生物化學(xué) 第四章 核酸

第四章核酸化學(xué)

主要內(nèi)容：介紹核酸的分類和化學(xué)組成，重點討論DNA和RNA的結(jié)構(gòu)特征，初步認識核酸的結(jié)構(gòu)特征與其功能的相關(guān)性；介紹核酸的主要理化性質(zhì)和核酸研究的一般方法。核酸(nucleicacid)以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。DNA（Deoxyribonucleicacid)脫氧核糖核酸RNA（Ribonucleicacid)核糖核酸第一節(jié)核酸通論一、核酸的研究歷史和重要性二、核酸的種類和分布三、核酸的生物功能一.核酸的研究歷史和重要性

1869

Miescher從膿細胞的細胞核中分離出了一種含磷酸的有機物，當時稱為核素（nuclein）,后稱為核酸（nucleicacid）；此后幾十年內(nèi)，弄清了核酸的組成及在細胞中的分布。1944Avery等成功進行肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗；1952年Hershey等的實驗表明32P-DNA可進入噬菌體內(nèi)，證明DNA是遺傳物質(zhì)。1953Watson和Crick建立了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，說明了基因的結(jié)構(gòu)、信息和功能三者間的關(guān)系，推動了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展。1958Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則，60年代RNA研究取得大發(fā)展（操縱子學(xué)說，遺傳密碼，逆轉(zhuǎn)錄酶）。70年代建立DNA重組技術(shù)，改變了分子生物學(xué)的面貌，并導(dǎo)致生物技術(shù)的興起。80年代RNA研究出現(xiàn)第二次高潮：ribozyme、反義RNA、“RNA世界”假說等等。90年代以后實施人類基因組計劃（HGP）,開辟了生命科學(xué)新紀元。生命科學(xué)進入后基因時代：功能基因組學(xué)（functionalgenomics）蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）RNA組學(xué)（Rnomics）或核糖核酸組學(xué)（ribonomics二、核酸的分類及分布、功能(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸

90%以上分布于細胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。分布于胞核、胞液。攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型(genotype)。參與細胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。三、核酸的生物功能

(一)DNA是主要的遺傳物質(zhì)

1928年Griffith的細菌轉(zhuǎn)化實驗

1944年Avery重做1928年Griffith的細菌轉(zhuǎn)化實驗，證明DNA是遺傳物質(zhì)。但人們對此持懷疑態(tài)度，理由是：（1）因認為蛋白相對分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，二十種氨基酸的排列組合將是個天文數(shù)字，可作為一種遺傳信息。而DNA相對分子質(zhì)量小，只含4種不同的堿基，人們一度認為不同種的有機體的核酸只有微小的差異。（2）認為轉(zhuǎn)化實驗中DNA并未能提得很純，還附有其它物質(zhì)。（3）即使轉(zhuǎn)化因子確實是DNA，但也可能DNA只是對莢膜形成起著直接的化學(xué)效應(yīng)，而不是充當遺傳信息的載體。1952年HersheyandChase的實驗進一步證明DNA是遺傳物質(zhì)(二)RNA功能的多樣性1.某些病毒的遺傳物質(zhì);2.控制蛋白質(zhì)的合成(最主要的功能）;3.遺傳信息的加工;4.基因表達和細胞功能的調(diào)控;5.催化功能;6.在細胞分化和個體發(fā)育中發(fā)揮重要作用;7.在生命起源中可能有重要作用。第二節(jié)核酸的分子組成一、元素組成二、構(gòu)件單位：核苷酸三、核苷酸的生物學(xué)功能一、元素組成主要元素組成：C、H、O、N、P(9~11%)與蛋白質(zhì)比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩(wěn)定，占9.5%。核酸含量＝磷含量Ｘ10.5

二、核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O三、嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式

四、核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）五、核苷酸

5′-NMP5′-NDP5′-NTPN=A、G、C、U

5′-dNMP5′-dNDP5′-dNTPN=A、G、C、T腺苷酸及其多磷酸化合物AMPAdenosinemonophosphateADPAdenosinediphosphateATPAdenosinetriphosphate

