腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法

1第四章腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法2˙惡性腫瘤——常見(jiàn)病、多發(fā)病

˙全世界每年700萬(wàn)死亡；占?xì)W美死亡第二位

˙我國(guó)城市居民第一位，農(nóng)村第三位

˙惡性腫瘤人類健康重要——?dú)⑹诌M(jìn)展較大,疑難問(wèn)題很多。腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤研究方法具有重要意義。34腫瘤動(dòng)物模型可分為三類：自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型移植性腫瘤動(dòng)物模型5第一節(jié)

自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型(animalmodelofspontaneoustumors)概念:未經(jīng)人為處理；自然發(fā)生?

自發(fā)性乳腺癌模型?

自發(fā)性白血病模型6

一、自發(fā)性乳腺癌模型

生長(zhǎng)在體表,易早期發(fā)現(xiàn),罕有自發(fā)消退,因而能準(zhǔn)確觀察其大小與生長(zhǎng)速度,便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。7

現(xiàn)介紹三種自發(fā)性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠：繁殖用雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為

85%~100%。

A系小鼠：

經(jīng)產(chǎn)雌鼠乳腺腫瘤發(fā)生率為30%~80%。

CBA小鼠：雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為60%~65%。

8

在乳腺左右兩側(cè)及乳頭部均可發(fā)生腫瘤。每只小鼠常見(jiàn)1個(gè)以上腫瘤。選擇腫瘤數(shù)目和大小相近的動(dòng)物,配對(duì)分組,給予受試藥,觀察受試藥對(duì)腫瘤發(fā)展的影響。

給藥方案和給藥途徑可根據(jù)受試藥物的特點(diǎn)確定。因自發(fā)性乳腺癌發(fā)展較緩慢，故采用間歇給藥或小劑量連續(xù)給藥較為合適。

9[結(jié)果判定]

給藥后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄發(fā)生時(shí)間和位置。

腫瘤結(jié)節(jié)長(zhǎng)到一定程度,每周用腳規(guī)測(cè)量皮下腫瘤2次。測(cè)定腫塊的最大徑(a)和最小徑(b)。

腫瘤體積(cm3)=ab2/210

將腫瘤體積變化對(duì)時(shí)間作出生長(zhǎng)曲線,可由曲線的斜率變化判斷藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,尤其應(yīng)觀察腫瘤能否完全消退。11[注意事項(xiàng)]1.在同一品系內(nèi),發(fā)病率比較穩(wěn)定,而不同品系間差別甚大。2.動(dòng)物乳腺癌發(fā)生與遺傳基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有關(guān)。

3.飼料的變更有明顯影響,要用固定全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料。4.配對(duì)分組。12二、AKR白血病模型

AKR小鼠為白血病高發(fā)品系，淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病率雄性76%~90%，雌性為68%~90%。[操作步驟]實(shí)驗(yàn)用6~12月齡AKR小鼠,此時(shí)鼠的脾和淋巴結(jié)腫大,血象異常。

經(jīng)血液檢查確診為白血病后的次日,配對(duì)分組并開(kāi)始給予受試藥,觀察結(jié)果。

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觀察指標(biāo)：末梢血象,白細(xì)胞數(shù),淋巴結(jié)和脾大小,動(dòng)物生存時(shí)間。有效者生存期比對(duì)照組延長(zhǎng),并根據(jù)血象評(píng)價(jià)藥物的誘導(dǎo)緩解和維持緩解作用。

各鼠白血病的病程不一,自發(fā)瘤確診后,實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)配對(duì)分組。

[結(jié)果判定][注意事項(xiàng)]14[自發(fā)性腫瘤的總體評(píng)價(jià)]

動(dòng)物自發(fā)性腫瘤的病因往往是由動(dòng)物的遺傳特性決定的,與人癌的病因有較大距離。

各動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)速度差異較大,很難在限定時(shí)間內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)均勻的荷瘤動(dòng)物(tumor-bearinganimals)

因此，自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型很少在抗腫瘤藥物的常規(guī)篩選中廣泛應(yīng)用。15第二節(jié)

誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型(animalmodelsofinducedtumor)概念:在實(shí)驗(yàn)條件下;

使用致癌物(carcinogens);誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生腫瘤16

[基本原理]

利用外源性致癌物引起細(xì)胞遺傳特性改變，從而出現(xiàn)異常生長(zhǎng)和高增殖活性細(xì)胞,形成腫瘤。

外源性致癌物主要有化學(xué)性、物理性(如放射性物質(zhì))及生物性(如誘發(fā)動(dòng)物腫瘤的病毒),其中以化學(xué)性致癌物最為常用。17一、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型的基本方法

實(shí)驗(yàn)時(shí),必需注意選擇合適的致癌方法、動(dòng)物種系、致癌物及其溶劑、給予劑量、途徑以及觀察時(shí)間等。致癌物的劑量應(yīng)能保證動(dòng)物的存活率較高、誘發(fā)期較短和誘發(fā)腫瘤頻率較高。18常用的致癌物給予方法和途徑1.涂抹法:

涂抹在背部及耳部皮膚,主要用于誘發(fā)皮膚腫瘤。2.經(jīng)口給藥法：通過(guò)飲水、飼料或灌喂動(dòng)物。常用于食道癌、胃癌及大腸癌等。3.注射法：致癌物制成溶液,經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈或體腔等途徑注入體內(nèi),本法較常用。19常用的致癌物給予方法和途徑4.氣管注入法：常用于誘發(fā)肺癌。5.穿線法：將致癌物置于無(wú)菌試管內(nèi),加熱使之液化,吸附于預(yù)制的線結(jié)上,再將此線結(jié)穿入靶組織而誘發(fā)腫瘤。6.埋藏法：包埋于皮下或其他組織內(nèi)。20二、誘發(fā)性腫瘤模型的動(dòng)物和致癌物動(dòng)物：大鼠，小鼠，犬等致癌物：多環(huán)碳?xì)漕悂喯醢奉惻嫉慄S曲霉毒素（飼料中含0.001~0.015ppm黃曲霉毒素B1,喂養(yǎng)6個(gè)月,誘發(fā)大鼠肝癌）。

ppm=partspermillion2122[誘發(fā)性腫瘤模型的總體評(píng)價(jià)]

約80%人癌是由環(huán)境因素引起的,誘發(fā)性腫瘤的病因與人癌的情況近似,且均經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)演變過(guò)程而成瘤。動(dòng)物誘發(fā)性腫瘤是比較類似于人類腫瘤的動(dòng)物模型。

然而,人癌的發(fā)生原因十分復(fù)雜,往往并非由已知的動(dòng)物致癌物所引起。另外,動(dòng)物誘發(fā)性腫瘤的組織病理類型、發(fā)生發(fā)展過(guò)程也不一定與人癌完全一致。

23

本模型的最大困難是誘癌時(shí)間長(zhǎng)、成癌率常達(dá)不到100%,而且動(dòng)物之間腫瘤發(fā)生時(shí)間、發(fā)展速度的個(gè)體差異很大,難以將未治療的動(dòng)物作為治療動(dòng)物的對(duì)照。24第三節(jié)移植性腫瘤動(dòng)物模型(Animalmodeloftransplantingtumors)25

移植性腫瘤動(dòng)物模型是指將動(dòng)物或人體腫瘤移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成的腫瘤。

該實(shí)驗(yàn)法是抗腫瘤藥物篩選最常用的體內(nèi)方法，具有重要作用。目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是首先經(jīng)該實(shí)驗(yàn)法而被發(fā)現(xiàn)的。26

一般給予試驗(yàn)藥7~10d,在第8~11d可解剖動(dòng)物獲得結(jié)果。通過(guò)一些指標(biāo)的觀察,可以判斷試驗(yàn)藥是否有具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。這是任何體外試驗(yàn)所不能替代的,其結(jié)果可為抗癌藥物療效提供重要依據(jù)。27

它比前述的自發(fā)性和誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤更易實(shí)施。

現(xiàn)有移植性腫瘤接種成功率可達(dá)100%,可在同一時(shí)間內(nèi)獲得大量(數(shù)十至百余只動(dòng)物)、生長(zhǎng)相當(dāng)均勻的腫瘤。28

