熒光定量PCR技術(shù)專題課件

熒光定量PCR儀技術(shù)內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實驗方案的選擇及SYBR法實驗流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測熒光定量PCR原理－－定義同一個樣品重復(fù)96次起點定量與終點定量終點定量起點定量起始DNA量是樣本中本來的量，更有意義； 終點DNA量經(jīng)過PCR“加工”，不是研究所需要的數(shù)據(jù)起點定量誤差小，終點定量誤差大

擴增曲線熒光閾值

Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLg－linerphase平臺期熒光基團熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴增曲線Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLg－linerphase

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段

真正的信號:熒光信號超過閾值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光閾值平臺期熒光閾值基線范圍閾值標(biāo)準(zhǔn)偏差基線信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差x10Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值Ct值熒光信號有統(tǒng)計學(xué)意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Ct值半對數(shù)圖譜Ct值線性圖譜橫軸：PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進(jìn)行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性Ct值的重現(xiàn)性CT值基線閾值基線調(diào)整規(guī)則如果Ct值>18，不需調(diào)整，使用自動分析結(jié)果如果Ct值<18，修改基線終點，再分析一次起點：進(jìn)口試劑取3，國產(chǎn)試劑取6終點：最小的Ct值–4，通常為15長度：大于或等于6個循環(huán)基線閾值Ct值實驗結(jié)束，軟件根據(jù)默認(rèn)值的基線(3-15)自動分析，給出結(jié)果和圖譜如果Ct值>18，使用自動分析結(jié)果，出報告如果有Ct值<18，根據(jù)[最小的Ct值-4]修改基線終點，重新分析數(shù)據(jù)手工數(shù)據(jù)分析方法理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)En：擴增效率熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理在擴增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：熒光擴增信號達(dá)到閾值時擴增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，定為M方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：Log2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系Ct值與模板起始量的關(guān)系Ct值lg起始DNA濃度CT=-klgX0+b標(biāo)準(zhǔn)曲線方法標(biāo)準(zhǔn)品未知樣本PCR方程只在指數(shù)期成立Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期平臺期y=x(1+e)n指數(shù)增長期Ct值和閾值必須位于指數(shù)增長階段內(nèi)線性關(guān)系、擴增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)Notemplatecontrol確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率:-3－-3.535Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)PCR擴增效率（E）:0.9-1.2內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實驗方案的選擇及SYBR法實驗流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南非特異性熒光標(biāo)記

SYBRGreenI

SYBRGreenⅡ特異性熒光標(biāo)記

TaqManProbe常用熒光標(biāo)記方法熒光染料法——原理

目前常用的熒光染料有SYBRGreenⅠ、SYBRGreenⅡ、SYTO9、HRM等。其共同性質(zhì)為：（a）結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處（b）與雙鏈DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光（c）在變性條件下雙鏈分開，熒光消失SYBRGreenI熱變性引物退火延伸反應(yīng)熒光染料法——作用機理問題點：熒光染料與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。熒光染料法——問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵點：

設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增！

使用熒光染料作為熒光基團時，由于熒光染料的特性隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，SYBRGreenⅠ/Ⅱ與雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越來越強，當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束時，熒光強度達(dá)到最大，此時對PCR產(chǎn)物進(jìn)行緩慢加熱，從50℃一直加熱到99℃，在此過程中PCR產(chǎn)物按照TM值的大小雙鏈被依次打開，熒光強度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：熒光染料法——融解曲線將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜導(dǎo)數(shù)圖譜熒光染料法——融解曲線融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確只有染料法才需要做熔解曲線探針法沒有必要雙鏈核酸的熔解曲線分析熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈，在一定的離子強度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不同，所以通過熔解曲線，能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染料，核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異，通過熔解曲線也能分析出來。

成本低，不必設(shè)計復(fù)雜探針

適合初步篩查：先用SYBR篩查，再用探針法精確定量少數(shù)關(guān)鍵樣品熔解曲線：鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體優(yōu)點

無模板特異性：不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號對引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量：每孔只能檢測一個目標(biāo)基因靈敏度相對較低：適合于5000拷貝以上的基因定量缺點熒光染料法——優(yōu)缺點Taqman探針法——原理

5′端標(biāo)記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針,熒光產(chǎn)生。Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探針的設(shè)計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20s60℃，30-60s（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：100-900nM探針濃度：50-300nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立

高度特異性重復(fù)性好靈敏度高可進(jìn)行多重定量優(yōu)點

只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價格較高不易找到本底低的探針缺點Taqman探針法——優(yōu)缺點

標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑實時熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)FRET實時熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)高特異性：對目標(biāo)序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點

只能用于一個特定目標(biāo)設(shè)計困難價格比較高缺點實時熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)

幾種方法的應(yīng)用比較方法優(yōu)點缺點適用范圍SYBRGreen染料法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好價格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標(biāo))高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計困難價格高特定基因分析SNP分析

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，

GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗證等熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實驗方案的選擇及SYBR法實驗流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南絕對定量解析方法Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量一個目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本

——用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實驗結(jié)果顯示——擴增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線（探針法不需要）。絕對定量分析幾要素拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計算相對定量解析方法相對定量分析方法比較兩個或兩個以上樣本中某個基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點：基因的相對表達(dá)量，而不是基因的絕對量！一個參照樣本一個或一個以上的未知樣本一個目的基因內(nèi)參基因——用來校對不同樣本之間目的基因的實際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實驗結(jié)果顯示——擴增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）相對定量分析幾要素內(nèi)參基因

實驗操作中，由于樣品選取時樣品的細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同，RNA提取時得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會用一些內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。內(nèi)參基因是在各種生理條件下表達(dá)量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作內(nèi)參照，如：GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。相對定量分析——內(nèi)參基因篩選篩選方法

根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實驗篩選geNorm內(nèi)參分析軟件選擇相對定量分析——內(nèi)參基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

根據(jù)實驗的實際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析——兩種常用的分析方法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法就是對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)。相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果內(nèi)參基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需對目的基因和內(nèi)參基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實驗。相對定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測樣品內(nèi)參基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實驗數(shù)據(jù)公式：F=2－相對定量分析——2－△△Ct法

前提條件：目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相同且都為1，在試驗開始前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴增效率的差別，假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中，無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用：特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。待測組目的基因平均Ct值待測組內(nèi)參基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組內(nèi)參基因平均Ct值－－－內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法實驗方案的選擇及SYBR法實驗流程熒光定量產(chǎn)品選擇指南一、實驗方案的選擇熒光定量PCR實驗方案熒光染料法Taqman探針法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2--△△Ct法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2--△△Ct法

熒光定量PCR實驗方案的選擇（1）染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。（2）探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達(dá)幾十個拷貝)及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。（3）雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求較高的實驗。（4）2-△△Ct法適合檢測精度要求一般，樣品量相對較少，檢測的基因種類相對較多的實驗。根據(jù)實驗的實際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、經(jīng)費情況等來選擇合適的實驗方案。二、SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備定量體系配備引物設(shè)計反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機濃度確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計檢測電泳檢測RT反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析上機AMVM-MLVQuant下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項定量體系配備引物設(shè)計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復(fù)＜4個無二級結(jié)構(gòu)擴增長度：100－200bp反應(yīng)體系優(yōu)化上機反應(yīng)條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產(chǎn)物長度決定反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化Mg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)擴增效率：90％－110