分子生物學(xué)第09章DNA分子標記技術(shù)

9.1基于Southern雜交技術(shù)的分子標記9.2隨機（或半隨機）引物分子標記技術(shù)9.3序列標志位點技術(shù)9.4分子標記的應(yīng)用領(lǐng)域9DNA分子標記技術(shù)DNA分子標記的定義

DNA分子標記就是在同一物種不同個體間DNA序列上的差異，某一特定的差異可以通過實驗的方法檢測出來，測出來的特定差異就是特定的DNA分子標記。利用不同的實驗方法可以得到許許多多的DNA分子標記，這些DNA分子標記表明了這些個體間遺傳物質(zhì)上的差異。遺傳標記的發(fā)展形態(tài)標記→

細胞學(xué)標記（染色體多態(tài)性）→

蛋白質(zhì)標記（同工酶，分子標記）→

DNA標記（分子標記）RFLP

分析

RFLP（restrictionfragmentlengthpoly-morphism）稱為限制性片段長度多態(tài)性。當(dāng)用某種限制性內(nèi)切酶處理不同生物個體來源的DNA時，由于個體間DNA序列的差異，所產(chǎn)生的切割片段長度和數(shù)量可能不同，利用凝膠電泳可以將這些片段分離并觀察到差異，這種差異就是RFLP。RFLP

分析

RFLP產(chǎn)生的差異帶可以作為分子標記，用于遺傳學(xué)的研究。當(dāng)一個生物有多條染色體，且DNA分子很大時，用一種限制性內(nèi)切酶切割出的DNA片段太多，電泳后的條帶無法分辨。

使用某一特定序列的標記探針，與電泳分離的片段進行Southern雜交，再顯示出雜交帶，可以大大減少被觀察條帶的數(shù)目，便于不同生物個體間的比較和找出差異帶。RFLP

分析

換不同的限制性內(nèi)切酶切割，配合不同的標記探針，可以得到數(shù)目多得驚人的條帶，從而找到很多的分子標記。這些分子標記與表型標記一樣，可以用于遺傳學(xué)的研究。但分子標記沒有顯隱性之分，都是共顯性的。采用一種探針

作6

個栽培品種的RFLP分析RFLP所用探針的來源

RFLP分析的效率依賴于選擇合適的探針。由于用能探測重復(fù)序列的探針探測出的片段太多，難以比較，所以探針一般來自單拷貝或低重復(fù)序列。常用的RFLP探針主要來源于隨機基因組克隆和cDNA克隆。RFLP所用探針的來源

由于基因組DNA中甲基化一般很少在表達基因中發(fā)生，故用對甲基化敏感的限制酶切，可得到長度為1～2kb的DNA片段，它們是單拷貝或低重復(fù)序列，用這些片段制成文庫，即可用作RFLP探針。

如果用cDNA克隆作探針，最好制備來自生物整體mRNA的cDNA文庫。RFLP標記的共顯性什么是多態(tài)性

多態(tài)性是在不同個體之間比較得到的差異帶，來自于一個個體本身的長短不等的片段不是多態(tài)性。RFLP標記的優(yōu)點1.RFLP標記無表型效應(yīng)，不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。因此可在特征性狀遠未出現(xiàn)之前就可以知道其基因型。2.

RFLP標記在等位之間是共顯性的，因此不受雜交方式的影響。不管是正交、反交、回交，總是在F1代中含有兩親本各一組染色體的片段之和。3.用不同探針可以探測出不同的RFLP標記，標記的密度遠遠超過以性狀為基礎(chǔ)的圖譜。RFLP

的不足

雖然RFLP分子標記有這些優(yōu)點，但實驗步驟較多，費工費時，費用也高，使其應(yīng)用受到一定的限制。

要使RFLP在指導(dǎo)遺傳育種中發(fā)揮作用，還必須將RFLP與已知性狀聯(lián)系起來，僅有RFLP標記圖使用價值不大。可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（VNTRs）