移植性腫瘤常用的動(dòng)物為小鼠、大鼠和地鼠。研究藥物的抗腫瘤作用可選擇三種或三種以上小鼠、大鼠的移植性腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療；抗腫瘤藥物篩選時(shí)，每批動(dòng)物的來(lái)源應(yīng)一致；一、動(dòng)物的選擇29

根據(jù)瘤株的特點(diǎn)選用近交系、遠(yuǎn)交系或F1動(dòng)物；雌雄性動(dòng)物均可應(yīng)用(乳腺癌等必須用雌性動(dòng)物)。

▲每批實(shí)驗(yàn)只用同一性別動(dòng)物。

▲小鼠體重18~22g，大鼠體重50~70g

▲每組至少10只動(dòng)物，裸鼠可用5~10只。30二、腫瘤細(xì)胞的選擇

復(fù)制移植性腫瘤模型需要使用腫瘤細(xì)胞株(瘤株，tumorstrain)或細(xì)胞系(cellline)。

細(xì)胞株(cellstrain)是指通過(guò)選擇法或克隆法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群。31

瘤株的組織學(xué)類型和生長(zhǎng)特征趨于穩(wěn)定，并能在同系、同種或異種動(dòng)物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。

生長(zhǎng)特征，包括接種成活率、生長(zhǎng)速度、自動(dòng)消退率、宿主壽命與宿主反應(yīng)等。

細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。

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目前，動(dòng)物移植性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤（包括實(shí)體瘤、腹水瘤和白血?。┘s500種，還有大量人的瘤株或細(xì)胞系。常用的動(dòng)物移植性腫瘤瘤株或細(xì)胞系有：

33肉瘤S180腹水型或?qū)嶓w型

艾氏腹水癌或?qū)嶓w型

肝癌腹水型（HepA）或?qū)嶓w型（H22）

小鼠白血病L1210、P388及L615小鼠黑色素瘤（B16）

小鼠Lewis肺癌

肉瘤S37結(jié)腸癌C38、結(jié)腸癌C26

子宮頸癌（U14）大鼠Walker癌肉瘤256（W256）34

篩選抗癌藥物時(shí)，最好選用3類瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，目前最受重視和應(yīng)用最廣的是：小鼠Lewis肺癌小鼠黑色素瘤B16小鼠白血病P388

瘤株或細(xì)胞系的選擇應(yīng)盡量考慮與臨床擬研究腫瘤的性質(zhì)、部位等相近，如擬研究肝癌的治療，可首選肝癌瘤株。

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一種藥物不一定對(duì)各種類型移植性腫瘤都有效，如果僅選一種瘤株進(jìn)行藥物篩選就可能出現(xiàn)漏篩。還必須指出，動(dòng)物腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)與人類腫瘤有較大差別，對(duì)動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用的藥物對(duì)人類腫瘤未必有效。36三、接種方法

(一)一般要求整個(gè)操作應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，可在無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)內(nèi)操作。動(dòng)物處死后消毒皮膚，對(duì)每個(gè)實(shí)體瘤應(yīng)分別使用滅菌的外科器械切取，對(duì)腹水瘤則應(yīng)分別用滅菌的注射器抽吸。

37接種方法

瘤塊污染常是接種失敗的主要原因，應(yīng)特別注意!!在高溫季節(jié)操作時(shí)，可在盛有瘤源的器皿周圍放置冰塊直接降溫。

常用接種部位：實(shí)體瘤_____腋窩皮下肌肉接種___大腿肌肉腹水型腫瘤__腹腔

38(二)接種操作1.實(shí)體瘤

(1)基本過(guò)程（以實(shí)體瘤為例）凍存的瘤株--->移入宿主體內(nèi)（瘤源動(dòng)物）------->7-10d(增殖)獲得瘤塊--->制備瘤塊--->給動(dòng)物接種(受體動(dòng)物)39

(2)瘤塊接種法：選取接種后7~10d生長(zhǎng)狀態(tài)良好的瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。切開(kāi)皮膚，剝離出瘤塊，置于平皿上,平皿應(yīng)放置在冰塊上,內(nèi)置少許滅菌的PBS或其他營(yíng)養(yǎng)液,剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長(zhǎng)良好而無(wú)變性壞死、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，在無(wú)菌平皿內(nèi)剪成2mm3的小塊。

黑色素瘤則呈黑色或黑紫色

注意不用瘤中央的壞死部分40瘤源動(dòng)物--->頸椎脫臼處死--->--->消毒切開(kāi)皮膚--->取瘤剪成2mm3

小塊--->用套管針抽吸瘤塊接種于受體動(dòng)物右前肢腋窩皮下縮短接種操作時(shí)間,從瘤塊取材到接種完畢一般應(yīng)在30min內(nèi)；平皿內(nèi)放置少許滅菌PBS或其他營(yíng)養(yǎng)液；接種部位皮膚應(yīng)先消毒。流程圖：41

(3)瘤細(xì)胞懸液接種法

如每次需要接種的動(dòng)物數(shù)量較多時(shí)，可用瘤細(xì)胞懸液接種:取幾個(gè)瘤塊--->除去壞死部分--->混合瘤塊--->剪成小塊--->勻漿器單向研勻--->放入無(wú)菌容器--->生理鹽水稀釋成1:3~1:4懸液

每只動(dòng)物接種0.2ml；整個(gè)操作應(yīng)在30min內(nèi)完成；每次抽吸前應(yīng)將細(xì)胞混勻。42

(4)培養(yǎng)細(xì)胞接種法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞→胰酶消化→PBS洗滌2次→計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)→用生理鹽水稀釋成細(xì)胞懸液→細(xì)胞懸液置于冰上→注射到接種部位(0.2ml,含1×106~1×107個(gè)細(xì)胞)。

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2.腹水型腫瘤

(1)抽取腹水：選擇接種后7~10d的健康動(dòng)物頸椎脫臼處死--->腹部皮膚消毒--->剪開(kāi)剝?nèi)ジ共科つw--->抽吸腹水--->放入無(wú)菌容器內(nèi)--->若用幾只動(dòng)物作為瘤源動(dòng)物時(shí),應(yīng)將腹水混合.4445

另取小量腹水,置于加有肝素的干試管內(nèi),作為觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞計(jì)數(shù)用。

將空針中剩余的腹水制備推片,瑞氏染色,鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù),其中瘤細(xì)胞數(shù)應(yīng)≥95%。

抽出的腹水應(yīng)為乳白色濃稠液體,若為黃色或含有大量紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)棄去。46

(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)：

取肝素管內(nèi)的瘤細(xì)胞,用生理鹽水稀釋10倍;取稀釋液0.9ml,加0.2%臺(tái)盼藍(lán)生理鹽水溶液0.1ml混勻。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)瘤細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。

瘤細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色,而活細(xì)胞不著色。4748

計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù),計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)壓邊線的細(xì)胞,計(jì)左不計(jì)右,計(jì)上不計(jì)下。計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù),然后按下列公式計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞總數(shù)。

四大方格細(xì)胞總數(shù)－死細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)/ml懸液＝×稀釋倍數(shù)×100004

49

(3)接種：

腹水用含葡萄糖的無(wú)菌Hanks液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?每只鼠腹腔注入0.1~0.2ml。整個(gè)操作應(yīng)在60min內(nèi)完成。50

3.白血病株的接種

腹水型白血病如L1210及P388的接種方法同腹水型腫瘤接種法。51

四、腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了使腫瘤細(xì)胞能得以長(zhǎng)期使用，防止退化或變異，保存不同代細(xì)胞的特征，對(duì)腫瘤細(xì)胞或瘤株進(jìn)行冷凍保存是很必要的。一般在液氮中凍存1~2年，細(xì)胞存活率可達(dá)80%~90%。

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1.凍存方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖細(xì)胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。經(jīng)胰蛋白酶消化、離心、洗滌，用含7份培養(yǎng)液、2份小牛血清、1份DMSO配成(1~5)×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管，貼上標(biāo)簽，注明細(xì)胞來(lái)源、名稱及凍存日期。

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一般將凍存管:

