細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)匯編

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)Technologyof

CellCulture王莉細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)⑴細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究：細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能,如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡。⑵細(xì)胞培養(yǎng)藥物測(cè)試：藥物單因素及多因素的影響作用。⑶淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：檢測(cè)T、B細(xì)胞數(shù)量及功能。⑷細(xì)胞用作毒性實(shí)驗(yàn)及安全性實(shí)驗(yàn)：環(huán)境毒物等。⑸細(xì)胞工程學(xué)研究手段已基本建立：克隆技術(shù)等。⑹遺傳疾病的產(chǎn)前檢查：羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)。⑺體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：腫瘤細(xì)胞與癌基因研究。⑻在雜交瘤技術(shù)中的應(yīng)用：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)與應(yīng)用等。⑼細(xì)胞培養(yǎng)在病毒學(xué)中的應(yīng)用：SARS結(jié)構(gòu)與功能等。⑽細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用

：如基因分離，基因測(cè)序與表達(dá)、基因轉(zhuǎn)移與重組，癌基因研究等。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)概述

細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture):使離體細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室人工模擬機(jī)體內(nèi)的條件下，生長(zhǎng)發(fā)育、分裂增殖的一項(xiàng)重要的細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)。動(dòng)物和植物細(xì)胞培養(yǎng)(這里僅討論動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng))，簡(jiǎn)稱(chēng)細(xì)胞培養(yǎng)。組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)器官培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是把取得的組織用機(jī)械或消化的方法，分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行培養(yǎng)、增殖。細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)1.活細(xì)胞：能長(zhǎng)時(shí)間、直接觀(guān)察、研究

活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)2.可控制：重復(fù)性。可控制-調(diào)節(jié)條件：各種因素：物理、化學(xué)、生物等因素3.研究的樣本具有均一性：可選擇對(duì)象：哪一種類(lèi)型：上皮？間質(zhì)？性質(zhì)：正常？腫瘤？階段：

4.便于觀(guān)測(cè)、檢測(cè)和記錄：

研究觀(guān)察：倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記；記錄：攝影照片、縮時(shí)電影、電視--細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)5.應(yīng)用廣

學(xué)科多：對(duì)象廣：

各種動(dòng)物：低等動(dòng)物--高等動(dòng)物--人類(lèi)

一種動(dòng)物：不同年齡--

不同組織--

正?；虍惓＃[瘤--）6.較經(jīng)濟(jì)

可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)

現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高，但人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況，仍不完全相同。當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，久了，必然發(fā)生變化。與體內(nèi)主要不同：①相對(duì)孤立、相對(duì)單一；②缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。主要表現(xiàn)：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)；分化減弱或不顯；

細(xì)胞趨向單一化。

要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞；是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。一、細(xì)胞培養(yǎng)基本原理與技術(shù)

(一)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的條件體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要合適的環(huán)境和必需的條件才能生存和繁殖。

1.細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要血漿或血纖維蛋白原凝塊中（早期），或在組織提取液等中生長(zhǎng)?，F(xiàn)知需要一些基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)因子等物質(zhì)。

⑴基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括：氨基酸(12種必需AA)、維生素、碳水化合物及一些無(wú)機(jī)離子。

⑵促生長(zhǎng)因子等物質(zhì)除基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，培養(yǎng)細(xì)胞還需要促細(xì)胞生長(zhǎng)因子等物質(zhì)(如EGF,,IGF,IL等)才能正常生長(zhǎng)、增殖。血清中含多種，但也有些組成不明，對(duì)細(xì)胞有害的成分。2.細(xì)胞的生存環(huán)境細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性，包括溫度、氣相及pH等。⑴溫度：人及哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)細(xì)胞的理想溫度是35℃～37℃。高溫比低溫對(duì)細(xì)胞的影響更為明顯。當(dāng)溫度為25℃～35℃，細(xì)胞生長(zhǎng)很慢；4℃下能存活數(shù)天(不低于0℃)，－196℃(保護(hù)劑)。41℃～42℃下1h損傷嚴(yán)重，43℃以上則多數(shù)細(xì)胞將死亡。⑵氣相及pH：5％CO2+95%空氣，大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2～7.4下生長(zhǎng)。⑶滲透壓：260～320mmol/L的滲透壓適于大多數(shù)細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件

3.無(wú)污染及無(wú)毒

無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。包括與細(xì)胞直接接觸者和間接接觸者（器皿和材料）。

污染包括細(xì)菌等微生物（細(xì)菌、霉菌、支原體）的污染。即使使用抗菌素仍是細(xì)胞培養(yǎng)中要非常注意的問(wèn)題。污染的另一問(wèn)題是不同細(xì)胞類(lèi)型的交叉污染。對(duì)不同細(xì)胞系操作時(shí)，應(yīng)避免使用同一瓶培養(yǎng)液。

培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件

合適的環(huán)境和必需的條件1營(yíng)養(yǎng)需要2環(huán)境要求3無(wú)毒及無(wú)污染培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件(二)培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品無(wú)菌室孵育室洗滌消毒滅菌室觀(guān)察室準(zhǔn)備室貯藏室細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室操作間緩沖間更衣間

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無(wú)菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲(chǔ)藏。(二)培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品1.常用設(shè)備和用品

⑴超凈工作臺(tái)：組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無(wú)菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺(tái)的廣泛使用，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