在真核生物基因組中有小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列存在，它們是短序列（核心序列）高度重復(fù)的序列，在不同生物個體間，某一座位上的核心序列重復(fù)的次數(shù)有很大差異，并且這些重復(fù)序列有多座位性，因此形成了高度的多態(tài)性。用某種高度重復(fù)序列的核心序列作探針，測定其RFLP，得到電泳后的雜交圖譜，這種圖譜稱為指紋圖譜，可以用來鑒別個體、親子鑒定等。VNTR一例Thecauseofthevariationbetweenindividualgenomesatmicrosatellitesorminisatellitesisthatindividualalleleshavedifferentnumbersoftherepeatingunit.Forexample,oneminisatellitehasarepeatlengthof64bp,andisfoundinthepopulationwiththefollowingdistribution:

7%18repeats11%16repeats43%14repeats

36%13repeats4%10repeatsVNTR差異帶的檢測父母子女間VNTR的檢測結(jié)果VNTR應(yīng)用舉例

用33.15（探針名）進行白種人的DNA指紋分析時，兩個無血緣關(guān)系的個體具有相同DNA指紋圖譜的概率為3×10－11，而當(dāng)把33.15和33.6兩個探針取得的結(jié)果綜合分析時，兩個個體指紋圖譜相同的概率更是降低到5×10－19。隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD）

RAPD（randomlyamplifiedpolymorphicDNA）稱為隨機擴增DNA多態(tài)性。它是利用隨機引物（通常為10個核苷酸）對不同生物個體基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，溴化乙錠染色，顯示出擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。不同個體間差異的條帶可以作為分子標記。兩個不同油菜品系的RAPDRAPD的特點雖然對具體的一個引物而言其檢測DNA多態(tài)性的位點是有限的，但是當(dāng)采用一組引物時，檢測區(qū)域幾乎可以覆蓋整個基因組，從而得到整個基因組DNA的多態(tài)性。RAPD的特點是操作簡便迅速，不需要標記探針。只要有一套隨機引物就能對任何物種進行RAPD操作。RAPD標記也必須與表型相聯(lián)系才能發(fā)揮指導(dǎo)遺傳育種的作用。MAAP技術(shù)比較

DAFAP-PCRRAPD引物長度(nt)5～1520～349～10引物濃度(mmol/L)3～3030.3典型擴增產(chǎn)物條帶

10～1003～501～10分辨率

高

中等

低分離膠

聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺

瓊脂糖顯色

銀染

放射性標記

溴化乙錠染色嚴謹度

低或高

低和高

低(Multiplearbitraryampliconprofiling)DAF：DNAamplificationfingerprinting

AP-PCR：arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction

MAAP結(jié)果比較AFLP

AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymor-phism,擴增酶切片段多態(tài)性）又稱為SAP（Specificamplifiedpolymorphism,專一擴增多態(tài)性），它結(jié)合了RFLP和PCR二者的優(yōu)點，經(jīng)過酶切和用特異引物擴增，檢測DNA的多態(tài)性。由于退火溫度高，結(jié)果重復(fù)性好，具有RAPD無法比擬的優(yōu)越性。它是一種高效的分子標記，可用來構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。

AFLP

指紋技術(shù)

先用兩種限制性內(nèi)切酶（A和B）對基因組DNA切割，得到兩個粘性末端為A－A、A－B、B－B三種片段。將A和B兩種接頭加到這些片段的兩端，再用相應(yīng)的A和B引物對這些片段進行PCR擴增，只有A－B片段可以被擴增。擴增產(chǎn)物用電泳檢測其多態(tài)性。通過換用不同的限制酶及不同的引物，可以控制擴增條帶的數(shù)目，檢測不同的分子標記。圖9－5AFLP指紋技術(shù)用于AFLP的人工接頭

和引物舉例

EcoRⅠ適配器：

CORE

ENZ

↓

5’-CTCGTAGACTGCGTACC

--GAATTC--

CAT

CTGACGCAT

GGTTAA-5’

--CTTAAG--

↑EcoRⅠ端

引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GACTGCGTACCAATTCNNN↑用于AFLP的人工接頭

和引物舉例

MseⅠ適配器：

CORE

ENZ

↓

5’-GACGATGAGTCCTGAG--TTAA--

TACTCAGGACTCAT-5’--AATT--

↑

MseⅠ端引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GATGAGTCCTGAGTAANNNAFLP對酶切位點的要求