各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA和DNA合成的直接原料。在體內(nèi)能量代謝中的作用：ATP——能量“貨幣”UTP——參加糖的互相轉(zhuǎn)化與合成CTP——參加磷脂的合成GTP——參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成第二信使——cAMP六、核苷酸的生物學(xué)功能作為核酸的單體細胞中的攜能物質(zhì)（如ATP、GTP、CTP、GTP）酶的輔助因子的結(jié)構(gòu)成分（如NAD）細胞通訊的媒介（如cAMP、cGMP）第三節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)一、

RNA的結(jié)構(gòu)RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通過3’，5’磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。（1）

組成RNA的戊糖是核糖（2）堿基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中還有一些稀有堿基。（3）天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是雙螺旋結(jié)構(gòu)。

雙螺旋區(qū)一般占RNA分子的50%左右。二、

RNA的類型細胞中的RNA，按其在蛋白質(zhì)合成中所起的作用，主要可分為三種類型。核糖體RNArRNA

轉(zhuǎn)運RNAtRNA信使RNAmRNA

此外，真核生物細胞中有少量核內(nèi)小RNA（smallnuclearRNAsnRNA）

OHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-OO—CH2GO=P—O-3′5′OHOO—CH2OHOHAO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA（一）、

tRNAtRNA約占全部RNA的15%主要功能：在蛋白質(zhì)生物合成過程中轉(zhuǎn)運氨基酸。已知一級結(jié)構(gòu)的tRNA有多種，每種tRNA可運載一種特定的aa，一種aa可由一種或多種tRNA運載。結(jié)構(gòu)特點：①分子量在25kd左右，70-90b，沉降系數(shù)4S左右。②堿基組成中有較多稀有堿基。③3’末端為…CpCpA-OH，用來接受活化的氨基酸，此末端稱接受末端。④5’末端大多為pG…或pC…⑤二級結(jié)構(gòu)是三葉草形a.配對堿基形成局部雙螺旋而構(gòu)成臂，不配對的單鏈部分則形成環(huán)。三葉草型結(jié)構(gòu)由4臂4環(huán)組成。b.氨基酸臂由7對堿基組成，雙螺旋區(qū)的3’末端為一個4個堿基的單鏈區(qū)-NCCA-OH3’，腺苷酸殘基的羥基可與氨基酸α羧基結(jié)合而攜帶氨基酸。c.二氫尿嘧啶環(huán)以含有2個稀有堿基二氫尿嘧啶而得名，不同tRNA其大小并不恒定，在8-12個核苷酸之間變動，二氫尿嘧啶臂一般由3~4對堿基組成。d.反密碼環(huán)由7個核苷酸組成，大小相對恒定，其中3個核苷酸組成反密碼子，在蛋白質(zhì)生物合成時，可與mRNA上相應(yīng)的密碼子配對。

次黃嘌呤核苷酸（也稱肌苷酸，縮寫為I）常出現(xiàn)于反密碼子中。反密碼臂由5對堿基組成。1966年Crick對于tRNA能識別幾種密碼子的現(xiàn)象，提出堿基配對的“擺動學(xué)說”：認為除A-U、G-C配對外，還有非標準配對，I-A、I-C、I-U，并強調(diào)密碼子的5’端第1、2個堿基嚴格遵循標準配對，而第3個堿基可以非標準配對，具有一定程度的擺動靈活性。e.額外環(huán)在不同tRNA分子中變化較大可在3~18個核苷酸之間變動，又稱為可變環(huán)。其大小往往是tRNA分類的重要指標。f.TψC環(huán)（假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)）含有7個核苷酸，大小相對恒定。幾乎所有的tRNA在此環(huán)中都含TψC序列。

TψC臂由5對堿基組成。

⑥tRNA的三級結(jié)構(gòu)：二十世紀七十年代初科學(xué)家用X線射衍技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)tRNA的三級結(jié)構(gòu)為倒L形。

tRNA三級結(jié)構(gòu)的特點是氨基酸臂與TψC臂構(gòu)成L的一橫，-CCAOH3’末端就在這一橫的端點上，是結(jié)合氨基酸的部位。而二氫尿嘧啶臂與反密碼臂及反密碼環(huán)共同構(gòu)成L的一豎，反密碼環(huán)在一豎的端點上，能與mRNA上對應(yīng)的密碼子識別，二氫尿嘧啶環(huán)與TψC環(huán)在L的拐角上。在tRNA中堿基堆積力是穩(wěn)定tRNA構(gòu)型的主要因素。