(二)培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品

1.常用設(shè)備和用品

⑵CO2培養(yǎng)箱:提供進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所需要的一定量的CO2(濃度為5％),易于使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定，適用于開(kāi)放或半開(kāi)放培養(yǎng)。由于這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)器皿內(nèi)部與外界相通,培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須保持清潔,應(yīng)定期以紫外線(xiàn)照射或酒精消毒。同時(shí)培養(yǎng)箱應(yīng)放置盛有無(wú)菌蒸餾水的水槽,防止培養(yǎng)液蒸發(fā),使箱內(nèi)相對(duì)濕度始終保持為100％。(二)培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品

1.常用設(shè)備和用品⑶倒置顯微鏡⑷冰箱⑸離心機(jī)⑹電熱干燥箱⑺水純化裝置(二)培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品1.常用設(shè)備和用品⑻高壓蒸汽消毒裝置⑼過(guò)濾除菌裝置⑽細(xì)胞冷凍裝置其他移動(dòng)式臭氧空氣消毒機(jī)儀器

細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器：常用液氮容器。新型的細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器可通過(guò)先進(jìn)的電子控制器實(shí)現(xiàn)凍存自動(dòng)化并監(jiān)測(cè)液氮水平和樣品溫度；可配備先進(jìn)的報(bào)警系統(tǒng)，分別警報(bào)液氮液面、溫度、電池、電壓、電源等失常情況：同時(shí)具備熱氣體旁路系統(tǒng)，防止高于-130℃的暖空氣進(jìn)入液氮罐，從而更有效地保護(hù)樣品，防止升溫。(二)培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品2.培養(yǎng)器皿

⑴培養(yǎng)瓶⑵培養(yǎng)皿⑶多孔培養(yǎng)板⑷離心管⑸移液管和吸管⑹其他玻璃器皿凍存管

1.2ml2ml，5ml離心管

5ml，10ml，15ml50ml細(xì)胞刮(二)培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品3.解剖器械

4.微量移液器

(三)培養(yǎng)用品的清洗清洗和消毒滅菌的主要目的是去除器皿上雜質(zhì)及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響的物質(zhì)及各種微生物。

1.玻璃器皿：供細(xì)胞生長(zhǎng)的玻璃表面不但要清潔干凈，而且要帶適當(dāng)電荷。一般玻璃器皿的清洗分為4步。

(1)浸泡：新的玻璃器皿表面呈堿性，并帶有如鉛等，使用前必須徹底清洗。先用自來(lái)水初步刷洗，5％HCl中浸泡過(guò)夜，以中和其堿性。使用后的玻璃器皿應(yīng)立即浸入清水中，避免器皿內(nèi)蛋白質(zhì)干涸后黏附于玻璃上難以清洗。

(2)刷洗：去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。有兩點(diǎn)需注意：一是防止損壞器皿表面光潔度，應(yīng)選擇軟毛毛刷和優(yōu)質(zhì)洗滌劑,不宜用力過(guò)猛；二是不留死角,要特別注意瓶角等部位。刷洗后要將洗滌劑徹底沖洗干凈,晾干。

(3)清潔液浸泡：清潔液由濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水配成。具有很強(qiáng)的氧化作用和去污能力,對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕。經(jīng)清潔液浸泡后,殘留的未刷洗掉的微量雜質(zhì)可被完全清除。

清潔液可配制成三種不同的強(qiáng)度,其成分用量見(jiàn)下表。弱液

次強(qiáng)液

強(qiáng)液重鉻酸鉀（g）100120

63濃硫酸（ml）

100200

1000蒸餾水（ml）

1000

1000

200

細(xì)胞培養(yǎng)物品清洗所需配制的清潔液常為次強(qiáng)液。新配制的呈棕紅色，經(jīng)多次使用、水分增多或遇有機(jī)溶劑時(shí)為綠色，已失效，應(yīng)重新配制。

10%～30%的硝酸溶液也常用作清潔液。(三)培養(yǎng)用品的清洗(三)

培養(yǎng)用品的清洗

2.橡膠用品：組織培養(yǎng)液中使用的膠塞、培養(yǎng)瓶蓋子、針頭等均不能以清潔液浸泡。清洗過(guò)程中，新的膠塞因帶有滑石粉，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗干凈，再進(jìn)行常規(guī)清洗；使用后的膠塞、蓋子應(yīng)及時(shí)浸泡在清水中。然后用洗滌劑刷洗。

3.塑料器皿：包括各種培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶等。這些產(chǎn)品主要為進(jìn)口的一次性物品，供應(yīng)商提供給用戶(hù)時(shí)已消毒滅菌并密封包裝，打開(kāi)包裝即可使用。由于各種原因，部分實(shí)驗(yàn)室尚未能做到將這類(lèi)物品完全作一次性使用，仍需經(jīng)過(guò)清洗和消毒滅菌后反復(fù)使用。清洗方法通常是：用后立即以流水沖洗干凈或浸入水中，防止干涸。超聲波清洗機(jī)內(nèi)加入少量洗滌劑清洗30min，流水徹底沖洗干凈，清潔液浸泡過(guò)夜，流水徹底將殘留清潔液沖洗干凈，蒸餾水漂洗2～3次，三蒸水漂洗2次，晾干備用。亦可采用下述步驟：器皿經(jīng)沖洗干凈后，晾干，2％NaOH浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗，5％鹽酸浸泡30min，流水徹底沖洗，蒸餾水漂洗。但不宜反復(fù)使用次數(shù)太多。

