第九章 吸光光度法

§9吸光光度法《基本要求》1.了解吸光光度法的特點(diǎn)和應(yīng)用。2.熟悉光的基本性質(zhì)和物質(zhì)對(duì)光的吸收情況。3.掌握朗白—比爾定律。4.熟悉吸光光度法儀器和測(cè)量原理。5.掌握吸光光度法分析條件的選擇。擬要解決的問(wèn)題1.光的基本性質(zhì)。2.物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收。3.物質(zhì)顏色與光吸收的關(guān)系。4.吸收曲線。5.朗白—比爾定律及其應(yīng)用條件。6.標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)和類型。8.吸光光度法分析條件的選擇。9.吸光光度法應(yīng)用。吸光光度法(AbsorpionPhotometry)：是基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法。是分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法,簡(jiǎn)稱光度法。吸光光度法主要有以下特點(diǎn)：靈敏度高。用于測(cè)定含量在1—10-3%的微量組分，甚至可以測(cè)定低至10-4—10-5%的痕量組分。儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快速。準(zhǔn)確度較高。一般吸光光度法的相對(duì)誤差為2-5%，若使用精密儀器，誤差可降至1-2%，完全能夠滿足微量組分的測(cè)定要求。應(yīng)用廣泛?？蓽y(cè)定絕大多數(shù)無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)物；既能用于定量分析，也可用于有機(jī)化合物定性分析，還可以測(cè)定某些物理化學(xué)常數(shù)及配合物的組成。一、光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二象性,不同波長(zhǎng)的光具有不同的能量，波長(zhǎng)越短，能量越高，反之亦然。通常意義的單色光是指其波長(zhǎng)處于某一范圍的光；而復(fù)合光則由不同的單色光組成，例如陽(yáng)光和白熾燈泡發(fā)出的光均為復(fù)合光。光按照波長(zhǎng)的長(zhǎng)短順序范圍排列成譜就得到電磁波譜或波譜，常用的波長(zhǎng)范圍為:§9.1物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收UVVISIR200～400nm400～750nm760nm～300mm電磁波譜的波長(zhǎng)范圍很寬，其中較窄的一段可見(jiàn)光譜在分析化學(xué)得到了最為廣泛的應(yīng)用，其波長(zhǎng)范圍在400～750nm。當(dāng)一束白光通過(guò)棱鏡后就色散成紅、橙、黃、綠、青、青藍(lán)、藍(lán)紫八種顏色的光，它們具有不同的波長(zhǎng)范圍。二、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收（一）物質(zhì)對(duì)光產(chǎn)生選擇性吸收的原因主要與物質(zhì)的分子內(nèi)部具有一系列的不連續(xù)的特征能級(jí)有關(guān)：E=

E電子＋E振動(dòng)＋E轉(zhuǎn)動(dòng)。當(dāng)光照射物質(zhì)分子時(shí)，分子中的電子會(huì)吸收光能hn，由基態(tài)越遷至激發(fā)態(tài)。若光能量hn恰好等于物質(zhì)分子的能級(jí)差DE，則光被分子吸收，電子由基態(tài)越遷至激發(fā)態(tài)。DE=E激發(fā)態(tài)-E基態(tài)=hn