①4℃--30min；－20℃--4h；－70℃--過(guò)夜--然后入液氮。

②可將凍存管懸掛液氮罐口處過(guò)夜，之后浸入液氮中。

③可用2cm厚脫脂棉將凍存管嚴(yán)密包裹,－20℃~－30℃過(guò)夜，然后除去脫脂棉直接放入液氮中。

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2.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法

從液氮罐中取出凍存管，迅速放入38℃~40℃水浴中，并不停搖動(dòng)使其在1min內(nèi)全部融化，500~800r/min離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)。

55

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”，標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度是每分鐘－1℃~－2℃，到－70℃以下時(shí)可迅速放入液氮中。所凍存的細(xì)胞必須是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞密度應(yīng)在106個(gè)/ml以上。56第四節(jié)人體腫瘤異種移植性腫瘤模型

57

異種移植性腫瘤是移植性腫瘤的一種，近年很重視人體腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)移植模型。因?yàn)檫@種模型使用人的腫瘤細(xì)胞，在組織形態(tài)和遺傳特征等方面，均與人類腫瘤相同，故用這種模型可以比較直接研究人類腫瘤的生物學(xué)特性及抗腫瘤藥物。58

由于異種移植的移植排斥反應(yīng)?？蓪?dǎo)致移植失敗，故選擇適合的受體動(dòng)物是移植成功的關(guān)鍵。常用的宿主動(dòng)物主要有裸小鼠和C57BL/6小鼠，也可用免疫抑制劑或放射線等降低動(dòng)物的免疫功能后，再進(jìn)行移植。59

一、裸小鼠作為移植宿主

裸小鼠是在SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長(zhǎng)的BALB/c裸小鼠，6~8周齡，體重21~22g。

[瘤源]人體腫瘤細(xì)胞的來(lái)源大致可分為兩類，一類是人的腫瘤細(xì)胞株(系)；另一類是源于人體腫瘤組織塊的癌細(xì)胞。

常用人癌裸鼠移植的細(xì)胞株(系)、接種方式和最佳生長(zhǎng)期見(jiàn)教材。

60

二、免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主

由于裸鼠嬌弱，飼養(yǎng)條件要求高，費(fèi)用昂貴，故用裸鼠復(fù)制人體腫瘤異種移植腫瘤模型較難普遍應(yīng)用。使用免疫功能受抑制的大鼠接種人癌細(xì)胞，可獲得人癌動(dòng)物模型。先皮下注射阿糖胞苷，2d后用10Gy60Co全身照射。

61第五節(jié)抗腫瘤藥物體內(nèi)研究方法62

基本步驟是:低溫保存瘤細(xì)胞—速融—加冷培養(yǎng)液洗除凍存液—用培養(yǎng)液將腫瘤細(xì)胞調(diào)至一定濃度—給特定動(dòng)物(宿主)注射(ip或sc)。

腫瘤細(xì)胞在宿主動(dòng)物體內(nèi)增殖后—取出—給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(受體動(dòng)物)進(jìn)行接種(荷瘤動(dòng)物)。不同腫瘤的宿主動(dòng)物、取用腫瘤的時(shí)間及接種方法見(jiàn)表4-1。63一、實(shí)體瘤(√)

[分組給藥]

接種次日將動(dòng)物隨機(jī)分組：☉實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(C)：接種腫瘤細(xì)胞不給受試藥，只給受試藥相應(yīng)的溶劑☉受試藥組(T)：設(shè)高、中、低3個(gè)劑量（給藥1次或數(shù)次，給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同，靜脈給藥者可用腹腔注射代替）。

☉陽(yáng)性對(duì)照藥：對(duì)瘤株活性高的已知抗腫瘤藥

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＊對(duì)S180,艾氏腹水癌實(shí)體型

可用環(huán)磷酰胺20~30mg/(kg.d)

＊對(duì)L615

可用5-氟尿嘧啶25mg/(kg.d)

＊對(duì)其他腹水型腫瘤一般用絲裂霉素2mg/(kg.d)

＊對(duì)W256

可用絲裂霉素4mg/(kg.d)+環(huán)磷酰胺20~30mg/(kg.d)65

[療效評(píng)價(jià)]

停藥24h后處死動(dòng)物,稱體重,剝離瘤塊,稱瘤重。受試藥物對(duì)實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制率表示：

C－T

瘤重抑制率

(%)=×100%

C

式中T:受試藥物組平均瘤重;C:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(模型組,荷瘤未用藥動(dòng)物)平均瘤重。(瘤重抑制率%=[(1－T/C)]×100%計(jì)算）66

觀察瘤重抑制率時(shí)，要求實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠瘤重均值不得低于1g（大鼠瘤重均值不得低于2g），否則表示腫瘤生長(zhǎng)不良，實(shí)驗(yàn)作廢。

給藥組動(dòng)物平均體重下降（給藥前后自身比較）不得超過(guò)15%，動(dòng)物死亡數(shù)不得超過(guò)20%，否則表示受試藥有毒性反應(yīng)，應(yīng)減少劑量重新實(shí)驗(yàn)。67

若中草藥瘤重抑制率大于30%，合成藥大于40%，且與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重復(fù)3次，療效均穩(wěn)定，則評(píng)定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。68

[注意事項(xiàng)]實(shí)驗(yàn)中如果幾個(gè)藥給藥組共用一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組時(shí)，后者的動(dòng)物數(shù)應(yīng)適當(dāng)增加,公式為:C＝G×M。式中C=實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物數(shù)；G=同時(shí)試驗(yàn)的化合物數(shù)或同時(shí)試驗(yàn)的藥物數(shù)；M=給藥組的動(dòng)物數(shù)。如試驗(yàn)的藥物數(shù)G為2，各給藥組M均為10，故C＝2×10，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的動(dòng)物數(shù)為20。69二、腹水型腫瘤(√)

[分組給藥]于接種后次日將動(dòng)物隨機(jī)分組并開(kāi)始給藥，受試藥設(shè)高、中、低3個(gè)劑量組，口服或腹腔注射給藥，連續(xù)給藥5~10次。70

[療效評(píng)價(jià)]接種后觀察和記錄動(dòng)物死亡時(shí)間和生存天數(shù)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物通常在2~3周內(nèi)全部死亡。如實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中≥20%動(dòng)物存活超過(guò)4周，表明腫瘤生長(zhǎng)不良，實(shí)驗(yàn)作廢。如給藥治療期間實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物于7d內(nèi)死亡率≥20%，表示腫瘤生長(zhǎng)過(guò)快，實(shí)驗(yàn)失敗。

71

腹水瘤以荷瘤動(dòng)物的生命延長(zhǎng)時(shí)間作為療效指標(biāo)，計(jì)算每組動(dòng)物的平均存活時(shí)間，給藥組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的平均生存天數(shù)之比[(T/C)%]大于125%為有效。

在接種后60d分別記錄給藥組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物的平均生存時(shí)間(如果生存超過(guò)60d，按60d計(jì)算)，按下列公式計(jì)算生命延長(zhǎng)率：

72

式中:T為受試藥物組平均生存天數(shù)；

C為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均生存天數(shù)。

T－C生命延長(zhǎng)率(%)＝×100%

C73

若腹腔注射給藥時(shí)生命延長(zhǎng)率＞75%，非腹腔注射給藥生命延長(zhǎng)率＞50%，且與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重復(fù)3次，療效穩(wěn)定，則評(píng)定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。74

[注意事項(xiàng)]1.關(guān)于幾個(gè)給藥組共用一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組時(shí),實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的動(dòng)物數(shù)，同實(shí)體瘤。2.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及結(jié)束時(shí)應(yīng)分別稱動(dòng)物體重，若給藥組動(dòng)物體重明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組時(shí)(如超過(guò)15%)，判定療效時(shí)應(yīng)注意體重降低對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，排除非特異的毒性作用。3.腹水型腫瘤的研究方法,也適用于腹水型白血病，如L1210及P388。

75三、移植性腫瘤研究方法的應(yīng)用

(一)肉瘤S180模型（實(shí)體瘤）(√)小鼠肉瘤S180(sarcoma180)是經(jīng)典的動(dòng)物腫瘤模型之一，在抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選中被廣泛應(yīng)用。S180有實(shí)體型和腹水型兩種生長(zhǎng)形式，可以以一種形式傳代，實(shí)體型與腹水型可互轉(zhuǎn)。

76

[操作步驟]

1.