（三）

培養(yǎng)用品的清洗

4.包裝:組織培養(yǎng)的器皿需清洗、晾干。在消毒前必須進(jìn)行包裝，以便消毒及儲(chǔ)存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。一般用皺紋包裝紙、硫酸紙、牛皮紙、棉布等作為包裝材料，對(duì)培養(yǎng)瓶、濾器、存放培養(yǎng)液用貯液瓶、吸管和膠塞（或培養(yǎng)瓶蓋子）等物品的容器瓶口部分做局部包裝密封，再用牛皮紙、玻璃紙或布包起來(lái)備用。對(duì)體積小的培養(yǎng)皿、移液器吸頭等可以全封閉包裝。注射器、金屬器械可直接裝入鋁制飯盒或不銹鋼等容器內(nèi)。重復(fù)使用的培養(yǎng)板則用優(yōu)質(zhì)塑料紙嚴(yán)密封口。

（四）培養(yǎng)用品的滅菌與消毒根據(jù)材料的要求可采用不同的消毒滅菌方法?？偟恼f(shuō)來(lái)有物理方法及化學(xué)方法兩大類(lèi)。物理方法包括用濕熱(高壓蒸汽)、干熱、紫外線(xiàn)、射線(xiàn)、過(guò)濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物；化學(xué)方法是使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。以下重點(diǎn)介紹組織細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)工作常用的幾種消毒方法：

1.干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)行，主要用于消毒玻璃器皿。干熱消毒后的器皿干燥，易保存。缺點(diǎn)是干熱傳導(dǎo)慢，可能有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，因此要用較高的溫度和較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到消毒的目的，需加溫到160℃，保持90～120min方能殺死芽孢。消毒完畢后不可馬上將烤箱門(mén)打開(kāi)，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。

2.濕熱消毒：濕熱消毒是一種有效的消毒方法,一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消毒。為了保證消毒的效果，消毒物品不應(yīng)裝得太滿(mǎn)，以便消毒器內(nèi)氣體流通；導(dǎo)氣管要伸至罐底并防止堵塞，在加熱升壓之前，打開(kāi)排氣閥門(mén)，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。冷空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門(mén)，開(kāi)始升壓，待達(dá)到所需要的壓力時(shí)，開(kāi)始記錄時(shí)間，并控制壓力恒定。高壓消毒可在5、10、15、20磅的壓力下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間可為10、15、20、30min。

根據(jù)不同的物品選擇不同壓力和時(shí)間，一般物品(如布類(lèi)、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20min，一些常規(guī)使用的液體的消毒要求為15磅15min，橡膠用品為10磅10min。一般認(rèn)為在這種情況下于1min內(nèi)幾乎可殺死所有微生物，但由于在消毒物品的包裝內(nèi)可能仍有冷空氣未全部排出或蒸汽尚未能達(dá)到消毒器內(nèi)的各部分，所以要延長(zhǎng)消毒時(shí)間。消毒完畢后一定要先打開(kāi)閥門(mén)放氣，再打開(kāi)消毒器的蓋，以免發(fā)生意外。

（四）培養(yǎng)用品的滅菌與消毒脈動(dòng)真空滅菌器

消毒滅菌的方法

3.紫外線(xiàn)消毒：紫外線(xiàn)直接照射消毒是目前各實(shí)驗(yàn)室常用的方法之一，主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空氣、操作臺(tái)表面及桌椅等消毒。但在房間內(nèi)安裝不能高于2.5m。要使各處達(dá)到0.06μw/cm2的能量照射，否則影響消毒效果。也可以用紫外線(xiàn)消毒一些塑料培養(yǎng)器皿（如塑料培養(yǎng)皿、塑料培養(yǎng)板等）。缺點(diǎn)是消毒有死角。現(xiàn)已有電子滅菌燈可以代替紫外線(xiàn)燈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的空氣消毒。

消毒滅菌的方法

4.過(guò)濾除菌消毒：血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等不能用高壓消毒的方法進(jìn)行滅菌，可采用過(guò)濾方法除菌。濾器有抽吸(抽濾)式及加壓式兩種類(lèi)型；濾板(或?yàn)V膜)結(jié)構(gòu)可為石棉板、玻璃或微孔膜。

(1)

玻璃濾器：以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上。一般都使用G6型。其缺點(diǎn)是速度較慢。

(2)微孔濾膜濾器：為金屬結(jié)構(gòu)，但其中間為一種一次性的特制混合纖維素脂濾膜。可用于包括血清在內(nèi)的各種培養(yǎng)液的過(guò)濾除菌，速度較快，效果較好。微孔濾膜濾器可為加壓式(正壓式)或抽濾式,由于加壓式微孔濾膜濾器過(guò)濾效果好、使用方便、易清洗，目前使用最為廣泛。消毒滅菌的方法針頭式濾器消毒滅菌的方法

5.消毒劑及抗菌素：組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中也可利用消毒劑來(lái)進(jìn)行滅菌處理，消毒劑主要是75％酒精、過(guò)氧乙酸、乳酸等化學(xué)制劑?？煞謩e用于操作人員的皮膚、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、器械、器皿的操作表面，實(shí)驗(yàn)室的桌、椅、墻壁、地面及空氣等的處理。如75％酒精最為常用，用途也最廣泛；0.1％新潔爾滅可對(duì)器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空氣消毒；另外尚有各種用于地面消毒的消毒液（例如三花消毒液、過(guò)氧乙酸等）可供選用。

抗菌素也常在組織細(xì)胞培養(yǎng)中使用，但多數(shù)是為了預(yù)防。要注意的是不能完全依賴(lài)抗菌素來(lái)達(dá)到消毒滅菌。常用的抗菌素為青霉素和鏈霉素。

消毒滅菌的方法

6.其他方法：

(1)

