主要指標(biāo)，研究確定大孔樹(shù)脂D001別離GSH的最適上樣濃度、上樣pH、上樣流速、洗雜質(zhì)用液種類(lèi)、洗脫液種類(lèi)與濃度及洗脫流速。后采用SephadexG-10凝膠雙柱精制GSH，研究最適的脫鹽上樣體積與濃度，分級(jí)別離上樣體積，到達(dá)較理想的GSH純化效果。1.4常用研究指標(biāo)的說(shuō)明為了防止重復(fù)，在此對(duì)本論文所用到的各項(xiàng)研究指標(biāo)進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明。菌體胞內(nèi)GSH的含量：表示每克干菌體胞內(nèi)GSH的含量，簡(jiǎn)稱(chēng)GSH含量，單位為mg/g；GSH的產(chǎn)量：表示每升發(fā)酵液中總干菌體胞內(nèi)GSH的含量，簡(jiǎn)稱(chēng)GSH產(chǎn)量，單位為mg/L；生物量：表示每升發(fā)酵液中菌體烘干后的重量，單位為g/L。GSH產(chǎn)量〔mg/L〕=GSH含量〔mg/g〕×生物量〔g/L〕

第2章啤酒酵母Y-14發(fā)酵GSH培養(yǎng)基的優(yōu)化生產(chǎn)GSH的酵母大都是工業(yè)常用菌株，這些菌株能在寬松的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)并積累GSH，但產(chǎn)量往往很低。在實(shí)際的發(fā)酵生產(chǎn)中，選育性能優(yōu)良的菌種僅僅是一個(gè)開(kāi)始，還需要對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化控制，最大限度地發(fā)揮其生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的能力。要想進(jìn)一步提高菌株的生物量和胞內(nèi)合成GSH能力，必須對(duì)培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化，確定適合菌株生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基。一些試驗(yàn)設(shè)計(jì)(如正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、因次分析設(shè)計(jì)、中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)等)及數(shù)據(jù)處理方法(如Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型)的應(yīng)用可以減少工作量并且使試驗(yàn)結(jié)果具有更高的可信度和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。Udeh和Achremowics考察了培養(yǎng)基中的主要成分(葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、生物素和半胱氨酸)濃度的變化對(duì)酵母S.cerevisiaeS-8H細(xì)胞形成和胞內(nèi)GSH含量的影響，采用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CentralCompositionExperimentalDesign)方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到GSH產(chǎn)量為160.1mg/L，胞內(nèi)GSH含量到達(dá)1.7%，與優(yōu)化前的情況相比提高近一倍[47]。李寅[48]等采用正交試驗(yàn)獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)模型(NeuralNetworkModel)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，對(duì)C.utilisWSH02～08發(fā)酵生產(chǎn)GSH的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，搖瓶條件下GSH胞內(nèi)含量達(dá)2.5%，GSH產(chǎn)量和細(xì)胞干重也有大幅度的提高。本章以啤酒酵母Y-14獲得GSH的產(chǎn)量為指標(biāo)，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響GSH生產(chǎn)的14個(gè)營(yíng)養(yǎng)因素進(jìn)行考察，再用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)一步優(yōu)化，對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行擬合，利用SAS(version9.0,SASInstituteIne,Cary,NC,USA)處理分析，確定最后的優(yōu)化結(jié)果。2.1材料2.1.1菌種：啤酒酵母Y-14，由XXXX大學(xué)工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室再生資源微生物轉(zhuǎn)化研究室提供。2.1.2培養(yǎng)基：.1斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，瓊脂20，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.2種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.3原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，酵母膏5，(NH4)2SO47.5，KH2PO43，MgSO40.15，水1000mL，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。2.1.3主要試劑葡萄糖AR廣州化學(xué)試劑廠蛋白胨BR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑牛肉浸膏BR上海長(zhǎng)陽(yáng)生化制藥廠(NH4)2SO4AR北京益利精細(xì)化學(xué)品MgSO4·7H2OAR金山縣興塔化工廠KH2PO4AR湖州化學(xué)試劑廠DTNBARSigma，武漢新銳生物分裝98%GSHARSigma，武漢新銳生物分裝2.1.4主要儀器GW-722型可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密儀器303-2電熱培養(yǎng)箱上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠HS80A恒溫?fù)u床中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠320-SpH計(jì)梅特勒-托利多(上海)電子分析天平奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)15W紫外燈順德市展達(dá)電器廠CS101-2電熱鼓風(fēng)枯燥箱中華人民共和國(guó)重慶試驗(yàn)儀器設(shè)備廠珍珠牌凈化工作臺(tái)中華人民共和國(guó)蚌埠汽化設(shè)備廠2.2方法2.2.1菌株活化從保藏斜面中取一環(huán)菌種劃線(xiàn)于新鮮斜面培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。