取接種在昆明小鼠約7~10d的S180腫瘤→剔除腫瘤包膜和壞死部分→置于玻璃勻漿器內(nèi)→加入生理鹽水配制成含瘤細(xì)胞為(1~2)×107/ml單細(xì)胞懸液→接種于同種異體小鼠腋窩皮下,每只小鼠注射0.2ml(含瘤細(xì)胞2×106~4×106個(gè))。77

2.接種后第1d稱體重、隨機(jī)分組并開(kāi)始給藥,包括:

▲實(shí)驗(yàn)對(duì)照組

▲陽(yáng)性對(duì)照藥組（環(huán)磷酰胺,接種次日1次性ip,100mg/kg）

▲受試藥高劑量組

▲受試藥中劑量組

▲受試藥低劑量組78

腹腔注射或灌胃給藥.給藥方案有多種。至接種后第11~14d,稱量動(dòng)物體重,解剖腫瘤并稱重。79

[結(jié)果計(jì)算]

S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)速度與接種量成正比，一般重2.5g的腫瘤需生長(zhǎng)8~11d。根據(jù)各組動(dòng)物瘤重按前述公式計(jì)算瘤重抑制率，并進(jìn)行藥物療效評(píng)定。80

[注意事項(xiàng)]

1.本方法也適用于B16、Hep、W256和C26等實(shí)體型移植性腫瘤模型。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤基本不長(zhǎng)或長(zhǎng)得很小,即陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率應(yīng)大于80%以上,而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物在此期間瘤重應(yīng)在2g左右。

81

3.受試藥組動(dòng)物體重不低于原始體重的20%,否則表示受試藥劑量過(guò)高,需降低劑量重試。4.腋窩部皮膚松弛，皮下接種后能允許腫瘤生長(zhǎng)得較大，也可接種于腹股溝部皮下。82黑色素瘤8384模型組陽(yáng)性藥組給藥組85(二)大鼠W256癌肉瘤模型(×)瓦克癌肉瘤256（Walker256，簡(jiǎn)稱W256）的生長(zhǎng)有實(shí)體型和腹水型兩種形式，并可互轉(zhuǎn)。接種在皮下或肌肉內(nèi)成為實(shí)體瘤,接種在腹腔則成為腹水瘤。在接種后開(kāi)始給藥治療,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較對(duì)照組與試驗(yàn)組的瘤重或大鼠平均存活時(shí)間,可判斷受試藥物的療效。86

[操作步驟]

1.取接種于大鼠大腿肌肉或腹腔第7d、接種于皮下11~13d的W256瘤,配制成瘤細(xì)胞懸液(約2×106~4×106個(gè)瘤細(xì)胞)。取體重55~65gWistar大鼠,雌雄不限,每次實(shí)驗(yàn)均用同一性別。每鼠大腿肌內(nèi)接種瘤細(xì)胞懸液0.2ml,每組用6~10只動(dòng)物。87

2.接種后第1d稱動(dòng)物體重,隨機(jī)分組并開(kāi)始給藥,均用腹腔注射,每天1次,連續(xù)7~10d,至第8~11d處死動(dòng)物,將雙側(cè)后肢從髖關(guān)節(jié)外剪下,分別稱重,荷瘤肢體重減去對(duì)側(cè)正常肢體重即為瘤重。88

[結(jié)果計(jì)算]按前述公式計(jì)算瘤重抑制率。[注意事項(xiàng)]

1.本方法也適用于S180及艾氏腹水瘤等腫瘤。

2.接種的瘤源有兩種；用腹水型瘤源,傳代6~8d的瘤源(抽出的腹水為血性);用皮下接種的瘤,用勻漿法制成瘤細(xì)胞懸液。

89

3.對(duì)照組肌肉型平均瘤重在3~5g;皮下腫瘤平均瘤重為3~12g;腹水型動(dòng)物平均生存10~14d。4.第7d給藥組動(dòng)物存活率應(yīng)大于65%,否則表明所試藥物劑量過(guò)大。90

(三)Lewis肺癌模型(√)

1951年Lewis在未經(jīng)過(guò)處理的C57BL小鼠肺發(fā)現(xiàn)了未分化上皮樣腫瘤，此后建立了實(shí)體型移植性腫瘤模型。

91

[操作步驟]

1.取C57BL/6小鼠皮下接種8~12d的Lewis肺癌作為瘤源，無(wú)菌條件下剝離瘤組織，用剪刀剪成小塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加無(wú)菌生理鹽水(1:3)研磨成勻漿，過(guò)400目絲網(wǎng)，成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)每毫升勻漿液中的瘤細(xì)胞數(shù)。

2.給每只成年C57BL/6小鼠腋窩皮下接種2×106個(gè)細(xì)胞（0.2ml/只）。

92

3.接種后第1天進(jìn)行動(dòng)物分組并給藥，陽(yáng)性對(duì)照藥用環(huán)磷酰胺50mg/kg體重(0.2ml/10g體重),隔日灌胃給藥，共給3次。給藥組每天灌胃給予受試藥1次，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)10d。

4.末次給藥后24h處死動(dòng)物，稱體重，剝離腋窩下腫瘤并稱重，計(jì)算瘤重生長(zhǎng)抑制率。

93皮下移植Lewis肺癌的C57BL/6小鼠94Lewis肺癌移植瘤95

[模型評(píng)價(jià)]Lewis肺癌惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6小鼠，是目前國(guó)際應(yīng)用較普遍的移植腫瘤模型之一，由于其接種部位的不同，用途比較廣泛。本方法是評(píng)價(jià)藥物體內(nèi)抗腫瘤作用最常用的方法，對(duì)藥物作用的預(yù)測(cè)性很好。

96

[注意事項(xiàng)]1.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)分別稱量動(dòng)物體重，如果給藥組動(dòng)物體重明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（超過(guò)15%），判定藥物療效時(shí)應(yīng)注意體重降低對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，排除非特異的毒性作用。

2.腫瘤接種后2周，單個(gè)鼠瘤重應(yīng)在500mg以上，否則說(shuō)明腫瘤生長(zhǎng)不良，腫瘤接種失敗。

97

3.對(duì)某些效價(jià)較低的藥物，如未純化中草藥有效成分或多糖類的篩選，可將瘤細(xì)胞接種于后肢爪墊皮下，接種細(xì)胞數(shù)為(2~4)×105/0.02ml（細(xì)胞數(shù)僅為常規(guī)皮下接種量的1/3），接種后給藥治療，10d后從踝關(guān)節(jié)處切除帶瘤的足稱重，計(jì)算瘤重抑制率。若切除帶瘤的足后繼續(xù)給藥，還可觀察受試藥對(duì)肺轉(zhuǎn)移的療效。98

(四)L1210白血病小鼠模型(×)L1210白血病最早是用甲基膽蒽在DBA/2小鼠誘發(fā)的，能在DBA/2小鼠及其雜交一代BDF1和CDF1小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)。小鼠白血病L1210為腹水型腫瘤，是最常用的移植性腫瘤模型。

將1×105個(gè)腹水瘤細(xì)胞接種在DBA/2、BDF1或CDF1小鼠腹腔內(nèi)，接種后24h開(kāi)始給藥治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較給藥組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠的平均存活時(shí)間，可判斷藥物的療效。

99

[操作方法]1.取接種于DBA/2小鼠約7d的L1210腹水，用生理鹽水配成瘤細(xì)胞數(shù)為106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于BDF1或CDF1小鼠腹腔內(nèi)，每只小鼠接種0.1ml（含瘤細(xì)胞1×105個(gè)）。100

2.實(shí)驗(yàn)當(dāng)天接種動(dòng)物，將瘤株進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。接種后第1天檢查培養(yǎng)情況，如無(wú)污染，將稱量動(dòng)物體重并隨機(jī)分組后開(kāi)始給藥。接種后第2天再檢查培養(yǎng)情況，如有污染，則實(shí)驗(yàn)報(bào)廢。