電子消毒器消毒滅菌：使用市售的電子滅菌器可消毒不宜高熱滅菌的器皿及用物，例如塑料制品等，消毒時(shí)間通常為30min，消毒完畢應(yīng)及時(shí)關(guān)閉消毒物品容器。

(2)

輻射滅菌：通常采用放射性60Co照射需滅菌的各種不宜高熱滅菌的器皿及用具以及部分實(shí)驗(yàn)用藥物、制劑等。。

(五)無(wú)菌操作的基本要領(lǐng)和要求

細(xì)胞培養(yǎng)工作中的消毒滅菌方法如上面所述可有多種，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的消毒：實(shí)驗(yàn)室中空氣的消毒，最理想是采用過(guò)濾系統(tǒng)與恒溫設(shè)備結(jié)合使用，但價(jià)格較昂貴。亦可用紫外線(xiàn)消毒。另外尚可用乳酸等蒸汽或電子滅菌燈消毒。實(shí)驗(yàn)室的地面多用新潔爾滅溶液等處理。桌椅等亦多用消毒劑消毒處理，最常用的是以酒精擦拭，亦可用紫外線(xiàn)照射。

超凈工作臺(tái)的消毒洗手和著裝火焰消毒無(wú)菌培養(yǎng)操作

組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)除必須有培養(yǎng)基（液）外，還需要水和大量不同的溶液，包括鹽溶液、消化液、緩沖液、抗菌素液及用于檢測(cè)的各種染液等。

所需試劑及器械主要包括：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素、純凈水系統(tǒng)、電子天平、pH計(jì)、磁力攪拌器、濾器、微孔濾膜、O2、燒杯、量桶、貯液瓶、瓶塞、注射器、三蒸水、胎(小)牛血清、NaOH、HCl、高壓滅菌器等。

平衡鹽溶液(六)細(xì)胞培養(yǎng)用液(六)細(xì)胞培養(yǎng)用液

1.平衡鹽溶液

平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿平衡的作用，并可供細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分，另外尚可用作洗滌組織、細(xì)胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。平衡鹽溶液(BSS)主要是由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成，其中無(wú)機(jī)離子是細(xì)胞生命的必要成分；在維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液pH方面也起著重要作用。Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提供條件，也是細(xì)胞膜的重要組成成分。葡萄糖等可為細(xì)胞代謝提供能量。水體外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)水的質(zhì)量非常敏感，要求很高。水的純度不夠,即使有害元素含量極少對(duì)，細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生不利的影響，有時(shí)引起細(xì)胞中毒死亡。因此配制所有的培養(yǎng)液和各種溶液應(yīng)使用純化水。組織培養(yǎng)必須使用玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水。二次蒸餾水或一次蒸餾水可用以清洗器皿或配制一般洗液。平衡鹽溶液

平衡鹽溶液(BSS)主要是由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成，其中無(wú)機(jī)離子是細(xì)胞生命的必要成分；在維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液pH方面也起著重要作用。Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提供條件，也是細(xì)胞膜的重要組成成分。葡萄糖等可為細(xì)胞代謝提供能量。

目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在細(xì)胞培養(yǎng)中，BSS用途如下：①作為配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液。②配制各種試液：如配“胰酶”消化液。③用于洗滌組織和細(xì)胞。平衡鹽溶液PBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl8.006.808.008.008.00KCl0.200.400.400.200.40Ca(Cl)20.200.140.10Mg(Cl)2·6H2O0.10MgSO4·7H2O0.200.20Na2HPO4·2H2O1.560.061.420.06NaH2PO4·H2O0.14KH2PO40.200.060.200.06NaHCO32.200.350.35Glucose(葡萄糖)1.001.00Phenolred(酚紅)0.020.020.020.02

為了便于保存和減少有關(guān)成分的化學(xué)反應(yīng)，此液可配成20×、10×和5×濃縮液的儲(chǔ)存液(母液)。

10×母液配制法

甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列試劑

NaC180.0gKCl4.0gMgSO47H2O2.0gCaC121.4g(2H2O1.85g)

待完全溶解后，補(bǔ)足三蒸水至500ml。

乙液：取450ml三蒸水依次溶解下列試劑

Na2HPO40.6g(12H2O1.52g)KH2PO40.6g

葡萄糖10.0g0.4％酚紅50.0ml平衡鹽溶液

消化液（細(xì)胞分離液）常用的細(xì)胞分離液有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)和膠原酶等，它們?cè)谥苽湓?xì)胞時(shí)可消化組織、分散細(xì)胞，在傳代細(xì)胞時(shí)使細(xì)胞脫離生長(zhǎng)表面(瓶壁)和使細(xì)胞團(tuán)離散成單個(gè)細(xì)胞。它們可單獨(dú)使用，也可按一定比例混合使用，這主要取決于所培養(yǎng)細(xì)胞的要求。消化液胰蛋白酶

⑴胰蛋白酶:主要來(lái)自?；蜇i的胰臟，淡黃色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分別能解離125份和250份酪蛋白,胰酶的離散作用與細(xì)胞的種類(lèi)和特性密切相關(guān)。不同細(xì)胞系對(duì)胰酶溶液的作用濃度、溫度和時(shí)間等的要求也不一樣。濃度大、溫度高、作用時(shí)間長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的分離能力也越大，但超過(guò)一定限度也會(huì)損傷細(xì)胞、胰酶在pH8.0，溫度37℃時(shí)，作用力最強(qiáng)。Ca2+、Mg2+

、血清、蛋白質(zhì)的存在會(huì)降低其活力，可用無(wú)Ca2+、Mg2+的溶液配制，需要終止消化作用時(shí)，可加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液或胰酶抑制劑來(lái)終止胰酶對(duì)細(xì)胞的繼續(xù)作用。