種子搖瓶培養(yǎng)用接種環(huán)取一滿(mǎn)環(huán)已活化的菌種于種子培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖瓶裝量50mL/250mL條件下培養(yǎng)18h。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)用無(wú)菌的5mL移液管按10%的接種量吸取種子液3mL，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖瓶裝量30mL/300mL條件下發(fā)酵48h。菌種的保藏菌種接于斜面培養(yǎng)基上4℃冰箱保藏。DTNB法檢測(cè)GSH含量[49]取樣液2mL，參加0.4mol/L，pH7.0的磷酸緩沖液2.5mL，1.0mmol/LDTNB顯色劑0.5mL，反響數(shù)分鐘后顯色穩(wěn)定后于412nm處用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。2.2.6試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法1)Plackett-Burman設(shè)計(jì)[50]對(duì)影響GSH生產(chǎn)的14個(gè)營(yíng)養(yǎng)因素進(jìn)行考察,每個(gè)因素取2個(gè)水平，各因素及其水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，表2中每行代表1個(gè)試驗(yàn)，每列代表1個(gè)獨(dú)立的變量，符號(hào)“+〞和“-〞分別代表高和低2個(gè)不同的水平。2)Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基成分的進(jìn)一步優(yōu)化[51]對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出的有較大影響因素，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)一步的優(yōu)化。每個(gè)因素取3個(gè)水平，在中心點(diǎn)上有3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)多項(xiàng)式回歸分析得到一個(gè)關(guān)于響應(yīng)值與自變量關(guān)系的二階模型，該方程即為描述響應(yīng)量(應(yīng)變量)和自變量(操作條件)關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?)對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行擬合，便可以得到模型中的各個(gè)系數(shù)。再對(duì)該多元函數(shù)進(jìn)行分析便可確定出其極值點(diǎn)以及取得極值的相應(yīng)的自變量的取值。最后按照計(jì)算所得到的參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證模型的可靠性，確定最后的優(yōu)化結(jié)果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SAS(version9.0,SASInstituteIne,Cary,NC,USA)處理分析。2.3結(jié)果與分析2.3.1顯著影響因素的篩選結(jié)果根據(jù)啤酒酵母生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)要素并結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，試驗(yàn)選取的影響因素(變量)共14個(gè)，表2.1列出了14個(gè)營(yíng)養(yǎng)因素的編號(hào)及水平，A-N編碼了14個(gè)因素，表2.2列出了Plackett-burman設(shè)計(jì)的不同培養(yǎng)基，標(biāo)號(hào)為1-16，每行代表1個(gè)試驗(yàn)，按照設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)表2.2。表2.1Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平Tab2.1ThefactorsandlevelsofvariablesusedinthePlackett-Burmandesign試驗(yàn)因素代碼-(-)低水平〔g/L〕(+)高水平〔g/L〕酵母膏X139蔗糖X2010蛋白胨X3010K2HPO4X426酪蛋白X5010葡萄糖X6010MgSO4X70.10.3麥芽糖X8010NaClX926(NH4)2SO4X10412乳糖X11010可溶性淀粉X12010Cacl2X1303尿素X14010表2.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab2.2ExperimentaldesignandresultsofPlackett-BurmanX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14Y**1-1-1-1-11-1-11-111-11130.8721-1-1-1-1-11111-111-168.583-11-1-1-11-111-111-1150.25411-1-11111-1-1-1-1-1-182.085-1-11-1-111-1-1111-1-177.6461-11-111-1-111-1-1-1190.67-111-11-11-11-11-11-125.548111-1-1-1-1-1-1-1-111149.879-1-1-11-111-11-1-1-11155.07101-1-1111-1-1-1-1111-170.4911-11-111-11-1-11-11-1168.751211-11-1-1-1-1111-1-1-170.8313-1-1111-1-111-1-11-1-140.46141-111-1-111-1-11-1-1175.3815-1111-11-11-11-1-11-190.871611111111111111121.2注：Y**表示GSH產(chǎn)量，單位為mg/L。表2.3Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)的的回歸系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Tab2.3RegressioncoefficientsandtheirsignificancetestofPlackett-BurmandesignEffectEstimateStdErrortRatioPValueX123.7041.548715.3050.0415X26.29831.54874.06380.1536X39.33631.54876.02820.1047X414.7091.54879.49720.0668X5-1.05621.5487-0.6820.6190X625.9661.548716.7850.0379X710.0061.54876.46090.0978X86.36881.54874.11220.1519X9-2.92131.5487-1.88620.3103X1021.2811.548713.7410.0462X11-3.00371.5487-1.93950.3031X123.25621.54872.10250.2826X13-5.43131.5487-3.50690.1768X141.94371.54871.2550.4283利用SAS軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2.3，Pr>F值(P值)的大小說(shuō)明模型及各個(gè)考察因素的顯著水平。