（二）、mRNAmRNA是從DNA上轉(zhuǎn)錄而來的，其功能是依據(jù)DNA的遺傳信息，指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的生物合成，每一種蛋白質(zhì)都由一種相應(yīng)的mRNA編碼。細胞內(nèi)

mRNA種類很多，大小不一，但每種含量極低。從功能上講，一個基因就是一個順反子，原核生物的mRNA是多順反子，真核mRNA是單順反子。順反子：是由順反試驗所規(guī)定的遺傳單位，相當于一種蛋白質(zhì)的基因。

1、真核mRNA（1）、3’-端有一段約30-300核苷酸的polyA

PolyA是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶對mRNA專一，不作用于rRNA和tRNA。原核mRNA一般無polyA。polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA，其polyA較長；而衰老的mRNA，其polyA較短。polyA功能：a.PolyA是mRNA由核進入胞質(zhì)所必需的形式。b.PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。（2）、5’-帽子5’末端的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個核苷酸相連，形成5’-5’-磷酸二酯鍵。帽子結(jié)構(gòu)有三種類型：O型（m7G5’ppp5’Np）I型（m7G5’ppp5’Nmp-Np）II型（m7G5’ppp5’NmpNmpNp）帽子的功能：a.可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。b.可為核糖體提供識別位點，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。

hnRNA內(nèi)含子(intron)mRNA

外顯子(exon)*真核生物mRNA成熟過程2、原核mRNA（多順反子）原核mRNA由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5’帽子和3’polyA。舉列：MS2病毒mRNA，3569b，有三個順反子，分別編碼A蛋白、外殼蛋白和復(fù)制酶三種蛋白質(zhì)。5’端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5’-AGGAGGU-3’，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。SD序列和核糖體16S的rRNA的3’末端富含嘧啶堿基的序列互補，這種互補序列與mRNA對核糖體的識別有關(guān)。原核mRNA代謝很快，半壽期幾秒至十幾分鐘。

（三）、rRNArRNA占總RNA的80%左右。功能：rRNA是構(gòu)成核糖體的骨架，與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體，為蛋白質(zhì)的合成提供場所。大腸桿菌中有三類rRNA（原核）5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA真核細胞有四類rRNA5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA原核生物

真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA70S（30S、50S）16S、5S、23S80S（40S、60S）18S、5S、5.8S、28S

三、RNA組

人們逐漸認識到DNA是攜帶遺傳信息分子，蛋白質(zhì)是執(zhí)行生物學(xué)功能分子，而RNA即是信息分子，又是功能分子。為此20世紀末科學(xué)家在提出蛋白質(zhì)組學(xué)后，又提出RNA組學(xué)。

目前RNA組的研究尚處在初級階段，RNA組的研究將在探索生命奧秘中做出巨大貢獻。

第二節(jié)脫氧核糖核酸（DNA）一、DNA的堿基組成組成DNA的四種堿基：A、G、C、T50年代，Chargaff，Markham等應(yīng)用紙層析及分光光度計大量測定了各種生物的DNA堿基組成后，發(fā)現(xiàn)如下規(guī)律：1、A=T，G=C。即A+G=C+T。嘌呤與嘧啶的總含量相等。2、DNA堿基組成有嚴格的種的特異性，即不同的生物具有自己獨特的堿基組成。3、堿基組成沒有組織和器官的特異性。4、生長發(fā)育階段、營養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境的改變都不影響DNA的堿基組成。二、DNA的一級結(jié)構(gòu)DNA的一級結(jié)構(gòu)是4種脫氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通過3’，5’磷酸二酯鍵連接起來的線形或環(huán)狀多聚體。核酸中的核苷酸以3’，5’磷酸二酯鍵構(gòu)成無分支結(jié)構(gòu)的線性分子。