（2）乙二胺四乙酸鈉（EDTA）

EDTA是一種化學(xué)螫合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的解離作用，且毒性小，常用濃度為0.02%。將胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用，會(huì)提高分散細(xì)胞的效力。

0.02%EDTA溶液(亦稱(chēng)為Versen液)：稱(chēng)取適量EDTA，用D-Hanks溶液溶解，10磅15min高壓滅菌，分裝小瓶，4℃冰箱保存。用于分散消化細(xì)胞。

（3）膠原酶

膠原酶的常用劑量為200U/Ml(約為1mg/ml）。培養(yǎng)用液-消化液

常用培養(yǎng)基（液）培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基，主要來(lái)自動(dòng)物體液或從組織分離提取制備的，其營(yíng)養(yǎng)成分較高，但成分復(fù)雜，個(gè)體差異較大，來(lái)源也有一定的限制。

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的，具有一定的組成，是較理想的培養(yǎng)基。但對(duì)動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，它只能維持細(xì)胞的生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充天然培養(yǎng)基，即兩者混合在一起使用,效果更好。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn),促進(jìn)了組織培養(yǎng)的發(fā)展，避免了生物差異的影響,細(xì)胞生長(zhǎng)健康透明,延長(zhǎng)了體外存活的時(shí)間，價(jià)廉易制取。培養(yǎng)基（液）

天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基（naturalmedia）包括：血清、組織提取液等。血清是細(xì)胞培養(yǎng)中最常使用的天然培養(yǎng)基。血清中含有許多能維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖不可缺少的成分，如蛋白質(zhì)、多肽、激素及各種氨基酸、葡萄糖、酮酸等營(yíng)養(yǎng)成分。

⑴血清：分人血清和動(dòng)物血清兩大類(lèi)。細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的是動(dòng)物血清，來(lái)自牛、馬、兔等動(dòng)物，其中牛血清比馬血清用得更廣泛。牛血清分為胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）和小牛血清（calfserum，CS）兩種。培養(yǎng)基－天然培養(yǎng)基

FBS是經(jīng)剖腹從母牛子宮中取出的胎牛中分離到的血清，價(jià)格貴；CS是從剛出生但尚未哺乳的小牛中分離到的血清。

購(gòu)置的血清應(yīng)做熱滅活處理。將小牛血清置于56℃水浴中滅活30分鐘，以破壞補(bǔ)體及一些污染微生物(如病毒、支原體等)，放置4℃冰箱中，無(wú)菌試驗(yàn)陰性。未滅活的血清不穩(wěn)定，應(yīng)保存于-20℃冰箱中。

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。

CS(calfserum)

則是指小牛血清HS(horseserum)則是指馬血清

天然培養(yǎng)基

許多早期的組織培養(yǎng)基主要成分是由動(dòng)物產(chǎn)品或組織抽提物。1950年。Morgan和他的同事曾報(bào)道了他們努力生產(chǎn)一種完全限定營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)基（69種成分的199配方，開(kāi)始了人工合成培養(yǎng)基的歷史）。

合成培養(yǎng)基（Syntheticmedia）是根據(jù)研究和了解細(xì)胞所需成分的基礎(chǔ)上配制而成的，現(xiàn)已成為普遍應(yīng)用的商品化的培養(yǎng)基。但合成培養(yǎng)基尚未成為十分完全的培養(yǎng)基，它只能維持細(xì)胞不死，而不能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，使用時(shí)尚需添加天然培養(yǎng)基，主要是牛血清。目前常用的合成培養(yǎng)基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培養(yǎng)液等。合成培養(yǎng)基（液）

合成培養(yǎng)基(液)基本成分合成培養(yǎng)基的種類(lèi)雖多,但一般均含有氨基酸、維生素、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)離子和一些其他的輔助成分。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人工合成培養(yǎng)基不僅品種增加，配方相對(duì)固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培養(yǎng)基成分趨于簡(jiǎn)單化。現(xiàn)今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培養(yǎng)液比以前已有了較大改進(jìn)，增減了一些成分，以滿(mǎn)足細(xì)胞培養(yǎng)中新技術(shù)的需要。如雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM培養(yǎng)基，使用時(shí)需補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA合成，增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2-Me常配制成0.1mol/L的貯存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加0.5mL。PHA有市售的商品。合成培養(yǎng)基（液）

人工合成培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)

①人工培養(yǎng)基是用已知成分配制，培養(yǎng)條件一致。②它可以精密地測(cè)定培養(yǎng)的細(xì)胞與培養(yǎng)液內(nèi)物質(zhì)變化的情況，用生化定量的方法可以分析各種組織以及各種實(shí)驗(yàn)條件下不同組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，這也可提供和篩選更加有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的更趨簡(jiǎn)化的培養(yǎng)基。③用人工培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞比較透明清楚，胞漿內(nèi)的顆粒很少，換液時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，從而節(jié)省人力、物力。④人工合成培養(yǎng)基克服了天然培養(yǎng)基中可能潛在病毒污染的缺點(diǎn)，有利于培養(yǎng)和研究病毒。⑤培養(yǎng)基成分便于儲(chǔ)存和大量配制，便于細(xì)胞大量生產(chǎn)。合成培養(yǎng)基（液）