AFLP一般采用雙酶切，一個酶切點多（識別4堿基），另一個酶切點少（識別6堿基）。切點多的酶產(chǎn)生較小的片段，切點少的酶能夠減少可擴增片段的數(shù)目。這兩種酶都必須產(chǎn)生粘性末端。如果用EcoRⅠ（識別6堿基）和MseⅠ（識別4堿基）組合，則產(chǎn)生的酶切片段有三種：即MseⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/EcoRⅠ。如果按酶切位點隨機分布來算（256，4096），MseⅠ/MseⅠ片段占90%以上，EcoRⅠ/MseⅠ片段為EcoRⅠ酶切位點數(shù)的兩倍，而EcoRⅠ/EcoRⅠ幾乎沒有。AFLP對引物的要求

引物分為三個部分，分別為CORE、ENZ、EXT，其中CORE與人工接頭中的CORE互補，ENZ與粘性末端序列互補，EXT為選擇性堿基。引物一般16到25個堿基，引物3’端的選擇性堿基每增加1個，譜帶數(shù)減少。而選擇性堿基GC含量越高，產(chǎn)生的譜帶數(shù)越少，所以通過調(diào)整選擇性堿基的數(shù)目和種類，就能靈活地調(diào)節(jié)擴增譜帶數(shù)。隨著選擇性堿基的增加，引物與模板的錯配率也相應(yīng)增加，為了控制錯配率，選擇性堿基一般為1～3個。AFLP的PCR擴增

對于較復(fù)雜的基因組來說，AFLP的PCR擴增可分兩步進行，第一步預(yù)擴增一般采用2種只帶1個選擇性堿基的引物，引物不被標記，擴增后稀釋10倍，取少量作為第二次擴增的模板，這樣既為第二步擴增提供了充足的模板，又對模板起到了選擇性純化的作用，第二次擴增采用帶有2～3個選擇性堿基的引物，引物被標記，這樣可以提高擴增的特異性。用EcoRI和MseI引物只擴增EcoRI-MseI片段ⅠⅡⅢⅣABCABCABCABC引物組合Ⅰ：EcoRI+C/MseI+ACⅡ：EcoRI+C/MseI+CAⅢ：EcoRI+T/MseI+AGⅣ：EcoRI+T/MseI+ATA：標記EcoRI引物B：標記MseI引物C：標記MseI引物，但不加

EcoRI引物只擴增EcoRI-MseI片段的原因(i)TheMseIprimerhasalowerannealingtemperaturethantheEcoRIprimer,makingamplificationofMseI-MseIfragmentslessefficientcomparedwithEcoRI-MseIfragmentsundertheconditionsused.WehaveindeedobservedstrongeramplificationofMseI-MseIfragmentsusinglongeroralternativeMseIprimersandadapters.只擴增EcoRI-MseI片段的原因(ii)TheMseI-MseIfragmentshaveaninvertedrepeatattheends,duetothefactthattheyareamplifiedbyasingleprimer.Therefore,astem-loopstructuremaybeformedbybase-pairingoftheendsofthefragments.whichwillcompetewithprimerannealing.ThisisalsoconfirmedbytheobservationthatonlylargerfragmentswereamplifiedinAFLPreactionswhenonlytheMseIprimerwasadded.Formationofastem-loopstructurewillbemoredifficultintheselargerfragments.引物5’端以G開頭的原因AnimportantfeatureoftheAFLPprimersisthatallprimersstartwitha5’guanine(G)residue.Wehavefoundthata5’G-residueintheunlabeledprimeriscrucialtopreventthephenomenonofdoublebands.Thedoublebandsappearedtoresultfromincompleteadditionofanextranucleotidetothesynthesizedstrands.ThisterminaltransferaseactivityoftheTaqpolymeraseisquitestrong.

Weconcludefromourresultsthatthisterminaltransferaseactivityismoststrong(almost100%ofthesynthesizedstrands)whenthe3’nucleotideofthesynthesizedstrandisacytidine(C).