動(dòng)物分組包括實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、受試藥組及陽(yáng)性對(duì)照藥，均腹腔注射給藥。給藥方案有多種。第20天如果除陽(yáng)性對(duì)照藥組及受試藥組外再無(wú)其他動(dòng)物存活，則終止實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)結(jié)果。第30天處死全部動(dòng)物，并評(píng)價(jià)受試藥的療效。

101

[結(jié)果]小鼠接種L1210后平均存活8~11d。一般觀察30d，根據(jù)各組動(dòng)物的平均存活天數(shù)，按公式計(jì)算受試藥對(duì)L1210白血病小鼠的生命延長(zhǎng)率（未死亡動(dòng)物按30d計(jì)）。

102

[注意事項(xiàng)]1.本方法也適用于P388、EAC、Hep、W256和S180等腹水型移植性腫瘤模型。2.如瘤株培養(yǎng)證明被污染，需重新接種動(dòng)物。

3.接種后第5天給藥組動(dòng)物存活率應(yīng)大于65%，否則說(shuō)明藥物劑量過(guò)大或藥物有毒性。4.如實(shí)驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物在18d內(nèi)仍未死亡，則認(rèn)為腫瘤生長(zhǎng)不良，接種失敗，應(yīng)分析原因重新實(shí)驗(yàn)。

103

(五)小鼠腎包膜下腫瘤移植模型(×)在裸鼠、BDF1或CDF1小鼠的腎包膜（腎纖維膜）下移植人的瘤細(xì)胞，由于移植的瘤塊僅1mm3，可由腎包膜下豐富的血管供給營(yíng)養(yǎng)和氧，瘤塊能迅速增長(zhǎng)，短期內(nèi)(6~11d)腫瘤生長(zhǎng)較規(guī)則，接種成活率接近100%。104

[操作方法]小鼠腎包膜下異種移植的腫瘤多選用人癌，其來(lái)源于裸鼠皮下接種傳代16~22d的人癌瘤株、人癌培養(yǎng)細(xì)胞株或手術(shù)切除的新鮮癌組織。105

1.在無(wú)菌操作下取小鼠或人體瘤組織，剪去包膜及出血壞死部分，切成約1mm3小塊。選用體重18~22g裸鼠、BDF1或CDF1小鼠，麻醉后手術(shù)區(qū)消毒，打開(kāi)腹腔暴露左腎，將1小塊瘤組織裝入套管針內(nèi)，移植于腎外側(cè)中線處的包膜下。

106

2.在裝有顯微尺的體視顯微鏡下，測(cè)量起始移植塊的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，測(cè)量后關(guān)閉腹部切口。如在腎包膜下注射培養(yǎng)的瘤細(xì)胞株，則注射含1×107個(gè)細(xì)胞的懸液0.02ml，不必測(cè)量移植瘤塊的長(zhǎng)短徑。

107

3.接種次日分組、給藥，每天給藥1次，共5~10d。停藥次日，即BDF1小鼠接種后6d或裸鼠接種后11d，稱量體重，解剖帶瘤腎臟，在體視顯微鏡下測(cè)量瘤塊的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，按ab2/2公式計(jì)算瘤體積(V)。

4.腫瘤體積(V)也可以用下式計(jì)算：V＝(4/3)πabc＝(1/6)πABC，其中π為圓周率，ABC為腫瘤相互垂直的3個(gè)直徑，abc為腫瘤相互垂直的3個(gè)半徑。108109

[結(jié)果計(jì)算]根據(jù)每只鼠的瘤體積計(jì)算給藥組瘤體積的相當(dāng)率，表示受試藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。如給藥治療后瘤體積較原接種瘤體積減小，表示腫瘤消退，受試藥治療有效，以消退率表示：

110

給藥組平均瘤體積相當(dāng)率（%）=×100%

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均瘤體積給藥后平均瘤體積消退率（%）＝

×100%

原接種平均瘤體積111

[注意事項(xiàng)]1.手術(shù)切除的人體腫瘤需冰凍運(yùn)送，從取出腫瘤到接種應(yīng)在4h內(nèi)完成。2.注意無(wú)菌操作，瘤源如有污染，應(yīng)終止實(shí)驗(yàn)。3.瘤塊接種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格使每只鼠瘤塊的長(zhǎng)、短徑控制在0.9~1.2mm。112

4.應(yīng)嚴(yán)格控制飼養(yǎng)條件和環(huán)境，以免影響動(dòng)物體重增長(zhǎng)而產(chǎn)生非特異性抑瘤作用。5.若給藥組動(dòng)物體重下降至原體重的70%、實(shí)驗(yàn)終止時(shí)小鼠死亡率超過(guò)34%，表示受試藥有毒性，應(yīng)降低劑量重做實(shí)驗(yàn)。

113114第六節(jié)抗腫瘤藥物體外研究方法

用體外細(xì)胞作抗癌藥篩選具有用藥量少,周期短,費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。體外篩選結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)的相關(guān)性好,因此,抗癌藥體外篩選已作為常規(guī)的抗癌藥初篩手段。體外研究方法

然而,體外研究方法也有一定局限性，主要是體內(nèi)環(huán)境極為復(fù)雜，與體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境有很大差別，體外篩選的最大缺點(diǎn)是無(wú)法獲得藥物對(duì)組織選擇性方面的資料。此外,有些藥物須在體內(nèi)代謝活化

(如環(huán)磷酰胺)或通過(guò)機(jī)體反應(yīng)(生物調(diào)節(jié)劑)才能對(duì)腫瘤細(xì)胞起作用,因而不能通過(guò)體外篩選尋找。

體外研究方法

目前世界上已建立了很多體外癌細(xì)胞系(株)。藥物篩選應(yīng)選用生長(zhǎng)特性穩(wěn)定,增殖快,對(duì)已知抗癌藥敏感的細(xì)胞系。小鼠與人的細(xì)胞系對(duì)藥物的反應(yīng)大致相同,前者具有在體內(nèi)外均可進(jìn)行試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn),故較常應(yīng)用。體外研究方法

觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用，可選擇10~15種以上腫瘤細(xì)胞系(株)進(jìn)行體外研究，受試藥用5個(gè)或5個(gè)以上不同濃度，觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活、細(xì)胞膜功能、生長(zhǎng)曲線、克隆形成能力等指標(biāo)的影響。每項(xiàng)指標(biāo)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況將幾項(xiàng)指標(biāo)組合起來(lái)應(yīng)用。

體外研究方法

一、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖特性細(xì)胞生長(zhǎng)是指細(xì)胞體積的增大，細(xì)胞增殖是指細(xì)胞數(shù)目的增多。體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖到一定密度時(shí)，則需進(jìn)行傳代(passage)。細(xì)胞每傳一代后，一般要經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和停滯期3個(gè)階段。

體外研究方法*

在指數(shù)生長(zhǎng)期，取細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間作圖，可得一條斜率向上的直線，故也稱此期為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約3~5d

體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞按其生長(zhǎng)方式可分為貼附生長(zhǎng)型和懸浮生長(zhǎng)型兩大類:

貼附生長(zhǎng)型:

細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)能貼附在支持物表面生長(zhǎng)，有時(shí)稱貼壁生長(zhǎng)。體外研究方法

懸浮生長(zhǎng)型:

細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不需要附著于支持物而在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)，如取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞、血白細(xì)胞等。

二、MTT法

[基本原理]

MTT是一種溴化四氮唑,FW:414.3,是能接受氫原子的染料。MTT可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲臢,而死細(xì)胞則無(wú)此功能。甲臢的生成量通常與活細(xì)胞數(shù)成正比,在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A),即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。MTT

[試劑與器材]

1.MTT溶液用生理鹽水或PBS配制成5mg/ml貯存液，在磁力攪拌機(jī)上攪拌30min使之完全溶解。用前通過(guò)0.22μm濾膜除菌和沉淀物，4℃避光保存，兩周內(nèi)有效。呈黃色,無(wú)沉淀。暫時(shí)不用，可凍存。

2.含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，不含酚紅指示劑；0.25%胰酶消化液；DMSO原液（分析純）,作為甲臢的溶解液。MTT

[試劑與器材]3.96孔培養(yǎng)板(用新的）,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，微量移液器，微型振蕩器，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀。