合成培養(yǎng)基種類(lèi)已有幾十種。

⑴199培養(yǎng)液

是第一個(gè)合成培養(yǎng)基于1950年問(wèn)世，它含69種成分(見(jiàn)教材P43-45)，幾乎包括了所有的氨基酸、維生素和一些核酸衍生物、生長(zhǎng)激素、脂類(lèi)，加上硝酸鐵和生理鹽溶液，此較為復(fù)雜的合成培養(yǎng)液僅能短時(shí)間維持各類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)，只有加了血清之后才能作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基。199成分復(fù)雜，最近已不大使用。常用合成培養(yǎng)基（液）

⑵Eagle培養(yǎng)基(DMEM)

常用的是MEM(MinimumEagleMedium，低限量培養(yǎng)基)，僅含12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素，成分簡(jiǎn)單，適合各種已建成細(xì)胞系的培養(yǎng)，同時(shí)宜于添加或減少某些成分，也特別適于特殊研究的細(xì)胞培養(yǎng)工作。在它的基礎(chǔ)上改良的DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基）應(yīng)用也十分廣泛。

DMEM增加了各成分的用量(雙倍)，葡萄糖用量可選擇低糖(1000mg/L)或高糖(4500mg/L)，對(duì)于生長(zhǎng)速度較快，附著性較差的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有利。特別應(yīng)用在附著性較差，但又不希望它脫離原來(lái)生長(zhǎng)點(diǎn)的克隆培養(yǎng)時(shí)，采用高糖的培養(yǎng)液效果較好。常用于雜交瘤技術(shù)中骨髓瘤細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。常用合成培養(yǎng)基（液）

⑶RPMl-l640

是一種常用的培養(yǎng)液，最初是針對(duì)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，問(wèn)世后發(fā)現(xiàn)能廣泛適應(yīng)許多種類(lèi)的細(xì)胞，包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，而且成分簡(jiǎn)單，和MEM一樣應(yīng)用十分廣泛。

⑷F12培養(yǎng)基

F12培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含多種微量元素，最初設(shè)計(jì)用于克隆二倍體的中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞。起初是作為一種無(wú)血清配方設(shè)計(jì)的，現(xiàn)常補(bǔ)加血清用于支持各種正常的和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖。F12常和DMEM以1：1結(jié)合，稱(chēng)為DME/F12培養(yǎng)基(DME/F12medium)，作為開(kāi)發(fā)無(wú)血清配方的基礎(chǔ)，以利用F12含有較豐富的成分和DMEM含有較高濃度的營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)點(diǎn)。常用合成培養(yǎng)基（液）常用合成培養(yǎng)基（液）

人工合成培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，稱(chēng)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因它提供細(xì)胞生存所需的營(yíng)養(yǎng)成分，還稱(chēng)為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液。人工合成培養(yǎng)基有干粉型、1倍工作液型和10倍濃縮型。常用的干粉型培養(yǎng)基性質(zhì)穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，使用方便。使用時(shí)按照說(shuō)明書(shū)要求配制，要確保營(yíng)養(yǎng)液所有組分完全溶解，并在消毒和保存過(guò)程中不產(chǎn)生沉淀。下面以RPMI-1640培養(yǎng)液為例，簡(jiǎn)介配制方法。合成培養(yǎng)基(液)的配制

RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液

甲液：RPMI-164010.4g,Hepes2.7～5.4g,三蒸水700ml,磁力攪拌至顆粒完全溶解(3～4h，橙黃色)。

乙液：NaHCO32.0～2.2g,三蒸水30ml。37℃，30min顆粒溶解。將甲、乙兩液混合，加水至終體積1000ml，在4℃靜止2～3h。濾過(guò)除菌，分裝，抽樣做無(wú)菌試驗(yàn)，－20℃凍存。

RPMI-1640血清細(xì)胞培養(yǎng)液

RPMI-1640基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液80ml滅活小牛血清20ml青霉素、鏈霉素各100U/ml,pH7.1～7.2。合成培養(yǎng)基(液)的配制

血清細(xì)胞培養(yǎng)基人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基，常用的是血清、谷氨酰胺等。另外，為防止污染，培養(yǎng)液中還要添加一定量的抗菌素。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物質(zhì)后，叫細(xì)胞培養(yǎng)基，也叫完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基按血清含量多少又分為兩種，即細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和細(xì)胞維持培養(yǎng)基。

合成培養(yǎng)基(液)的配制

細(xì)胞用液的分裝要求①行嚴(yán)格無(wú)菌操作。盡量減少試劑在空氣中的暴露時(shí)間。②根據(jù)配量準(zhǔn)備分裝瓶和瓶塞，分裝瓶規(guī)格、數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備。避免因包裝瓶過(guò)大、貯液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或反復(fù)凍融使用造成營(yíng)養(yǎng)成分丟失和微生物污染。按一次用量或一周內(nèi)用量挑選小包裝瓶。融化后的液體置4℃保存。③分裝前做好分裝量標(biāo)記，分裝瓶?jī)?nèi)液體量要小于瓶容積的2/3。④做好分裝瓶標(biāo)記，包括試劑名稱(chēng)、濃度、配制日期、組號(hào)。合成培養(yǎng)基(液)的配制

生長(zhǎng)液與維持液:血清含有多種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、貼附的活性物質(zhì)。合成培養(yǎng)基中不加血清或低濃度(如2％）血清，僅能維持細(xì)胞生存，細(xì)胞不能很好生長(zhǎng)，這種培養(yǎng)基稱(chēng)為維持液。加入5％的血清，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，能維持不死和緩慢生長(zhǎng)。一般需加入10％－20％血清，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，稱(chēng)為生長(zhǎng)液。添加血清，雖利于細(xì)胞生長(zhǎng)，但不明成分也增多了，對(duì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了困難。人們正在探索不用血清的無(wú)血清培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基(液)的配制