由于不同物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)不同，其分子內(nèi)部的能級(jí)差不一樣，導(dǎo)致不同物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收具有選擇性。（二）物質(zhì)的顏色與光吸收的關(guān)系當(dāng)物質(zhì)（分子或離子）吸收了相當(dāng)可見(jiàn)能量的電磁波后，就會(huì)表現(xiàn)出被人眼所能觀察到的顏色。物質(zhì)之所以具有不同的顏色，這是它們對(duì)不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光具有選擇性吸收的結(jié)果。物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與它所吸收的顏色（波長(zhǎng)）有一定關(guān)系。例如，當(dāng)白光通過(guò)硫酸銅溶液時(shí)，銅離子選擇性的吸收了部分黃色光，使透過(guò)光中藍(lán)色光不能完全互補(bǔ)，所以溶液顯藍(lán)色。關(guān)系如圖10-1中所示。從下表也可以直觀看出。溶液顏色即為透射光顏色，與吸收光互補(bǔ)。溶液顏色吸收光顏色λ/nm黃綠黃橙紅紫紅紫藍(lán)青藍(lán)青紫藍(lán)青藍(lán)青綠黃綠黃橙紅400～450450～480480～490490～500500～560560～580580～600600～650650～750溶液顏色的深淺，取決于溶液吸收光的量，即取決于吸光物質(zhì)的濃度，濃度越大，吸收越多，溶液顏色越深。比色分析：通過(guò)目視比較溶液顏色深淺來(lái)確定溶液中吸光物質(zhì)含量的方法。光電比色分析：利用儀器代替目視比較溶液顏色深淺來(lái)確定溶液中吸光物質(zhì)含量的方法。光度分析：?jiǎn)紊骱蜋z測(cè)器改進(jìn)后的光電比色計(jì)。靈敏度和準(zhǔn)確度大為提高。（三）吸收曲線（吸收光譜）讓不同波長(zhǎng)的單色光依次照射某一吸光物質(zhì)，并測(cè)量該物質(zhì)在每一波長(zhǎng)處對(duì)光吸收程度的大?。ˋ），以波長(zhǎng)（l）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，即可以得到一條吸光度隨波長(zhǎng)變化的曲線，稱之為吸收曲線或吸收光譜，它能夠準(zhǔn)確地描述物質(zhì)對(duì)各種不同波長(zhǎng)吸收情況。吸收曲線中吸光度最大值處稱為最大吸收峰，對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)lmax。吸收曲線的形狀和lmax的位置取決于物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，不同的物質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)不同而具有各自特征的吸收曲線，據(jù)此可進(jìn)行定性分析。對(duì)于同一物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線的形狀和lmax的位置不變，但在同一波長(zhǎng)下，吸光度（A）隨濃度的增大而增大，據(jù)此可進(jìn)行定量分析。在lmax處測(cè)量吸光度的靈敏度最高，在沒(méi)有其它干擾的情況下一般選擇為lmax測(cè)量波長(zhǎng)。因此，吸收曲線是吸光光度法選擇波長(zhǎng)的依據(jù)。下圖是KMnO4溶液吸收曲線，它選擇性的吸收了525nm附近的綠青色光，而對(duì)綠青色光的互補(bǔ)色光400nm附近的紫色光幾乎不吸收，所以KMnO4溶液顯紫紅色，即KMnO4溶液的lmax為525nm。KMnO4溶液的吸收曲線（CKMnO4：a<b<c<d）一、朗白—比爾定律布格（Bouguer）和朗白（Lambert）先后在1729年和1760年闡明了物質(zhì)對(duì)光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系；1852年比爾（Beer）又提出了物質(zhì)對(duì)光的吸收程度和吸光物質(zhì)濃度之間也有類似的關(guān)系；二者歸一為光吸收基本定律：布格—朗白—比爾定律，簡(jiǎn)稱朗白—比爾(Lambert-Beer)定律。

§9.2光吸收的基本定律I0：入射光強(qiáng)度；It：透過(guò)光強(qiáng)度；b：吸收層厚度A：吸光度；T：透光度（透射比）；K：吸光系數(shù)透射比T＝It/I0又稱%透光率C：溶液濃度（一）朗白—比爾定律的物理意義當(dāng)一束平行的單色光垂直通過(guò)一均勻的非散射的吸光物質(zhì)時(shí)，其吸光度A與吸光物的濃度C及吸收層厚度b成正比—吸光光度法定量分析的理論依據(jù)。朗白—比爾定律是光吸收的基本定律，適用于所有電磁輻射和所有的吸光物質(zhì)（分子、原子）和離子的氣、液、固）。應(yīng)用前提：入射光為平行單色光且垂直照射。吸光物質(zhì)是均勻非散射體系。吸光物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)間無(wú)相互作用。輻射與物質(zhì)之間僅為簡(jiǎn)單光吸收過(guò)程，無(wú)熒光和光化學(xué)反應(yīng)發(fā)生。（二）吸收系數(shù)和桑德?tīng)栰`敏度吸收系數(shù)朗白—比爾定律A=Kbc中的系數(shù)K因濃度c所取的單位不同，有兩種表示方式。吸收系數(shù)a：物質(zhì)的組成和分子量不知時(shí)采用。當(dāng)b為cm，吸光物質(zhì)C為g·L-1時(shí)，K用a表示，單位為L(zhǎng)·g-1·cm-1，此時(shí)A=Kbc=abc摩爾吸收系數(shù)k（讀卡帕）

當(dāng)b為cm，吸光物質(zhì)C為mol·L-1時(shí)，K用k表示，單位為L(zhǎng)·mol-1·cm-1，此時(shí)A=Kbc=kbc