MTT

[操作步驟]

1.選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼附腫瘤細(xì)胞→0.25%胰酶消化→懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)液)→吹打成細(xì)胞懸液。

2.用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè),活細(xì)胞應(yīng)在97%以上。若是懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,可直接用臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。MTT

3.96孔培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞懸液190μl，每孔含5000~40000個(gè)細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞的類型而定)。接種后，37℃、5%CO2預(yù)培養(yǎng)24h。

4.將受試藥物配成終濃度的20倍。受試藥可用DMSO、培養(yǎng)液或生理鹽水溶解?？稍O(shè)5~7個(gè)濃度組。

MTT

5.加藥組每孔加入10μl藥液。因接種的細(xì)胞懸液體積為190μl，又加入了10μl藥液，因此藥液被稀釋了20倍，等于所需要的終濃度。每組設(shè)3~5個(gè)平行孔，最好5個(gè)。

6.細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48h。然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。MTT

7.小心吸棄孔內(nèi)上清液(若為懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，需1000r/min離心5min后再吸棄上清)。每孔加入150μlDMSO，微型振蕩器上振蕩約10min，使甲臢結(jié)晶完全溶解。

MTT96孔板用離心機(jī)8.設(shè)置對(duì)照組

：空白對(duì)照孔(調(diào)零孔)：培養(yǎng)液、MTT和DMSO。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：細(xì)胞、相同濃度溶解藥物的溶劑

+

培養(yǎng)液、MTT和DMSO

加藥組

：細(xì)胞、受試藥物+培養(yǎng)液、MTT和DMSO陽(yáng)性藥對(duì)照組:細(xì)胞、陽(yáng)性藥+培養(yǎng)液、MTT和DMSO

（操作步驟同加藥組）MTT9.用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的A值(參考波長(zhǎng)450nm)。測(cè)定時(shí)以空白對(duì)照孔調(diào)零。應(yīng)盡快完成測(cè)定。MTT[結(jié)果評(píng)定]按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均A值－加藥組平均A值腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)＝×100%

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均A值

MTT

以同一樣品的不同濃度藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線,從中求出該樣品的半數(shù)抑制濃度IC50MTT[評(píng)價(jià)]

本方法已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選、一些生物活性因子的活性檢測(cè)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。該方法的特點(diǎn)是靈敏度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、無(wú)放射性污染，且與其他檢測(cè)細(xì)胞存活的方法（如細(xì)胞計(jì)數(shù)法、克隆形成試驗(yàn)和3H-TdR摻入試驗(yàn)等）有良好相關(guān)性。

MTT

[注意事項(xiàng)]1.MTT被活細(xì)胞中脫氫酶還原所形成的結(jié)晶產(chǎn)物不溶于水，需加入有機(jī)溶劑溶解后才能測(cè)定A值，選擇不同的有機(jī)溶劑或結(jié)晶產(chǎn)物溶解不完全，對(duì)結(jié)果有一定影響。

2.酶標(biāo)儀濾光片的選擇甲臢的吸收峰受一些因素的影響，如溶解甲臢的溶劑、pH等。因此，首先應(yīng)用優(yōu)質(zhì)分光光度計(jì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的最大吸收峰，在此基礎(chǔ)上選擇合適的濾光片。MTT3.細(xì)胞系的選擇及接種的細(xì)胞數(shù)由于實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)計(jì)在活細(xì)胞數(shù)與A值呈線性關(guān)系部分進(jìn)行，故應(yīng)選用在4~7d生長(zhǎng)速度適合作此項(xiàng)分析的細(xì)胞系。選擇適量接種細(xì)胞數(shù)的原則是，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的A值與活細(xì)胞數(shù)之間仍處于線性范圍（一般A值在0.2~2.0之間）。

4.甲臢的生成不僅與活細(xì)胞數(shù)成正比，也受加入MTT后作用時(shí)間的影響，即A值可隨著放置時(shí)間而改變。

MTT5.培養(yǎng)液中的酚紅、人血清蛋白、免疫球蛋白和某些添加劑可使A值增高。在進(jìn)行MTT法測(cè)定時(shí)應(yīng)先將這類物質(zhì)洗去。6.培養(yǎng)液中的血清可使A值增高，影響測(cè)定結(jié)果。解決方法：①應(yīng)用低于10%的胎牛血清，②加入DMSO之前盡量吸去孔內(nèi)殘余上清液，③用10%SDS鹽酸溶液代替DMSO。

7.如用DMSO溶解受試藥，DMSO終濃度應(yīng)低于0.5%。

MTT▲關(guān)于每孔的細(xì)胞數(shù)——預(yù)先摸索▲關(guān)于邊緣效應(yīng)——四周的孔只加PBS▲關(guān)于測(cè)定波長(zhǎng)——570nm？490nm？(460~630nm)

(460,503,540,570,590,630nm)▲在4℃存放的試劑，MTT、DMSO等用前室溫平衡30min▲所用試劑要先除菌處理MTT三、XTT法

[基本原理]XTT是MTT的衍生物,FW:673.5。當(dāng)XTT與電子偶聯(lián)劑硫酸酚嗪甲酯(PMS)同時(shí)使用時(shí)，XTT可被活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶還原形成水溶性棕黃色代謝產(chǎn)物，其生成量與活細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，在450nm波長(zhǎng)處有較大的吸收峰。在一定范圍內(nèi)吸光度(A)與活細(xì)胞的數(shù)量呈線性關(guān)系，用酶標(biāo)儀測(cè)定代謝產(chǎn)物的A值可反映活細(xì)胞的數(shù)量。

XTT[操作步驟]1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配制成密度為1×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液。96孔培養(yǎng)板每孔加細(xì)胞懸液100μl，再每孔加入不同濃度受試藥物(每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)以上復(fù)孔)10μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育48h。

XTT2.受試藥物處理48h后，96孔培養(yǎng)板的每孔加50μlXTT-PMS應(yīng)用液(內(nèi)含50μgXTT、0.3825μgPMS)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2~4h。3．用微型振蕩器振蕩培養(yǎng)板2~3min后，使染料分布均勻，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。[結(jié)果評(píng)定]

同MTT法。

[注意事項(xiàng)]XTT法尤其適用于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的研究。本方法的優(yōu)點(diǎn)是加入XTT后由于代謝產(chǎn)物溶于水，勿需吸去上清液即可測(cè)定A值，更簡(jiǎn)便快捷。

2.XTT不如MTT那樣容易被線粒體中脫氫酶還原，因此必須同時(shí)加入電子偶聯(lián)劑PMS。

3.XTT-PMS應(yīng)用液需預(yù)溫至37℃才能加入培養(yǎng)板內(nèi)。4.XTT的終濃度為0.297mmol/L，PMS終濃度多用5~25μmol/L，一般后者終濃度為5μmol/L即可獲得滿意結(jié)果。每孔加入的XTT量不宜過(guò)多，若XTT超過(guò)75μg/孔，可使A值下降。當(dāng)每孔培養(yǎng)液超過(guò)100μl時(shí)，XTTPMS應(yīng)用液的加入量也要相應(yīng)增加。

5.XTT水溶液不穩(wěn)定，加入PMS后更不穩(wěn)定，因而XTT-PMS應(yīng)用液一定要臨用前新鮮配制。一般在XTT中加入PMS并混勻后，應(yīng)立即加入到96孔板內(nèi)。

6.由于XTT法靈敏度高，每孔接種的細(xì)胞數(shù)不宜過(guò)多(通常為5000個(gè)/孔)。但有些細(xì)胞代謝活性低，如淋巴細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等，每孔接種細(xì)胞數(shù)需增加至2.5×105個(gè)，以獲得較多的代謝產(chǎn)物。四、WST-8法

[基本原理]

WST-8是四唑單鈉鹽。CCK-8試劑所含的WST-8在電子載體1-甲氧基-硫酸吩嗪甲酯(1-methoxyPMS)作用下，被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為水溶性黃色甲臢。細(xì)胞內(nèi)生成的甲臢數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性分析和抗腫瘤藥物篩選等。

[操作方法]1.選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼附生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，懸浮于含胎牛血清的培養(yǎng)液中，輕輕吹打使成細(xì)胞懸液。