無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基血清中究竟哪些成分是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的呢?幾十年來(lái)沒(méi)有明確答案。還有一些細(xì)胞在血清培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。另外，由于血清成分復(fù)雜，常常給細(xì)胞培養(yǎng)后的研究工作，如細(xì)胞產(chǎn)物的提取、激素和藥物作用機(jī)理的研究帶來(lái)困難。

1975年，Sato成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株CH4，還有人用HamF12無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基成功地克隆了CHO細(xì)胞。近20多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系(株)在無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖，這些細(xì)胞有內(nèi)分泌細(xì)胞、表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞等。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定McAb、淋巴因子、干擾素等細(xì)胞產(chǎn)物的程序，降低疫苗反應(yīng)。無(wú)血清培養(yǎng)基(液)

無(wú)血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:必須根據(jù)不同的培養(yǎng)細(xì)胞選用合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、RPMI-1640、IMDM、DMEM：F12＝1：1、RPMI-1640：DMEM：F12=2：1：1等，其中DMEM和F12混合培養(yǎng)液為多種細(xì)胞使用，根據(jù)不同細(xì)胞的要求，每升中補(bǔ)加Hepes15mmol，NaHCO31.2—2.4克。

無(wú)血清培養(yǎng)基的補(bǔ)充成分:補(bǔ)充成分即代替血清的各種因子的總稱(chēng)。多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)液必須補(bǔ)加3～8種因子，任何單一因子不能取代血清，至少需兩種。已知有100多種此類(lèi)因子，其中有些是必需補(bǔ)充因子，如胰島素、硒酸鈉(Na2SeO3)和轉(zhuǎn)鐵蛋白，其它多數(shù)為輔助作用因子。補(bǔ)充成分按功能將其分成四類(lèi)。無(wú)血清培養(yǎng)基(液)

⑴激素和生長(zhǎng)因子:很多細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)需加入激素，如胰島素(Ins)、生長(zhǎng)激素、胰高血糖素等。此外，甾體激素如孕酮、氫化可的松、雌二醇等也是無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常用的補(bǔ)充因子。每種細(xì)胞至少有2～3種生長(zhǎng)因子對(duì)其正常生存和增殖起著調(diào)節(jié)作用，因此估計(jì)機(jī)體中約有100多種生長(zhǎng)因子。按結(jié)構(gòu)和功能可分為表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等。生長(zhǎng)因子是有效的促有絲分裂原，能縮短細(xì)胞倍增時(shí)間。無(wú)血清培養(yǎng)基(液)

⑵結(jié)合蛋白:結(jié)合蛋白有兩種，一種是轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)，它能增強(qiáng)細(xì)胞攝取和利用培養(yǎng)液中鐵的能力，還可結(jié)合毒性金屬離子，不同細(xì)胞需要量不同。另一種是白蛋白，它與脂類(lèi)、金屬離子、激素等結(jié)合后，具有刺激細(xì)胞增殖作用。

⑶貼壁因子絕大多數(shù)真核細(xì)胞在體外生長(zhǎng)時(shí)需要固著于適當(dāng)?shù)幕?，幫助?xì)胞固著貼附的物質(zhì)叫貼壁因子或胞外基質(zhì)。體外培養(yǎng)細(xì)胞常于粘著斑(adhensionplaque)或其近旁發(fā)現(xiàn)纖黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，此處質(zhì)膜下正是紐帶蛋白(vinculin)及α-輔助肌動(dòng)蛋白(α-actin)存在部位。肌動(dòng)蛋白絲借助這兩種蛋白質(zhì)附著于質(zhì)膜的內(nèi)表面。FN又與非膠原糖蛋白相連。膜上FN受體將細(xì)胞外基質(zhì)FN與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲相連。這樣，胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜受體及細(xì)胞內(nèi)某些分子直接或間接作用，共同形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一體，成為控制細(xì)胞形態(tài)、功能、生長(zhǎng)、分化以及某些其它性質(zhì)(如影響質(zhì)膜中蛋白質(zhì)的組織等)的重要因素之一。如體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存活及分化主要決定于所提供的細(xì)胞外基質(zhì)；肌細(xì)胞分化，肝細(xì)胞和乳腺細(xì)胞的形態(tài)、代謝，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程，都與ECM有關(guān)。無(wú)血清培養(yǎng)基(液)

⑷微量元素微量元素對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)期傳代的作用于1981年由Murakam首先報(bào)道。硒元素不僅具有抗過(guò)氧化物酶對(duì)細(xì)胞的毒副作用，還可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。1983年Clereand用一組復(fù)雜的微量元素，使8株雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。

酶抑制劑實(shí)驗(yàn)證實(shí)長(zhǎng)期使用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，會(huì)改變細(xì)胞的某些特性。是因?yàn)樵诩?xì)胞傳代時(shí)，常需借助酶的作用，無(wú)血清培養(yǎng)基缺乏對(duì)細(xì)胞保護(hù)的成分，殘余的酶會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，因此無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)必須添加酶抑制劑以中止殘余酶的作用。目前常用的是大豆胰酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor)，使用濃度為0.1％－0.5％，濾過(guò)除菌后，將其加在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)。目前無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基仍處在探索階段，尚無(wú)固定配方。無(wú)血清培養(yǎng)基(液)

pH調(diào)整液:合成培養(yǎng)基大都呈弱酸性，而細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH為7.0－7.2，可忍耐的pH范圍6.6－7.8。pH到7.6時(shí)，細(xì)胞雖有代謝但不再分裂增殖，故使用培養(yǎng)基時(shí)要調(diào)整pH，并注意培養(yǎng)過(guò)程中的pH變化以及時(shí)換液。常用的pH調(diào)整液是NaHCO3、HEPES等。細(xì)胞培養(yǎng)用液-其他溶液NaHCO3溶液:常用的濃度有7.4％、5.6％、3.7％。