摩爾吸光系數(shù)的物理意義:當(dāng)吸光物質(zhì)的濃度為1mol·L-1時(shí)，b為1cm時(shí)，吸光物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)光的吸光度值。由于濃度單位為mol·L-1故其應(yīng)用更廣泛。摩爾吸光系數(shù)k值一般通過(guò)實(shí)驗(yàn)由k=A/bc求得。摩爾吸光系數(shù)的大小取決于入射光的波長(zhǎng)，波長(zhǎng)不同，k亦不同。在這些不同的k之中,lmax下的kmax是一個(gè)重要的特征參數(shù)，它反應(yīng)了該吸光物質(zhì)吸光能力可能達(dá)到的最高度，所以k常用來(lái)衡量光度法靈敏度的高低，kmax越大，靈敏度越高。一般認(rèn)為kmax>104L·mol-1·cm-1

的方法是較靈敏的。桑德?tīng)枺⊿andell）靈敏度S定義：當(dāng)光度儀器的檢測(cè)極限為A=0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢出的吸光物質(zhì)的最低質(zhì)量，單位為g·cm-2。由于此時(shí)儀器的信號(hào)檢測(cè)能力已經(jīng)確定，則S僅與物質(zhì)的吸光能力有關(guān)，即僅與k有關(guān)：A=0.001=kbc，bc=0.001/kb的單位為cm，C的單位為mol·L-1，即mol/103cm3，故bC的單位為mol/103cm2，若再乘以吸光物質(zhì)的摩爾質(zhì)量M（g/mol），則為103cm2截面積光程中所含物質(zhì)的質(zhì)量（g），所以單位截面積光程中所含物質(zhì)的質(zhì)量（mg）為：所以，k越大，S越小，即該方法的靈敏度越高。對(duì)于比較靈敏的顯色反應(yīng)，S一般在0.01～0.001mg·cm-2之間。有極少數(shù)顯色反應(yīng)的k值達(dá)到了106數(shù)量級(jí)。（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即校準(zhǔn)曲線，又稱工作曲線。是以吸光度A為縱軸，濃度C為橫軸繪制的一條曲線。首先在一定條件下配制一系列具有不同濃度吸光物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱為標(biāo)準(zhǔn)系列，然后測(cè)得它們相應(yīng)的吸光度值，作A～C曲線，為工作曲線或標(biāo)準(zhǔn)曲線。在遵循朗白—比爾定律的濃度范圍內(nèi)應(yīng)為一條直線。同時(shí)可知直線的斜率就等于kb，又因?yàn)閎是定值，故可以求出k值，這樣求得的k值是通過(guò)測(cè)定多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液而得到的平均值，所以更可靠。A～C標(biāo)準(zhǔn)曲線及其偏離（A=

kbc）二、引起偏離朗白—比爾定律的因素(一)物理因素非單色光引起的偏離入射光不純。單色光實(shí)際是有一定的波長(zhǎng)范圍的平行光，假設(shè)入射光是由1和2組成，其強(qiáng)度分別為I01和I02，透射光強(qiáng)度分別為It1和It2，摩爾吸光系數(shù)為k1，k2,當(dāng)通過(guò)的吸光物質(zhì)的濃度為C，液層厚度為b時(shí)。It1It2I01I0212對(duì)于1：A1=lg(I01/It1)=k1bC，故：It1=I01·10-k1bC對(duì)于2：A2=lg(I02/It2)=k2bC，故：It2=I02·10-k2bC由于：

I0=I01＋I(xiàn)02，It=It1＋I(xiàn)t2；所以：A總=lg[(I01+I02)/(It1+It2)]=lg[(I01+I02)/(I01×10-k1bC+I02×10-k2bC)]若

