實(shí)驗(yàn)三、血液葡萄糖的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)七

血液葡萄糖的測(cè)定（福林-吳憲氏法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢o(wú)蛋白濾液的制備方法；掌握采用福林-吳憲氏法測(cè)定血液中葡萄糖的原理；進(jìn)一步熟悉分光光度計(jì)的使用。吳憲的科學(xué)貢獻(xiàn)吳憲的博士論文為基礎(chǔ)的一系列工作，為現(xiàn)代臨床血液化學(xué)分析提供了重要的分析手段，在國(guó)際上長(zhǎng)時(shí)間被廣泛采用。其中關(guān)于血糖測(cè)定的方法被國(guó)際上沿用長(zhǎng)達(dá)70年，為此他被譽(yù)為國(guó)際血液分析的權(quán)威。在20世紀(jì)20年代以前，測(cè)驗(yàn)血中的非蛋白氮組分對(duì)病人來(lái)說(shuō)是個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)，例如僅一次尿酸測(cè)定就需耗血25毫升。而福林—吳的新方法只需10毫升就足以進(jìn)行包括尿素、肌氨酸、肌氨酸酐、尿酸和糖的測(cè)定（其中只需一滴血就能測(cè)定血糖）。二、實(shí)驗(yàn)原理磷鉬酸鉬藍(lán)（藍(lán)色）C6H12O6+2Cu(OH)2C5H11O5COOH+Cu2O↓3Cu2O+3H3PO4·2MoO3·12H2O6CuO+3H3PO4·Mo2O3·12H2ONa2CO3＋H2O＝NaOH+NaHCO3

NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+Na2SO4堿性銅試劑鉬藍(lán)溶液顯藍(lán)色，其藍(lán)色的深淺與血濾液中葡萄糖的濃度成正比，選用顏色深淺較接近于測(cè)定管的標(biāo)準(zhǔn)管一同比色，即可求出測(cè)定管中葡萄糖的含量。血糖管的使用：血糖管下部的管徑較細(xì)，以避免還原生成的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實(shí)際結(jié)果。鎢酸法

原理：血液中的蛋白質(zhì)在pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，可用鎢酸來(lái)沉淀。鎢酸鈉與硫酸混合產(chǎn)生鎢酸和硫酸鈉，游離的鎢酸被，蛋白質(zhì)吸附，形成不溶性的鎢酸蛋白而沉淀，經(jīng)過(guò)濾或離心，除去沉淀即得無(wú)蛋白的血濾液。試劑：①10%鎢酸鈉溶液；②0.333mol／L硫酸溶液。儀器與器材：錐形瓶、吸管、奧氏吸管、濾紙、漏斗或離心管及離心機(jī)。方法與步驟：①取50ml錐形瓶1只，加入蒸餾水7份；②用奧氏吸管吸取抗凝血l份，擦去管壁外血液，將吸管插人錐形瓶中水的底部，緩慢地放出血液。放完血液后，將吸管提高吸取上清液再吹人，反復(fù)洗管3次。充分混合，使紅細(xì)胞完全溶解；③加入1/3mol／L硫酸溶液1份，隨加隨搖，充分混勻。此時(shí)血液由鮮紅變成棕色，靜置5～10min，使其酸化完全；④加入10％鎢酸鈉溶液1份，邊加邊搖，血液由透明變成凝塊狀。當(dāng)振搖到不再產(chǎn)生泡沫為止；⑤放置數(shù)分鐘后用定量濾紙過(guò)濾或離心除去沉淀，即得完全澄清的無(wú)蛋白血濾液，供測(cè)定用。用此法制得的無(wú)蛋白血濾液為10倍稀釋的血濾液。即每毫升血濾液相當(dāng)于全血0.ml，適用于葡萄糖、非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、全血無(wú)蛋白濾液的制備抗凝血1ml蒸餾水7ml混勻1/3mol/L硫酸1ml振搖10%鎢酸納1ml振搖過(guò)濾放置5min無(wú)蛋白血濾液2、按表操作混勻，置沸水浴中煮8min。取出用流動(dòng)自來(lái)水冷卻3min無(wú)蛋白血濾液蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)用液堿性銅試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管1.02.01.01.0---1.0-2.02.02.0血糖管試劑ml磷鉬酸試劑2.02.02.01：4磷鉬酸溶液加至混勻后放置2min12.512.512.53、比色測(cè)定將各管顛倒混勻后，用空白管調(diào)零，在420nm處測(cè)定吸收度。四、操作注意1、等水沸騰后，才能放入血糖管。加熱要準(zhǔn)確8分鐘。2、冷卻時(shí)切不可搖動(dòng)血糖管，以免還原的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實(shí)際結(jié)果。3、加入磷鉬酸后迅速比色。4、分光光度計(jì)的使用。五、結(jié)果計(jì)算測(cè)定管吸收度標(biāo)準(zhǔn)管吸收度葡萄糖（mg/100ml）×0.1

×1000.1

六、分析討論=1、分光光度計(jì)的原理分光光度計(jì)是根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收來(lái)測(cè)量微量物質(zhì)濃度的儀器，具有靈敏度、準(zhǔn)確度高，操作方便、快速等特點(diǎn)。其工作原理為光的吸收定律（朗伯—比爾定律）：一束單色光(強(qiáng)度為I0)通過(guò)某吸光物質(zhì)的溶液時(shí)，其光能量的被吸收與該物質(zhì)濃度的關(guān)系符合朗伯—比爾定律，即當(dāng)入射光波長(zhǎng)、溫度和溶液的厚度一定時(shí)，吸光度與溶液的濃度成正比。用公式表示為：T=I／I0