2.96孔培養(yǎng)板孔內(nèi)加入細(xì)胞懸液100μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種后貼附需2~4h，如不需要貼附，可以省去此步驟。

3.每孔加入不同濃度的受試藥物，設(shè)相應(yīng)對(duì)照組，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。加入藥物后的培養(yǎng)時(shí)間，依藥物的性質(zhì)而定。

4.每孔加入10μlCCK-8試劑，輕輕振蕩使試劑與培養(yǎng)液混勻。

5.在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1~4h。由于細(xì)胞種類不同，形成的甲臢量也不同。如果顯色不足，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳培養(yǎng)時(shí)間。6.用微型振蕩器振蕩培養(yǎng)板使顏色均勻后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定A值(參考波長(zhǎng)655nm)。測(cè)定時(shí)需減去空白對(duì)照組(孔)的A值（不含細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入CCK-8試劑）。

[結(jié)果評(píng)定]

同MTT法。

[注意事項(xiàng)]1.本法采用單一試劑，操作簡(jiǎn)單，敏感性高，重復(fù)性好。

2.CCK-8試劑在4℃、避光條件下可保存1年。如需長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)置于－20℃。CCK-8試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融，經(jīng)常使用可將試劑置于4℃冰箱。3.由于每孔加入的CCK-8試劑的量比較少，可能會(huì)因試劑沾在孔壁上而導(dǎo)致誤差，故在加完試劑后應(yīng)輕輕敲擊培養(yǎng)板以助混勻。也可以用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋CCK-8試劑，混勻后加入。4.與貼附生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，CCK-8試劑用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞顯色比較困難。可通過(guò)延長(zhǎng)加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。

5.加入的受試藥物如果具有還原性，會(huì)與CCK-8試劑反應(yīng)，可增加吸光度。6.關(guān)于不同種類細(xì)胞的適宜接種細(xì)胞數(shù)、培養(yǎng)基及其用量、CCK-8試劑的用量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間等，可參考生產(chǎn)商日本同仁化學(xué)研究所提供的資料。7.AlamerBlue是近年美國(guó)BiosourceInt公司開(kāi)發(fā)的一種水溶性染料，其用途與CCK-8試劑相似。五、磺基羅丹明B法

[基本原理]磺基羅丹明B(sulforhodamineB，SRB)是一種粉紅色蛋白質(zhì)結(jié)合染料,含二個(gè)磺基,可溶于水。在酸性環(huán)境下,SRB能與三氯醋酸(TCA)固定后細(xì)胞內(nèi)大分子中的堿性氨基酸結(jié)合,被結(jié)合的染料的量在一定范圍內(nèi)與活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的量成正比,而蛋白質(zhì)的量與細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此,可根據(jù)染色強(qiáng)度推測(cè)活細(xì)胞數(shù)。

MTT法的一個(gè)缺點(diǎn)是A值可隨放置時(shí)間而改變,而SRB法無(wú)此現(xiàn)象,因此,更適用于進(jìn)行大規(guī)模試驗(yàn)。[操作步驟]1.用96孔培養(yǎng)板進(jìn)行操作。細(xì)胞接種、培養(yǎng)、加藥及藥物作用時(shí)間等均同MTT法，空白對(duì)照組只加入完全培養(yǎng)液，不加細(xì)胞。2.受試藥物處理細(xì)胞48h后，不除去培養(yǎng)液，96孔板每孔加入預(yù)冷的50%TCA液50μl(終濃度為10%)固定。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞則加入80%TCA液50μl(終濃度為16%)。

加入TCA時(shí)必須輕輕地加在培養(yǎng)液的表面，靜止5min后再將培養(yǎng)板移至4℃放置1h，使細(xì)胞固定在培養(yǎng)板的孔底。同時(shí)在加藥的即刻將部分接種的細(xì)胞用TCA固定，測(cè)定此時(shí)細(xì)胞的A值（T0）。

3.棄固定液,用去離子水洗5次，甩干,空氣干燥.4.用1%醋酸配制0.4%SRB溶液。每孔加入100μl,室溫染色30min.然后用1%醋酸洗5次,洗去未與蛋白結(jié)合的SRB,干燥。

3.吸棄含TCA的培養(yǎng)液，用去離子水洗板5次，甩干，空氣干燥至無(wú)濕跡。

4.用1%醋酸配制0.4%SRB溶液。每孔加入SRB液100μl，室溫染色15~30min。然后用1%醋酸洗滌5次，洗去未與蛋白結(jié)合的SRB，空氣干燥。

5.每孔加入10mmol/LTris液（pH10.5）150μl。用微型振蕩器振蕩使SRB完全溶解。

6.用酶標(biāo)儀在490或540nm波長(zhǎng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)對(duì)照組A值及加藥組A值，測(cè)定時(shí)用空白對(duì)照孔調(diào)零。

[結(jié)果評(píng)定]1.可按MTT法的計(jì)算公式，計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

2.規(guī)定對(duì)照組的A值為C,加藥組的A值為T,藥物作用0時(shí)的A值為T0,即剛剛加藥,藥物尚未發(fā)揮作用時(shí)的A值。如果T≥T0,說(shuō)明腫瘤細(xì)胞在加藥后仍然生長(zhǎng)：

(T－T0)

生長(zhǎng)率(%)＝×100%

(C－T0)例如：T=2.0,T0=0.4,C=6.0(T＞T0)(2.0－0.4)1.6

生長(zhǎng)率(%)＝×100=×100=28.6%

(6.0－0.4)5.6如果T＜T0,說(shuō)明加藥后細(xì)胞被殺傷：

(T－T0)

殺傷率(%)=×100

T0

(0.4－0.8)

殺傷率(%)=×100=－50%

0.8[注意事項(xiàng)]1.空白A值的高低與TCA的固定時(shí)間、培養(yǎng)液的血清濃度有關(guān),固定時(shí)間越長(zhǎng),血清濃度越高,空白A值越大。2.對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言,用490~530nm波長(zhǎng)測(cè)定A值,效果均可?！蚰壳翱蓱?yīng)用MTT法的公式，直接計(jì)算瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

3.本法用TCA固定細(xì)胞后,可隨時(shí)用SRB作蛋白含量測(cè)定,不受測(cè)定時(shí)間影響。SRB用Tris溶解后也可穩(wěn)定一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)期。

4.A與SRB濃度作圖時(shí)，在A單位1.5~2.0之間為線性,當(dāng)超出線性范圍時(shí),必須稀釋后重新測(cè)定。六、克隆形成試驗(yàn)

克隆形成試驗(yàn)（clony-formationtest，也稱集落形成試驗(yàn)）是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物作用的簡(jiǎn)便、可靠的體外方法，目前較為常用。

[基本原理]

克隆(clone)是指一個(gè)細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)增殖而產(chǎn)生的細(xì)胞群.單個(gè)細(xì)胞能連續(xù)分裂6代或以上時(shí),其后代所組成的群體即集落,凡一個(gè)集落超過(guò)50個(gè)細(xì)胞者即為一個(gè)克隆,大小在0.3~1.0mm,能形成克隆的細(xì)胞稱克隆原細(xì)胞(干細(xì)胞)。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)均以干細(xì)胞的增殖為基礎(chǔ)。

當(dāng)接種的細(xì)胞分布較稀疏時(shí)，每個(gè)克隆彼此不接觸，通過(guò)克隆計(jì)數(shù)，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行定量分析，故能較靈敏地檢測(cè)藥物的抗腫瘤活性。

克隆形成試驗(yàn)可分為兩種:

?平板克隆形成試驗(yàn)

?軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)

(一)平板克隆形成試驗(yàn)是指在培養(yǎng)皿上觀察克隆形成，該法適合于貼附生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞，如口腔癌KB、B16等。

[操作步驟]1．取生長(zhǎng)良好的貼附生長(zhǎng)細(xì)胞1瓶，瓶口過(guò)火后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1次。

2．用胰蛋白酶消化5min左右，在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈球狀時(shí)，加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液。

3．1000r/min離心10min后收集細(xì)胞，用含10%小牛血清的培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)節(jié)至每1ml含60個(gè)細(xì)胞。4．取5ml單細(xì)胞懸液注入直徑60mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿含300個(gè)細(xì)胞。以“十”字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分散鋪滿培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃過(guò)夜。