k1=k2=k，則A總=kbC，服從朗白—比爾定律。即1≈2，則k1≈k2，可近似認(rèn)為入射光為單色光。若1≠2，則k1≠k2，A，C間不成正比。1，2間相差越大，偏離越嚴(yán)重。解決方法：采用性能較好的單色器，以獲得波長(zhǎng)范圍窄的入射光。非平行入射光引起的偏離（正偏離）非平行光不能保證入射光垂直入射，將導(dǎo)致光束平均光程b′大于吸收池厚度b，實(shí)際測(cè)得的吸光度值將大于理論值。介質(zhì)不均勻引起的偏離（正偏離）朗白—比爾定律要求測(cè)量溶液是均勻非散射的，若溶液不均勻會(huì)有部分光因散射而損失，使測(cè)量的吸光度偏高，產(chǎn)生正偏離。(二)化學(xué)因素溶液濃度過(guò)高引起的偏離溶液濃度過(guò)高會(huì)使吸光物質(zhì)分子間距離縮短，相互作用加強(qiáng)，導(dǎo)致在高濃度范圍內(nèi)的k不恒定，A與C的線性關(guān)系被破壞。因此，朗白—比爾定律只適合于稀溶液?；瘜W(xué)反應(yīng)引起的偏離由于吸光物質(zhì)的離解，締合，新化合物生成或互變異構(gòu)等影響，使測(cè)量濃度C與A不再成線性關(guān)系?！?.3吸光光度法的儀器目視比色——光電比色計(jì)——分光光度計(jì)采用了性能更好的單色器和檢測(cè)器，使靈敏度和準(zhǔn)確度大為提高。一、分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)提供單色光光源采用6～12V的低壓鎢絲燈做光源，復(fù)合波長(zhǎng)約在（360）400～2500nm之間，在UV區(qū)用氫燈或氘燈做光源，波長(zhǎng)在185～375之間，配以穩(wěn)壓電源。單色器（分光系統(tǒng)）濾色片(20～50nm)：顏色與被測(cè)液互為補(bǔ)色。玻璃棱鏡(360～3600nm)：可見(jiàn)分光光度計(jì)。石英棱鏡(200～4000nm)：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。光柵：衍射和干涉原理分光，波長(zhǎng)范圍寬，分辨率高，單色光純度高。吸收池（比色皿）厚度(光程):0.5，1，2，3，5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿——可見(jiàn)光區(qū)石英比色皿——可見(jiàn)、紫外光區(qū)檢測(cè)系統(tǒng)硒光電池：300～800nm(500～600nm時(shí)最靈敏)；連續(xù)照射后易疲勞，使靈敏度降低。光電管和光電倍增管：紅敏（陰極面為銀和氧化銫）625～1000nm；藍(lán)敏光電管（陰極面為銻銫）160～700nm.廣泛應(yīng)用。二極管陣列檢測(cè)器：高檔檢測(cè)器。信號(hào)顯示系統(tǒng)作用是檢測(cè)光電流大小，并以一定的方式顯示或記錄下來(lái)。過(guò)去是指針式讀數(shù)，現(xiàn)在是數(shù)顯。二、吸光度的測(cè)量步驟調(diào)節(jié)檢測(cè)器零點(diǎn)：T=0（或A=∞）用空白或試劑空白（參比溶液）調(diào)節(jié)T=100%或A=0，工作零點(diǎn)。待測(cè)組分吸光度測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)（工作）曲線（定量）。內(nèi)插法從工作曲線上求得待測(cè)組分含量。三、分光光度計(jì)類型根據(jù)波長(zhǎng)范圍分為:VIS，VIS—UV，IR（FIR）分光光度計(jì)。根據(jù)儀器結(jié)構(gòu)：?jiǎn)喂馐?，雙光束，雙波長(zhǎng)三種類型。書(shū)中p287有詳細(xì)介紹?？梢?jiàn)光光度分析首先是使被測(cè)組分變成有色溶液，然后進(jìn)行吸光度測(cè)量。所以分析條件包括顯色和測(cè)量?jī)刹糠?。一、顯色反應(yīng)及其條件選擇(一)顯色反應(yīng)和顯色劑顯色反應(yīng)大多數(shù)顯色反應(yīng)是利用配位反應(yīng)顯色（包括無(wú)機(jī)顯色和有機(jī)顯色），少量是利用氧化還原反應(yīng)（如MnO4-）。§9.4光度法分析條件的選擇顯色反應(yīng)要求：選擇性要好。最好只與一種被測(cè)物發(fā)生顯色反應(yīng)。靈敏度要高，即k值大（>104

）。有色化合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，化學(xué)組成恒定。對(duì)比度要大。反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(l>60nm)。顯色反應(yīng)條件易于控制。顯色劑無(wú)機(jī)顯色劑：過(guò)氧化氫，硫氰酸銨，鉬酸銨，碘化鉀，氨水。有色化合物穩(wěn)定性差，選擇性和靈敏度都不高，應(yīng)用較少。有機(jī)顯色劑：

與金屬離子形成穩(wěn)定的有色螯合物，選擇性和靈敏度都很高，是光度分析應(yīng)用最廣泛的顯色劑。(二