Pr>F值小于0.05說(shuō)明模型或各因素有顯著影響，Pr>F值小于0.01表示影響高度顯著。其中X1，X6，X10是有意義的模型參數(shù)，因?yàn)镻r>F值均小于0.05。所以對(duì)應(yīng)的因素葡萄糖，酵母膏和(NH4)2SO4對(duì)GSH的產(chǎn)量具有顯著性的影響，而其它的因素顯著性較小。2.3.2Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果以主要影響GSH產(chǎn)量的葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的濃度(g/L)為自變量，各因素編碼水平如表2.4所示。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果如表2.5所示。表2.4Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Tab2.4ThefactorsandlevelsofvariablesusedinBox-Behnkendesign試驗(yàn)因素代碼編碼水平/(g/L)-10+1葡萄糖X1102030酵母膏X251015(NH4)2SO4X34810表2.5Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Tab2.5ExperimentaldesignandresultsofBox-Behnken試驗(yàn)編號(hào)X1X2X3Y**1-1-1078.652-11085.0331-1089.58411095.8150-1-176.3160-1172.83701-197.78801187.929-10-180.151010-190.0511-10173.231210189.5613000123.2914000123.5815000124.77采用國(guó)際權(quán)威的SAS軟件回歸擬合表試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得到二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑閅=123.6267+5.9925×X1+6.14625×X2-2.59375×X3-18.41083×X1×X1-17.94833×X2×X2-21.96833×X3×X3式中，Y代表GSH產(chǎn)量，X1、X2、X3分別代表培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的濃度(g/L)。通過(guò)SAS軟件進(jìn)行方差分析來(lái)驗(yàn)證回歸模型及各參數(shù)的顯著度，結(jié)果見(jiàn)表2.6，模型Pr>F值為0.000763，說(shuō)明該模型是高度顯著的。經(jīng)F檢驗(yàn)，模型中的參數(shù)X1，X2，X1X1，X2X2，X3X3都是顯著的(Pr>F值小于0.05)。同時(shí)，軟件分析得到模型的決定系數(shù)R2為98.21%，大于90%，修正決定系數(shù)Adj.R2為94.99%，能對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行較好的擬和，說(shuō)明模型相關(guān)度很好。變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高,本試驗(yàn)的CV值為4.293957%，說(shuō)明模型方程能夠很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。表2.6回歸方程的方差分析Tab2.6Varianceanalysisoftheregressionequation方差來(lái)源自由度平方和均方F值Pr>FX11287.2804287.280418.202540.007966X21302.2111302.211119.148570.007182X3153.8203153.820313.4101390.124081X1×X111251.541251.5479.299540.000297X1×X210.0056250.0056250.0003560.985668X1×X3110.3362310.336230.6549190.455129X2×X211189.451189.4575.36540.000335X2×X3110.176110.17610.6447740.458441X3×X311781.9361781.936112.90630.000128Model94331.44481.271230.494090.000763一次項(xiàng)3643.3119214.437313.587080.007718二次項(xiàng)33667.6111222.53777.461850.00013交叉項(xiàng)320.517956.8393170.433350.738594殘差項(xiàng)578.9121915.78244失擬項(xiàng)378.6497326.21658199.77070.004985誤差20.2624670.131233和144410.353R-square98.21%Adj.R-square94.99%RMSE3.972712%CV4.293957%在保持1個(gè)因素為零水平下，其它2個(gè)因素與響應(yīng)值關(guān)系用三維坐標(biāo)圖2.1表示，直觀地反響了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響關(guān)系。在最優(yōu)條件下：葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4分別為20g/L、10g/L、8g/L時(shí)，預(yù)測(cè)GSH最大產(chǎn)量為124.80mg/L。為驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性和有效性，在預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)(重復(fù)3次)，得到GSH產(chǎn)量分別為123.58mg/L、121.65mg/L、124.77mg/L。可見(jiàn)該模型能較好預(yù)測(cè)發(fā)酵所產(chǎn)GSH產(chǎn)量。因此，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15Fixedlevels：X1=0Fixedlevels：X2=0Fixedlevels：X3=0圖2.1GSH產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖Fig2.1ResponsesurfaceanalysisofGSHyield2.4結(jié)論P(yáng)lackett-Burman設(shè)計(jì)法是一種經(jīng)濟(jì)且有效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它能快速、有效地從眾多因子中篩選出能促進(jìn)啤酒酵母Y-14高產(chǎn)GSH的因子；響應(yīng)面法(RSM)能快速對(duì)主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，并能得到各因素最正確組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4是影響啤酒酵母Y-14高產(chǎn)GSH的關(guān)鍵因子，進(jìn)而用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,得到的最適培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15g/L。對(duì)優(yōu)化配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)