書寫方法：5’→3’5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’（在DNA中，3/-OH一般是游離的）在DNA分子中，不變的骨架成分磷酸二酯鍵被逐漸省略，真正代表DNA生物學(xué)意義的是堿基的排列順序。遺傳信息貯存在DNA的堿基排列順序中，生物界生物的多樣性即寓于DNA分子4種核苷酸千變?nèi)f化的精確的排列順序中。三、DNA的空間結(jié)構(gòu)1953年，Watson和Crick根據(jù)Chargaff規(guī)律和DNANa鹽纖維的X光衍射數(shù)據(jù)提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析。相對濕度92%，DNA鈉鹽結(jié)晶，B—DNA。相對濕度75%，DNA鈉鹽結(jié)晶，A—DNA。Z—DNA。生物體內(nèi)DNA絕大部分為B—DNA。（一）、B—DNA的結(jié)構(gòu)1、兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條5’→3’，另一條3’→5’2、嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼此通過3’,5’-磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的骨架。

寬1.2nm寬0.6nm大溝小溝深0.85nm深0.75nm

3、螺旋平均直徑2nm，每圈螺旋含10個核苷酸堿基堆積距離：0.34nm螺距：3.4nm4、兩條核苷酸鏈，依靠彼此堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起。堿基平面垂直于螺旋軸。A=T（兩個氫鍵）、G=C（三個氫鍵）。堿基互補原則具有極重要的生物學(xué)意義，DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等的分子基礎(chǔ)都是堿基互補。重要特性：1、DNA分子的長度往往很長，如：E.coli的DNA分子量為2.6x109或由4x106堿基組成，長度為1.4x106nm。長度和直徑不對稱，如此細長的分子對任何機械力作用都十分敏感。往往制備的DNA樣品是降解了片段。2、DNA分子結(jié)構(gòu)中的堿基互變異構(gòu)體：A和C上氮原子常處于氨基的狀態(tài)，G和T氧原子常為酮式。很少有亞胺和烯醇式。否則堿基互補配對就不復(fù)存在。A就很易和C配對，G就很易和T配對。另一方面，偶而也可形成亞胺和烯醇式，可能這就是DNA復(fù)制引起突變的原因之一，這種突變是生物進化的動力。3、DNA分子的穩(wěn)定性：①堿基堆積力（主要因素）形成疏水環(huán)境。②堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。③磷酸基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。④堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。4、DNA分子的可塑性：在溶液中DNA分子具有較大的可塑性。由于分子上局部區(qū)域受熱力學(xué)的作用，往往使DNA分子發(fā)生彎曲，纏繞或伸展。這種分子變形并不是由于互補堿基對之間的氫鍵瞬間斷裂的結(jié)果，而是由于DNA分子多核苷酸鏈的骨架上的共價鍵的轉(zhuǎn)角改變所引起的。

（二）、A-DNA的結(jié)構(gòu)在相對濕度75%以下所獲得的DNA纖維。A-DNA也是右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。（三）、Z-DNA的結(jié)構(gòu)左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。說明B-DNA與Z-DNA之間是可以互相轉(zhuǎn)變的。Z-DNA只有一條小溝。

四、環(huán)形DNA生物體內(nèi)有些DNA是以雙鏈環(huán)狀DNA的形式存在，包括：某些病毒DNA、某些噬菌體DNA、某些細菌染色體DNA、細菌質(zhì)粒DNA、真核細胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA1、環(huán)形DNA的不同構(gòu)象松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負超螺旋（1）、松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、正超螺旋與負超螺旋DNA線形DNA擰緊或擰松后再環(huán)化，成為超螺旋結(jié)構(gòu)。繩子的兩股以右旋方向纏繞，如果在一端使繩子向纏緊的方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會產(chǎn)生一個左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋叫正超螺旋。如果在繩子一端向松纏方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，會產(chǎn)生一個右旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負超螺旋。對于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)小于10.4，則其二級結(jié)構(gòu)處于緊纏狀態(tài)，是正超螺旋。如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)大于10.4，則其二級結(jié)構(gòu)處于松纏狀態(tài)，是負超螺旋。

2、拓撲異構(gòu)酶此酶能改變DNA拓撲異構(gòu)體的L值。①拓撲異構(gòu)酶酶I（擰緊）能使雙鏈負超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使L值增加1，同時，使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成正超螺旋。②拓撲異構(gòu)酶酶II（擰松）能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負超螺旋形DNA，每次催化使L減少2，同時能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳DNA。

