分子生物學(xué)操作基本技術(shù)

質(zhì)粒操作（提取、酶切、電泳）細(xì)菌DNA提取細(xì)菌間基因重組講課內(nèi)容：一、細(xì)菌核酸的基本知識(shí)1、染色體主要遺傳成分，攜帶基本代謝的全部基因，呈共價(jià)閉合環(huán)狀(CovalentlyClosedCircle，簡(jiǎn)稱CCC)

，一般只有一條，在細(xì)胞中以緊密纏繞成的較致密的擬核(nucliod)，其上結(jié)合有類組蛋白蛋白質(zhì)和少量RNA分子，使其壓縮成一種手腳架形的致密結(jié)構(gòu)。生物分子量（Da）堿基對(duì)約數(shù)長(zhǎng)度（mm）蛙—2.3×10106700人—3×109870果蠅—8×10724脈孢菌2.8×10104.5×107—大腸桿菌2.5×1094.6×1061.5噬菌體T21.3×1083×1050.056λ噬菌體3.2×1075×1040.016多瘤病毒3×106——染色體上編碼各種功能的基因比例,%

編碼的功能)大腸桿菌(Escherichiacoli)流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)生殖道枝原體（Mycoplasmagenitalium）代謝21.019.014.6結(jié)構(gòu)5.54.73.6運(yùn)輸10.07.07.3調(diào)節(jié)8.56.66.0翻譯4.58.021.6轉(zhuǎn)錄1.31.52.6復(fù)制2.74.96.8已知的其他8.55.25.8未知38.143.032.02、質(zhì)粒一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子。通常以共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中；質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb；（細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）（1）宿主細(xì)胞染色體DNA分子量明顯大于細(xì)胞所含質(zhì)粒DNA分子量，如大腸桿菌（Escherichiacoli）染色體的DNA分子為4.6×103kb左右，而通常用于基因工程中的載體一般均小于10kb，1~100×106Da。（2）質(zhì)粒所攜帶的遺傳信息量較少。攜帶的遺傳信息所一般只與宿主細(xì)胞的某些次要特性有關(guān)，而并不關(guān)系到細(xì)胞的生死存亡。

微生物質(zhì)粒DNA與染色體DNA差別在于：質(zhì)粒具有下列特性：①

可轉(zhuǎn)移性。即某些質(zhì)粒可以細(xì)胞間的接合作用或其它途徑從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。②

可整合性。在某種特定條件下，質(zhì)粒DNA可以可逆性地整合到宿主細(xì)胞染色體上，并可以重新脫離。③可消除性。經(jīng)某些理化因素處理如加熱、或加入丫啶橙或絲裂霉素C、溴化乙錠等，質(zhì)粒可以被消除。

高拷貝數(shù)(highcopynumber)質(zhì)粒（每個(gè)宿主細(xì)胞中有10-100個(gè)拷貝）

———————松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)低拷貝數(shù)(lowcopynumber)質(zhì)粒（每個(gè)宿主細(xì)胞中有1-4個(gè)拷貝）

———————嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)窄宿主質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）廣宿主質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）質(zhì)粒的相容性：不同質(zhì)粒在同一宿主細(xì)胞內(nèi)的共存性。有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，能自主復(fù)制；具有明顯的篩選標(biāo)記，如：

（1）Ampr水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）tetr可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

（3）camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（長(zhǎng)那霉素衍生物）失活

（5）hygr使潮霉素β失活。

有克隆位點(diǎn)（MCS外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量盡量小，以容納較大的外源DNA?；蚬こ藤|(zhì)粒載體的特點(diǎn)本來不能在含青霉素的平板上生長(zhǎng)的受體菌在轉(zhuǎn)化子（含有Ampr質(zhì)粒）周圍形成衛(wèi)星菌落（b-內(nèi)酰胺酶分泌到胞外所致）克隆載體：pUC18/19

注意：藍(lán)白斑需要誘導(dǎo)啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。純化標(biāo)簽His-tag和S-tag凝血酶切點(diǎn)藍(lán)白斑篩選需要誘導(dǎo)廣宿主載體pBBRMCS系列