引物3’端選擇性堿基數(shù)目對擴增特異性的影響ⅠⅡⅢABCDABCDABCD引物組合Ⅰ：EcoRI+A/MseI+CTCAⅡ：EcoRI+A/MseI+CTGCⅢ：EcoRI+T/MseI+CTCAA：MseI引物帶1個選擇性堿基B：MseI引物帶2個選擇性堿基C：MseI引物帶3個選擇性堿基D：MseI引物帶4個選擇性堿基序列標志位點技術(shù)

序列標志位點（sequencetagsites，STS）技術(shù)是一類基于特定引物序列形成的，利用PCR技術(shù)進行的分子標記技術(shù)。

SSR是序列標志位點技術(shù)中的一種，它以某一微衛(wèi)星座位兩側(cè)的單一序列設(shè)計引物，擴增這個微衛(wèi)星位點的序列，然后電泳檢測產(chǎn)物的大小。由于在不同生物個體中這個座位核心序列的重復(fù)次數(shù)可能不同，同一個體的兩條染色體的這個座位核心序列的重復(fù)次數(shù)也可能不同（雜合體），這個座位有許多不同長度的等位“基因”（復(fù)等位“基因”）。SSR就是檢測不同個體間等位“基因”在長度上的差異。圖9－6微衛(wèi)星序列長度多態(tài)性測定圖9－7大豆ATT5SSR位點14個等位基因的大小單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)

SNP是指基因組內(nèi)DNA某一特定位置的核苷酸存在置換、插入、缺失等變化，而且其中最少有一種等位基因在群體中突變頻率不小于1%。SNP一般以替換為主，顛換與轉(zhuǎn)換之比為1:2。轉(zhuǎn)換（transition）：用另一種嘌呤堿基代替原有的嘌呤堿基，或用另一種嘧啶堿基代替原有的嘧啶堿基。顛換（transversion）：嘌呤堿基被嘧啶堿基所替代或嘧啶堿基被嘌呤堿基所替代。SNP的研究狀況

目前人類基因組研究中SNP的研究最為廣泛。大多數(shù)SNP對蛋白質(zhì)無直接的影響，因為絕大多數(shù)的SNP位于非編碼區(qū)。目前已有的人類基因組SNP圖譜中共有142萬個SNP，但只有約4.23%的SNP位于外顯子內(nèi)。

除此，在果蠅、雞、犬類、豬、綿羊、牛等動物上也開展了SNP研究。在植物中展開SNP廣泛研究的種類則較少，近幾年僅在玉米、大麥、小麥、番茄、水稻等農(nóng)作物上開展了此項工作。

編碼區(qū)內(nèi)SNP的意義

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（codingSNP，cSNP）比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。SNP的影響

從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：

一種是同義cSNP（synonymouscSNP），即cSNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同。

另一種是非同義cSNP（non-synonymouscSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。SNP用作遺傳標記的優(yōu)點

SNP用作遺傳標記具有以下優(yōu)點：（1）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。（2）它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標記廣泛得多。（3）與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的cSNP，而串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。SNP用作遺傳標記的優(yōu)點（4）部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。（5）易于進行自動化、規(guī)?；治?，縮短了研究時間。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發(fā)展自動化技術(shù)篩選或檢測SNPs。檢測單核苷酸差異的方法單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）

DNA片段雙鏈變性成單鏈后，在非變性條件下會折疊成不同的空間構(gòu)象，單鏈這種構(gòu)象會因個別核苷酸置換而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳時由于構(gòu)象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態(tài)性。在SSCP分析時，應(yīng)先將擴增后的DNA片段變性為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。檢測單核苷酸差異的方法基因芯片法

其基本原理是利用DNA分子的變性雜交特性，通過DNA芯片上的固定探針或樣品DNA與游離樣品DNA或探針雜交來推斷未知靶分子的序列，雜交發(fā)生與否可采用熒光標記技術(shù)來檢測。由于該技術(shù)可將大量探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量DNA分子進行檢測分析，解決了傳統(tǒng)印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子少、效率低的問題。近年來的實驗結(jié)果指出，一次實驗就可以同時分析成千個多態(tài)