五、

DNA的生物學(xué)功能直接證明DNA的遺傳功能的是Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗。間接的證據(jù)：1、DNA分布在染色體內(nèi)，是染色體的主要成分，而染色體是直接與遺傳有關(guān)的。2、細胞核內(nèi)DNA含量十分穩(wěn)定，而且與染色體數(shù)目的多少有平行關(guān)系，體細胞（雙倍體）DNA含量為生殖細胞（單倍體）DNA含量的兩倍。3、DNA在代謝上較穩(wěn)定，不受營養(yǎng)條件，年齡等因素影響。4、可作用于DNA的一些物理和化學(xué)因素，如：紫外線、X－射線、氮芥等都可以引起遺傳特性的改變。第四節(jié)核酸的某些理化性質(zhì)與常用的研究方法一、酸性化合物

兩性解離，但酸性強電泳行為——泳向正極（pH7-8）等電點：RNApH2.0—2.5DNApH4.0—4.5二、核酸的水解DNA和RNA中的糖苷鍵與磷酸酯鍵都能用化學(xué)法和酶法水解。1、

酸水解：在酸性條件下DNA和RNA都會發(fā)生磷酸二酯鍵水解。并且堿基和核糖之間的糖苷鍵更易被水解，其中嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定。2堿水解：RNA的磷酸酯鍵易被水解，而DNA的磷酸酯鍵不易被水解。室溫，0.3--1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。在相同條件下，DNA不被水解。這是因為RNA中C’2-OH的存在，促進了磷酸酯鍵的水解。DNA、RNA水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。DNA穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后降解。3、酶水解：水解核酸的酶有很多種，若按底物專一性分類：作用于RNA的稱為核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）作用于DNA的則稱為脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）。按對底物作用方式分類：核酸內(nèi)切酶（endonuclease）、核酸外切酶（exonuclease）核酸內(nèi)切酶是非常重要的工具酶，在基因工程中有廣泛用途。而核酸外切酶只對核酸末端的3’，5’磷酸二酯鍵有作用，將核苷酸一個一個切下，可分為5’→3’外切酶，與3’→5’外切酶。

三、核酸的紫外吸收堿基具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有強烈的光吸收，λmax=260nm1、鑒定純度純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8，若大于1.8，表示污染了RNA。純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。

2、含量計算1個吸光度值相當于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單螺旋DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：在DNA的變性過程中，吸光系數(shù)增大。減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過程中，吸光系數(shù)減小。

四、核酸的分離純化要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。條件溫和，防止過酸、過堿。避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。1、DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L），但不溶于0.14mol/LNacl中，利用此性質(zhì)，提取出DNP。DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。2、RNA的制備（重點介紹mRNA的分離、純化）用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等必須防止RNA酶對RNA的破壞。五、核酸的沉降特性不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來。應(yīng)用溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心，很容易將不同構(gòu)象的DNA、RNA及蛋白質(zhì)分開，這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。六、凝膠電泳1、瓊脂糖電泳①

核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比②

凝膠濃度③

DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。④

電流，不大于5V/cm電泳完以后，用熒光染料溴化乙錠染色。經(jīng)紫外光照射，可發(fā)出紅-橙色可見熒光。此方法十分靈敏，0.1ugDNA即可用此法檢出。凝膠上的樣品還可回收，供進一步研究之用。

2、

PAGE電泳聚丙烯酰胺凝膠孔徑比瓊脂糖凝膠要小，所以可用分析小于1000bp的DNA和RNA片段。也用溴化乙錠染色，但發(fā)出熒光很弱，濃度很低的樣品不能用此法檢測出來，需要用亞甲藍或銀染來顯示。七、核酸的變性、復(fù)性和雜交變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對蛋白質(zhì)來說，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。這也是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。（一）、變性在一定理化因素作用下，核酸雙螺旋等空間結(jié)構(gòu)中堿基之間的氫鍵斷裂，變成單鏈的現(xiàn)象稱為變性。不涉及共價鍵斷裂。多核苷酸骨架上共價鍵的斷裂稱核酸的降解。DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。熱變性因素酸堿變性（pH小于4或大于11，堿基間氫鍵全部斷裂）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）

260nm吸收值升高。變性后粘度降低，浮力密度升高。二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活。熔解溫度（Tm）或稱熔點：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度。DNA的Tm一般在85—95℃之間。（濃度50ug/mL時，雙鏈DNAA260=1.00，完全變性（單鏈）A260=1.37.當A260增加到最大增大值一半時，即1.185時，對應(yīng)的溫度即為Tm。）8090100100%50%OD260