第3章啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH發(fā)酵條件的優(yōu)化為了使菌株進(jìn)一步提高GSH的合成能力，僅確定最正確培養(yǎng)基成分是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還必須對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為最終的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。影響發(fā)酵產(chǎn)量的環(huán)境參數(shù)主要有溫度、pH、溶解氧等。溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)、酶活性都有直接的影響。pH影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收及代謝途徑，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)及GSH積累。GSH發(fā)酵過(guò)程中氧的供給是個(gè)關(guān)鍵因素，溶氧濃度是微生物生長(zhǎng)和GSH形成率的重要參數(shù)之一。國(guó)內(nèi)對(duì)面包酵母和重組大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH值、搖瓶裝液量等環(huán)境條件的影響已有較多研究，但GSH的產(chǎn)量均值仍不理想。另?yè)?jù)研究說(shuō)明，添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸等三種前體氨基酸及其混合物能提高細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，其中以L-半胱氨酸的效果更為顯著。Miyamoto等[52]在利用甲醇作為碳源培養(yǎng)S.cerevisiaeIAM4207進(jìn)行GSH發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中添加L-半胱氨酸可以使胞內(nèi)GSH含量大幅度提高，Watanabe等[53]發(fā)現(xiàn)，在S.cerevisiae生長(zhǎng)穩(wěn)定期之前添加混合氨基酸有利于GSH的積累。Alfafara[54]考察了S.cerevisiae搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GSH過(guò)程中這三種前體氨基酸對(duì)GSH合成的影響，結(jié)果說(shuō)明，一次性補(bǔ)加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生產(chǎn)速率。本章在前一章發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選試驗(yàn)的根底上，利用單因素試驗(yàn)分別研究了啤酒酵母Y-14發(fā)酵最適溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量及添加前體氨基酸和ATP對(duì)GSH產(chǎn)量的影響，并確定其最優(yōu)發(fā)酵條件。3.1材料3.1.1菌種：啤酒酵母Y-14，由XXXX大學(xué)工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室再生資源微生物轉(zhuǎn)化研究室提供。3.1.2培養(yǎng)基：.1斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，瓊脂20，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.2種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.3發(fā)酵培養(yǎng)基〔g/L〕葡萄糖20，酵母膏10，(NH4)2SO48，KH2PO43，MgSO40.15，水1000mL，0.115MPa滅菌15min。.4補(bǔ)料培養(yǎng)基L-谷氨酸10mmol/L，甘氨酸6mmol/L，L-半胱氨酸10mmol/L，ATP1.67μg/mL。主要試劑L-谷氨酸BR中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司L-半胱氨酸AR武漢市華順生物技術(shù)甘氨酸BR中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司ATPBR上海源聚生物科技3.1.4主要儀器同第2章。3.2方法3.2.1啤酒酵母Y-14生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)560nm波長(zhǎng)下，每隔2小時(shí)測(cè)定一次菌懸液的OD值，以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制其生長(zhǎng)曲線(xiàn)。3.2.2發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)啤酒酵母Y-14連續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，后每隔8小時(shí)取樣測(cè)量生物量及GSH產(chǎn)量。3.2.3發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)在其他發(fā)酵條件不變時(shí)，考察了當(dāng)溫度分別為25℃、28℃、30℃、32℃、35℃時(shí)，發(fā)酵60h時(shí)，啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。3.2.4發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗(yàn)在其他發(fā)酵條件不變時(shí)，考察了當(dāng)pH值分別為4.5、5、5.5、6、6.5、7時(shí)，啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。3.2.5發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn)在其他發(fā)酵條件不變時(shí)，考察了當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速分別為120rpm、150