復(fù)制起始位點(diǎn)通用

Mob負(fù)責(zé)接合轉(zhuǎn)移藍(lán)白斑無須誘導(dǎo)自殺性載體pSC123

復(fù)制起始位點(diǎn)需要特殊蛋白結(jié)合

TraJ負(fù)責(zé)接合轉(zhuǎn)移Mariner負(fù)責(zé)跳躍pBK-CMV：原核、真核雙元表達(dá)載體反向篩選標(biāo)記NucleicAcidResearch,2006,IF:7.552二、針對(duì)質(zhì)粒和總DNA的操作質(zhì)粒的提取總DNA的提取質(zhì)?；駾NA片段的酶切酶連電泳酶切產(chǎn)物的回收1.質(zhì)粒的提取溶液I:50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)；溶液II:0.2mol/LNaOH,1%SDS(現(xiàn)配現(xiàn)用)；溶液III:乙酸鉀溶液(3M,pH=4.8)(60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2O)；RNaseA：10mg/ml；TE緩沖液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0。1挑取轉(zhuǎn)化篩選的帶有目的質(zhì)粒的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)；2將1.5mL菌液加入Ep離心管中，12000g離心30Sec，棄上清液，在吸水紙上扣干；

離心時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免影響下一步的菌體懸浮3加入100L預(yù)冷的溶液I，于渦旋振蕩器上振蕩懸浮細(xì)菌細(xì)胞，盡量使細(xì)胞分散；

溶液I中的葡萄糖的作用是增大粘度，減少提取過程中的機(jī)械剪切力，防止染色體DNA的斷裂；EDTA的作用是與二價(jià)離子（Ca2＋）結(jié)合，降低DNase對(duì)DNA的降解。4加入200L新配制的溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管,以混勻內(nèi)容物,冰上放置3－5min;

溶液II中的NaOH與SDS可裂解細(xì)胞，使DNA變性以及SDS使蛋白變性并形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

5加入150l溶液III,加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置2～3min；

溶液III為低pH的醋酸鉀緩沖液，中和NaOH，以便使變性的閉環(huán)質(zhì)粒復(fù)性，而細(xì)菌染色體DNA不能正確復(fù)性612000g離心6min，將上清移入另一干凈的Ep管中7加2倍上清體積(約1mL)的無水乙醇,振蕩混勻，室溫放置2min.812000g離心10min，棄上清液，再用70％的乙醇洗滌一次，12000g離心1min，離心管倒置于吸水紙上扣干，然后在真空濃縮系統(tǒng)上干燥質(zhì)粒；9加入40L含20g/mLRNaseA的滅菌蒸餾水或TE緩沖液溶解提取物，室溫放置直到質(zhì)粒完全溶解(約8min)，存于－20℃或直接用于酶切。細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸2.總DNA的提取基本原理和過程：①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。細(xì)胞破碎

SDS：SDS是有效的陰離子去垢劑,細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價(jià)鍵。CTAB：CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA和蛋白的分離蛋白質(zhì)：常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）RNA：常選用RNase消化多糖：提取液中加1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)

。DNA純化（去雜質(zhì)）1）-70℃冰箱劃出保存菌種，30℃LBM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；2）選取分隔良好的單菌落，接種到200mlLB液體培養(yǎng)基中，30℃，震蕩培養(yǎng)過夜；3）4℃，4000rpm，10min回收菌體，用20ml0.85%NaCl，洗滌兩到三次；4）去除上清液，用TE緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，室溫反應(yīng)30min；5）加入10%SDS，至終濃度1%，50℃，10min；6）加入20mg/ml的蛋白酶K，至終濃度100μg/ml，溫和顛倒離心管數(shù)次，37℃過夜反應(yīng)或50℃3hr。7）加入5MNaCl到終濃度0.7M，充分混勻，然后加入1/10體積的CTAB/NaCl，混勻，65℃，20min；8）冷卻到室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，8000rpm,10min，4℃離心，回收水相；9）重復(fù)抽提溶液，直至沒有白色界面出現(xiàn)，上清加入1/10體積的3MNaAc（pH7.0），0.6倍體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻；10）用頂端封閉的L型毛細(xì)管勾出絲狀DNA沉淀，轉(zhuǎn)入70%乙醇中漂洗，晾干片刻，（不可完全干透，否則極其難溶解），于3-5ml的TE中輕輕攪動(dòng)，使其脫落，4℃放置過夜，使完全溶解。RNase可在step6加入TotalDNAextraction限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。3.限制性內(nèi)切酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬

