第五章 基因的重組及轉移

外源DNA載體DNA重組分子原核細胞真核細胞擴增或表達表達連接轉化或轉導電穿孔或顯微注射受體細胞第五章

基因的重組與轉移

一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第一節(jié)

DNA片段的體外連接1.兩段DNA的連接依靠粘性末端2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端ligasenick二、齊平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

1972年，斯坦福大學的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端轉移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。②加尾—堿基互補④缺點：③優(yōu)點：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內切酶識別位點序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用

④缺點：1）可以用內切酶把插入片段切下來。如果插入片段內部也有該酶位點，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點：（3）DNA接頭

(adapter)連接法1978年康內爾大學的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點：連上后就能用。④缺點：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP處理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。三、PCR產物的連接1.在引物的5’端設計酶切位點符合載體的多克隆位點；（1）設計原則（2）帶酶切位點的引物的結構3’端15~20bp與模板互補；5’端6~10bp是某個內切酶的識別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護堿基）避免與所擴增的DNA片斷內部酶切位點重復。引物1GCAGAATTC

互補序列模板EcoRI位點5’--3’

GCAGAATTC

互補序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互補序列

PCR產物5’--3’

3’

復性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補序列模板BamHI位點-5’

3-’

5’

復性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互補序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR產物

互補序列-5’

3’-引物2帶酶切位點的PCR產物GCAGAATTC

PCR產物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR產物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點BamHI位點AATTC

PCR產物5’--3’

GCTAG

PCR產物-5’

3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！2.與T載體直接連接（1）PCR產物兩個3’端一般都有一個ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個3’端人為地各加一個T利用TaqDNA聚合酶，當原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產物TATA四、DNA體外連接應注意的事項插入片斷與載體的酶切位點互補相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進行非粘性末端連接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產生GATC4個堿基的粘性末端。2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’

3’

載體插入片斷1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個載體與幾個插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結果5.幾個載體與一個插入片段重組（能存活）171.目的增加受體菌細胞膜的通透性。第二節(jié)

重組體導入細菌細胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸二、重組DNA導入大腸桿菌（1）轉化（transformation)大腸桿菌捕獲質粒DNA的過程。（2）轉染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導入細菌的幾種方法（3）轉導（transduction)借助噬菌體把外源DNA導入細菌的過程。每gDNA轉化成功的細菌克隆數(shù)。3.轉化方法

2.轉化率簡單，但轉化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉化法10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100L轉化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L

電轉儀調為2.5kV,25F

脈沖控制器200-400

0.5g質粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉化液涂含抗菌素的平板轉化（2）電轉化法4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌10-100L轉化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜環(huán)形重組質粒質粒自我連接線性載體或DNA片斷進入細菌會被降解。①環(huán)形質粒數(shù)（1）重組質粒

5.影響轉化率的因素①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細菌細胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細胞

（competentcells)把重組的噬菌體DNA或Cosmid質粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉導（1）體外包裝（invitropackaging）

（2）轉導（transduction）通過受體菌細胞表面的DNA接受器位點（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進行擴增。cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細菌后，在32℃下培養(yǎng)細菌時能夠保持溶源性。但當溫度升高到44℃—45℃時，就會導致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個突變，所以細菌還不裂解。cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉錄、不翻譯）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA轉錄、翻譯合成外殼蛋白32℃噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（4）

互補型噬菌體

外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2(5)體外包裝過程

體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

轉導

轉化率高的菌株；有突變的菌株（與導入的載體基因互補）；不育的菌株（不會與其他酵母接合）。第三節(jié)

外源基因導入真核細胞一、導入酵母細胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1）利用原生質球進行轉化2.酵母的轉化方法

酵母原生質體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細胞壁具有通透性，允許DNA進入。CaCl2使細胞膜具有通透性，允許DNA進入。

轉化

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進行轉化葉盤消毒切取土壤農桿菌浸泡看護培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導入植物細胞1.葉盤法（leafdisk)植物細胞原生質體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electropo