則A=lg（1／T）=Kbc

式中T—透光率

I—透過(guò)光強(qiáng)度

I0—入射光強(qiáng)度

A—吸光度

K—比例常數(shù)

b—溶液的厚度

c—溶液的濃度7200分光光度計(jì)分光光度計(jì)的組成

分光光度計(jì)種類很多，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和指示器五大部件組成。1.光源：是一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源光強(qiáng)度應(yīng)大，有良好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的變化。2.單色器：

將來(lái)自光源的光按波長(zhǎng)的長(zhǎng)短順序分散為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)的一種分光部件，包括入口狹縫、色散元件、出口狹縫和準(zhǔn)直鏡四部分組成。3.吸收池：

又稱為比色皿或比色杯等。常用吸收池是用無(wú)色透明、耐腐蝕的玻璃或石英材料制成，前者用于可見(jiàn)光區(qū)，后者用于紫外光區(qū)，吸收池光程0.1~10cm不等，其中以1cm為最多。4.檢測(cè)器：檢測(cè)器的作用是檢測(cè)通過(guò)溶液后的光強(qiáng)度、并把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。常見(jiàn)的檢測(cè)器有硒光電池、光電管和光電倍增管，后二者主要用于分光光度計(jì)。5.指示器：

常用儀器指示器有光點(diǎn)檢流計(jì)、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器等。光點(diǎn)檢流計(jì)和微安表指示器的標(biāo)尺上刻有百分透光度（T%）和吸光度A。

7200型分光光度計(jì)使用方法1．準(zhǔn)備

在接通電源前，應(yīng)對(duì)儀器的安全性進(jìn)行檢查，電源線、接線應(yīng)牢固，接地線通地要良好，各個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確。通電：指示燈亮，儀器自檢，預(yù)熱20min;用鍵設(shè)置測(cè)試方式:透射比(T),吸光度(A),已知標(biāo)樣濃度方式(C)和已知標(biāo)樣濃度斜率(K)方式;波長(zhǎng)選擇：用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長(zhǎng);放樣順序：打開(kāi)樣品室蓋，在1~4號(hào)放置比色皿槽中，依次放入%T校具(黑體)，參比液，樣品液1和樣品液2.

?容積光面對(duì)準(zhǔn)光路手握毛面

7200型分光光度計(jì)的使用方法2．校正

校具(黑體)?！?.000”：將%T校具(黑體)置入光路，在T方式下按“%T”鍵，此時(shí)儀器自動(dòng)校正后顯示"0.000"

參比液?！?00”%（T）或“0.000”（A）：將參比液拉入光路中，按“0A/100%T”鍵調(diào)0A/100%T，此時(shí)儀器顯示“BLA”，表示儀器正在自動(dòng)校正，校正完畢后顯示“100”%T或“0.000”A后，表示校正完畢，可以進(jìn)行樣品測(cè)定。該模式下使空白試樣透光率100%該模式下使空白試樣吸光度為0.000拉動(dòng)滑竿測(cè)定樣品的吸光度3.測(cè)定

將兩樣品液分別拉入光路中,此時(shí)若在“T”方式下則可依次顯示樣品的透射比(透光度)若在“A”方式下，則顯示測(cè)得的樣品吸光度。

4．結(jié)束

測(cè)量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置。取出吸收池，維持其干凈，不能有液體。比色皿洗凈，晾干，存于專用盒內(nèi)。5.注意事項(xiàng)：使用前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和原理，以及各個(gè)旋鈕之功能。儀器接地要良好，否則顯示數(shù)字不穩(wěn)定。如果大幅度改變測(cè)試波長(zhǎng)時(shí)，在調(diào)整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量變化急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時(shí)間），當(dāng)穩(wěn)定后，重新調(diào)整“00.0”和100”。儀器左側(cè)下角有一只干燥劑筒，應(yīng)保持其干燥，發(fā)現(xiàn)干燥劑變色應(yīng)立即更新或烘干后再用。儀器停止工作時(shí)，關(guān)掉電源，電源開(kāi)關(guān)需同時(shí)切斷，并罩好儀器比色皿的清潔程度,直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.不要用手摸比色皿的光滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，因此,特別要將比色皿清洗干凈.先用自來(lái)水將用過(guò)的比色皿反復(fù)沖洗,然后用蒸餾水淋洗,倒立于濾紙片上,待干后再收回比色皿盒中.必要時(shí),還要對(duì)比色皿進(jìn)行更精細(xì)的處理,如用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡,沖洗.比色皿與分光光度計(jì)應(yīng)配套使用,否則會(huì)引起較大的實(shí)驗(yàn)誤差.

比色皿不能單個(gè)調(diào)換預(yù)熱是保證儀器準(zhǔn)確穩(wěn)定的重要步驟.比色皿內(nèi)盛液應(yīng)為其容量的2/3,過(guò)少會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,過(guò)多易在測(cè)量過(guò)程中外溢,污染儀器.

比色皿中試樣裝入量應(yīng)為2/3～3/4之間拿放比色皿時(shí),