種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口質(zhì)?；駾NA片段的酶切過程：

1、在0.5mLEp管中依次加入下列溶液于0.5ml離心管中

提取質(zhì)粒DNA3.0L10×bufferH1.0lEcoRI2.0U

ddH2O5.8L

10L

2、輕輕混勻,置于37℃水浴中酶解1.5h。

保護(hù)堿基：PCR產(chǎn)物末端限制酶切位點(diǎn)的切斷情況各種內(nèi)切酶在不同通用緩沖液中的活性雙酶切時(shí)通用緩沖液中的選擇和方法相鄰酶切位點(diǎn)的雙酶切效果相鄰酶切位點(diǎn)分步酶切時(shí)的效果雙酶切電泳檢測(cè)M.Marker;1PCRproduct;2.pET29a/KpnI&XhoI

3~4pET29a-nph/KpnI&XhoI;5.pET29a-nph;6.pET29aM..λDNA/HindⅢMarker;1.pUC19;2.pCFT23.pCFT2/EcoRⅠ;4.pCFT2/EcoRI&PstI4、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質(zhì)(密度與瓊脂糖濃度相關(guān))；生理?xiàng)l件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，因此將核酸分子置于電場(chǎng)中時(shí)，它們會(huì)向正極遷移，由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)象。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快。

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2緩沖液在電泳過程中的一個(gè)作用是維持合適的pH。電泳時(shí)正極與負(fù)極都會(huì)發(fā)生電解反應(yīng)，正極發(fā)生的是氧化反應(yīng)（4OH--4e->2H2O+O2)，負(fù)極發(fā)生的是還原反應(yīng)（4H++4e->2H2)，長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿。一個(gè)好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強(qiáng)的緩沖能力，是溶液兩極的pH保持基本不變。電泳緩沖液的另一個(gè)作用是使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應(yīng)含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時(shí)電泳速度變慢；太高時(shí)就會(huì)造成過大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化。電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+

等離子，防止電泳時(shí)激活DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。

Tris-硼酸（TBE）

Tris-乙酸（TAE）

Tris-磷酸（TPE）常用電泳緩沖液TAE是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。其特點(diǎn)是超螺旋在其中電泳時(shí)更符合實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量，且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%。TAE的缺點(diǎn)是緩沖容量小，長(zhǎng)時(shí)間電泳（如過夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。TBE的特點(diǎn)是緩沖能力強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間電泳時(shí)可選用TBE，并且當(dāng)用于電泳小于1kb的片段時(shí)分離效果更好。TBE用于瓊脂糖凝膠時(shí)易造成高電滲作用，并且因與瓊脂糖相互作用生成非共價(jià)結(jié)合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收電泳中使用。TPE的緩沖能力也較強(qiáng)，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的電泳中使用。電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②使樣品呈色，使加樣操作更方便。③形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。上樣緩沖液溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng。核酸染色劑注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1.凝膠制備：制備0.8%瓊脂糖凝膠。稱取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100mL1×TAE緩沖液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴EB，小心混勻，倒到制膠槽上，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層，不要產(chǎn)生氣泡（厚度約為3～4mm）；室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子。制好膠后將凝膠連同內(nèi)槽放在含有1×TAE緩沖液的電泳槽中使用(注意:電泳槽中的緩沖液應(yīng)與配膠用的緩沖液成分、濃度一致)。2.加樣和電泳：用微量加樣器將樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳（切記靠近加樣孔的一端為負(fù)，

80～100V的電壓下電泳，一般情況下，電壓/電極間距離應(yīng)小于5V/cm），當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處停止電泳。