5．在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼附和分布情況，若貼附良好，分布均勻，棄去培養(yǎng)液即可加入5個(gè)以上不同濃度的受試藥(一般用含10%小牛血清的培養(yǎng)液配制)，每個(gè)濃度至少3皿，受試藥與細(xì)胞作用一定時(shí)間(2~24h或更長(zhǎng))后，棄去含藥培養(yǎng)液。6．用新配制的培養(yǎng)液漂洗3次后，加入無(wú)藥含血清培養(yǎng)液，靜止培養(yǎng)至10~12d,即可進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

7．計(jì)數(shù)前棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌l~2次，加入新配制的甲醇-冰醋酸液(3/l)3~5ml固定10min，棄去固定液。待稍干燥后加入10%Giemsa染色液染色約20min，當(dāng)克隆明顯著色時(shí)，用水洗去染色液。以含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)作為一個(gè)克隆，在20倍解剖顯微鏡下進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

[結(jié)果評(píng)定]

按下述公式計(jì)算克隆形成率和克隆形成抑制率：

克隆數(shù)克隆形成率（%）＝×100%

接種細(xì)胞數(shù)

加藥組平均克隆數(shù)克隆形成抑制率（%）＝（1－）×100%

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均克隆數(shù)

一般以克隆形成抑制率與劑量的對(duì)數(shù)作圖,得出一條S形曲線即劑量反應(yīng)曲線,并求出藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50),受試藥的IC50小于10μg/ml時(shí)值得進(jìn)一步試驗(yàn).

[注意事項(xiàng)]

1.細(xì)胞懸液中的細(xì)胞應(yīng)充分分散,單個(gè)細(xì)胞至少在90%以上,否則試驗(yàn)誤差大。

2.在培養(yǎng)早期不要晃動(dòng)培養(yǎng)皿。

3.實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（不加藥物僅加生理鹽水）的克隆形成率應(yīng)在40%~60%。

4.若待試藥為中藥粗制劑,如水煎劑,醇提液,應(yīng)用含藥血清。

(二)軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)

懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞必須在軟瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)增殖才能形成克隆。當(dāng)然,很多貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞也能在軟瓊脂中形成克隆。本方法適用于L1210、HL-60、B16、KB細(xì)胞。

軟瓊脂克隆形成法通常在塑料培養(yǎng)皿中進(jìn)行，由兩層瓊脂構(gòu)成：

上層為接種層，含細(xì)胞，瓊脂濃度為0.3%~0.4%

下層為鋪底層，瓊脂濃度為0.5%~1.0%

上層軟瓊脂可使細(xì)胞分散成單個(gè)，下層軟瓊脂作為支撐可防止細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。細(xì)胞增殖形成的克隆形態(tài)有塊狀、盤狀和蘑菇狀等。

[操作步驟]

1.將5g精制瓊脂(specialagar)加到盛有100ml雙蒸水的瓶?jī)?nèi)，瓶?jī)?nèi)壁不要粘掛瓊脂顆粒，68kPa(115℃)高壓滅菌15min。趁熱取出后振蕩均勻，置50℃水浴中降溫，降至50℃時(shí)備用。2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1瓶，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含15%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配成每毫升含1000個(gè)細(xì)胞的懸液，置37℃預(yù)溫。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求可作稀釋。

3.取35mm培養(yǎng)皿若干，3個(gè)為一組，加藥組各加入不同濃度的受試藥物（20μl/皿），實(shí)驗(yàn)對(duì)照組加入等體積的相應(yīng)溶劑。藥物作用一定時(shí)間后，棄去含藥培養(yǎng)液。

4.鋪底層瓊脂取在操作方法1中制備的5%瓊脂液1份，迅速加到9份37℃含15%小牛血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液中(0.5%瓊脂)，搖勻后立即加入平皿中，每皿1ml，室溫水平放置使瓊脂充分凝固。

5.鋪上層瓊脂取預(yù)溫37℃的細(xì)胞懸液9.4ml，移入小燒杯中，加入50℃的5%瓊脂0.6ml(0.3%瓊脂＋細(xì)胞)，迅速混勻，加到底層瓊脂的上面，每皿1ml，室溫水平靜置使軟瓊脂凝固。

6.將平皿置于密閉的盒中，放入5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)7~10d。7.在16倍解剖鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75μm(50個(gè)細(xì)胞以上)的克隆。

8.按平板克隆形成法的公式計(jì)算克隆形成抑制率，判斷受試藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成的抑制作用。

軟瓊脂克隆形成

[結(jié)果評(píng)定]

1.按平板克隆形成試驗(yàn)的公式計(jì)算克隆形成抑制率，以克隆形成抑制率對(duì)受試藥物劑量的對(duì)數(shù)作圖，可得到一條S形曲線，從中可求出受試藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。

2.當(dāng)受試藥的IC50﹤10μg/ml(或10-5mol/L)時(shí)，表示該受試藥值得進(jìn)一步研究。

七、染料拒染試驗(yàn)法

[基本原理]活細(xì)胞有排斥某些染料如臺(tái)盼藍(lán)、伊紅、苯胺黑等的能力,而死亡的細(xì)胞由于膜完整性破壞,可被著色。

[操作步驟]

1．選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成5×104個(gè)細(xì)胞/ml的懸液，分裝在培養(yǎng)瓶中，加藥組加入不同濃度的受試藥，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組加入等體積溶解受試藥的溶劑，在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4d。

2.取細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞先用胰蛋白酶消化)0.4ml,加入0.4%臺(tái)酚藍(lán)液0.1ml,在室溫作用5min,在15min內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。未染色的是活細(xì)胞,染藍(lán)色是死細(xì)胞。分別計(jì)數(shù)染色細(xì)胞數(shù)和未染色細(xì)胞數(shù)，求出細(xì)胞存活率。

未染色細(xì)胞數(shù)細(xì)胞存活率（%）＝×100%

細(xì)胞總數(shù)

[結(jié)果評(píng)定]

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞存活率應(yīng)在95%以上。在觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用時(shí)，可對(duì)加藥組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，求得每毫升細(xì)胞數(shù)，再用下列公式求出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)－加藥組活細(xì)胞數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）＝×100%

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)

2.以細(xì)胞存活率對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，可得一條S形劑量反應(yīng)曲線，從中求出半數(shù)殺傷濃度（LC50），當(dāng)LC50﹤10μg/ml并能重復(fù)時(shí)，應(yīng)做進(jìn)一步研究。

[注意事項(xiàng)]

1．由于下列原因，可能低估藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用：①受致死損傷的細(xì)胞，細(xì)胞膜完整性的破壞可以在藥物作用后3~4d后才表現(xiàn)出來(lái)，在此期間存活細(xì)胞可能繼續(xù)增殖，使活細(xì)胞數(shù)增多；

②某些受致死損傷的細(xì)胞可能過(guò)早地崩解，細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)已不存在，使著色細(xì)胞比例下降。因此，這一方法不太適合于僅抑制細(xì)胞分裂或使細(xì)胞增殖死亡的藥物，比較適合于可使細(xì)胞間期死亡的藥物。2.細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染色液混勻后，應(yīng)在15min內(nèi)計(jì)數(shù)完畢，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起細(xì)胞膜通透性增加，影響結(jié)果。

八、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法

[基本原理]

在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長(zhǎng)，如取細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)（Y軸）對(duì)培養(yǎng)時(shí)間（X軸）作圖，可得一條斜率向上的直線。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞密度不斷增加，由于代謝產(chǎn)物的堆積及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢以致停止，生長(zhǎng)曲線的斜率逐漸變平，進(jìn)入平臺(tái)期。因此，藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可通過(guò)生長(zhǎng)曲線反映出來(lái)。

[操作方法]

以懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞為例。

1.選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成1×104個(gè)細(xì)胞/ml的懸液，在25ml培養(yǎng)瓶中接種5ml。加藥組加入不同濃度的受試藥物50μl，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組加入等體積溶劑。

2.細(xì)胞置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)后即刻及1、2、3、4、5、6和7d分別取樣40μl，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液1