HEPES:為了較長(zhǎng)時(shí)間恒定pH，可使用緩沖能力較強(qiáng)HEPES（N－2－oxyethylpiperazineN’-2-ethanesulfonicacid，N-2-羥乙基派嗪-N’-2-乙磺酸），使用的終濃度為10－50mmol/L，可以根據(jù)緩沖能力的要求而定。

抗生素液:常用的有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、二性霉素等。常配成100×或200×于使用濃度的鹽溶液內(nèi)，分裝小瓶，冷凍保存。使用前加入到培養(yǎng)液內(nèi)，每小瓶最好一次用完。細(xì)胞培養(yǎng)用液-其他溶液

L-Glutamin(谷氨酸)溶液制備

L-Glutamin(分子量146.15)6g

三蒸水200ml

濾過(guò)除菌；分裝；－20℃保存；使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液加lml。(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)（primary

culture）從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長(zhǎng)緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以?xún)?nèi)）停止生長(zhǎng)。

細(xì)胞株（cell

strain）從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過(guò)程中其特征始終保持。

細(xì)胞系（cell

line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無(wú)限繁殖

克?。╟lone）亦稱(chēng)無(wú)性繁殖系或無(wú)性系。對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。

二、細(xì)胞培養(yǎng)的方法原代細(xì)胞培養(yǎng)方法與步驟

⑴取材⑵消化與分散組織⑶離心和計(jì)數(shù)

⑷接種培養(yǎng)⑸觀(guān)察

單層細(xì)胞培養(yǎng)法（見(jiàn)錄像）和組織塊培養(yǎng)法。

細(xì)胞換液：全量換液和半量換液。換液時(shí)機(jī)的選擇：培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃。細(xì)胞狀態(tài)。二、細(xì)胞培養(yǎng)的方法

鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)

取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個(gè)孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過(guò)毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開(kāi)皮膚，剖腹取出子宮置于無(wú)菌平皿中。用消過(guò)毒的剪刀剪開(kāi)子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污。

切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。

消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀(guān)察消化情況（每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（二）細(xì)胞傳代培養(yǎng)

⑴原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株。

⑵細(xì)胞系傳代以得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。⑶接觸抑制。⑷營(yíng)養(yǎng)枯竭。⑸方法：洗細(xì)胞，消化，接種，觀(guān)察。將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)器皿中消化下來(lái)，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。(懸浮細(xì)胞的直接和離心傳代)

細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同，在一代中，細(xì)胞培增3～6次。二、細(xì)胞培養(yǎng)的方法

（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特征與形態(tài)分型

1.單層培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程⑴游離期：懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。⑵吸附期：貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。⑶潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。⑷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（增殖期）：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。⑸停止期（平臺(tái)期/維持期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴(lài)性。⑹衰退期：細(xì)胞內(nèi)顆粒進(jìn)一步增多，透明度降低，立體感差。最后細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，從瓶壁上脫落下來(lái)。

三、體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀(guān)察方法

（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特征與形態(tài)分型

2.培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)分類(lèi)按生長(zhǎng)方式:貼壁型細(xì)胞（Monolayercells）。懸浮型細(xì)胞（Suspensioncells）。絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬貼壁型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。按細(xì)胞形態(tài)(貼壁細(xì)胞）：成纖維型細(xì)胞（Fibroblast-likedcells）。上皮型細(xì)胞（Epithelium-likedcells）。其它，不定型。

三、體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀(guān)察方法成纖維型細(xì)胞梭形或不規(guī)則三角形中央有卵圓形核胞質(zhì)向外伸出長(zhǎng)短不同的突起中胚層間質(zhì)起源

上皮型細(xì)胞扁平不規(guī)則多角形細(xì)胞中央有圓形核緊密相連單層膜樣生長(zhǎng)內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等

游走型細(xì)胞散在生長(zhǎng)，一般不連成片細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期多形細(xì)胞型難以確定規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)如神經(jīng)組織的細(xì)胞等

（二）細(xì)胞計(jì)數(shù)方法與顯微測(cè)量三、體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀(guān)察方法

（一）細(xì)胞的凍存方法四、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸冷凍保存要點(diǎn)冷凍過(guò)程要緩慢：4℃30～60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時(shí)（或過(guò)夜）→液氮長(zhǎng)期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90％，無(wú)微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：5×106～2×107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液5%或10％DMSO(二甲基亞砜，終濃度＜1%)＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液不含DMSO細(xì)胞凍存液

（二）細(xì)胞的復(fù)蘇四、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過(guò)3分鐘）解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中(一)生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定五、培養(yǎng)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)方法細(xì)胞懸液制備接種細(xì)胞技術(shù)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)

(二)分裂指數(shù)測(cè)定分裂指數(shù)＝分裂細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%

(三)克隆(集落)形成試驗(yàn)

(四)BrdU滲入法測(cè)定細(xì)胞增殖指數(shù)(一)細(xì)胞污染的種類(lèi)六、細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)

細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒

(二)污染源

無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細(xì)胞

白色念珠菌污染真菌感染

支原體污染電鏡照片,煎蛋狀和其他形狀95％以上是以下四種支原體：口腔支原體(M.orale)，精氨酸支原體(M.arginini)，豬鼻支原體(M.hyorhinis)，牛萊氏無(wú)膽甾原體(A.laidlawii)