3.觀察拍照操作步驟酶切產(chǎn)物進(jìn)行制備型瓊脂糖電泳，電泳至條帶完全分開；在長(zhǎng)波紫外燈下切下所需條帶，盡量切除多余的瓊脂糖，置入1.5mleppendorf離心管中；65℃溶解凝膠，冷卻到室溫，加入1ml吸附樹脂，上下顛倒混勻；將樹脂轉(zhuǎn)移到連有吸附柱的注射管上，插入推桿，慢慢將樹脂擠入吸附柱；分開注射管，拉出推桿，然后連接注射管和吸附柱，加入2ml80%異丙醇，插入推桿，慢慢推下，清洗吸附小柱；取出吸附柱，放到eppendorf離心管上，10000g，20s離心；將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的離心管上，加入預(yù)熱到70℃左右的TE，放置1min；10000g，1min離心，將所需要的片段收集在離心管內(nèi)，-20℃保存。（該方法也可以直接回收酶切片段，對(duì)于500bp到15kb之間的DNA有很好的回收和純化效果）5酶切片段回收（(切膠)-樹脂吸附-洗脫回收）一般建立如下反應(yīng)體系：加入0.1μg載體DNA以及等摩爾量的外源DNA。加水至8.5μl，于45℃熱激5min，使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻到0℃，加入1μlT4連接酶緩沖液和0.5μlT4連接酶，16℃，酶連4小時(shí)以上，再4℃酶連過夜。6酶連三細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的方式細(xì)菌的三種水平基因轉(zhuǎn)移形式接合轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化接合(conjugation)：細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸（由F因子介導(dǎo)）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體作為載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(transformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細(xì)胞（一）細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化（genetictransformation）定義：游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移過程。1、轉(zhuǎn)化1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進(jìn)行轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：受體細(xì)胞處于感受態(tài)：最容易接受外源DNA的一種生理狀態(tài)。轉(zhuǎn)化因子：外源游離dsDNA分子

以革蘭氏陽性的肺炎雙球菌為材料，其轉(zhuǎn)化過程大體是：1、雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌的細(xì)胞表面特定位點(diǎn)結(jié)合。2、在位點(diǎn)上的DNA發(fā)生酶促分解，形成平均分子量為（4~5)x106D的DNA片段。3、DNA雙鏈中的一條單鏈逐步降解，同時(shí)，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞。4、轉(zhuǎn)化DNA單鏈與受體菌染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，接著受體染色體組的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA所交換和取代，于是形成了雜種DNA區(qū)段。5、受體菌染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個(gè)，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。當(dāng)細(xì)胞分裂后，此染色體分離形成了一個(gè)轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化全過程轉(zhuǎn)化整合過程轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：a）對(duì)核酸酶敏感；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率低b）不需要活的DNA供體細(xì)胞；人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。（二）細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式：一個(gè)細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)1普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)給體細(xì)菌染色體的任何部分到受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)過程2局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的過程溫和噬菌體感染整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的過程溫和噬菌體λ裂解時(shí)的不正常切割：包含gal或bio基因（幾率一般僅有10-6）3局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：a）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)是誤包；局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)是誤切。b）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性，包裝的可能全部是宿主菌的基因。(三)細(xì)菌的接合作用(conjugation)接合作用：通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息轉(zhuǎn)移和重組過程證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（BernardDavis，1950）2.機(jī)制接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)F因子的分子量通常為5×107Da

，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進(jìn)行的20多個(gè)基因。含有F因子的細(xì)胞：“雄性”菌株（F+），其細(xì)胞表面有性菌毛

不含F(xiàn)因子的細(xì)胞：“雌性”菌株（F-），細(xì)胞表面沒有性菌毛F因子的四種細(xì)胞形式a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。1）F+×F-雜交雜交的結(jié)果：給體細(xì)胞和受體細(xì)胞均成為F+細(xì)胞F+菌株的F因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株。2）Hfr×F-雜交Hfr菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leadingregion)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞（或稱接合子）大多數(shù)仍然是F-。感受態(tài)細(xì)胞的制備轉(zhuǎn)化雙親雜交三親雜交四、細(xì)菌基因重組的方法感受態(tài)細(xì)胞：所謂感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)，可以通過物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-Modification）缺陷的變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入的外源DNA的切割。

基本原理：細(xì)菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化1感受態(tài)細(xì)胞的制備1、從新活化的E.coliDH5α平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12h左右)；2、將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測(cè)一次OD600，至OD600為0.3～0.5時(shí)停止培養(yǎng)（細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右），并轉(zhuǎn)裝到1.5mL離心管中；3、培養(yǎng)物于冰上放置20min；4、0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞,冰浴20分鐘；（CaCl2純度至關(guān)重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率

）5、0～4℃，

4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min；6、0