第六章細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

第六章細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用生物科學(xué)成為當(dāng)今世界自然科學(xué)的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，主要由于兩方面的原因一、二十世紀(jì)后葉，分子生物學(xué)領(lǐng)域一系列突變性成就，使生命科學(xué)在自然科學(xué)中的地位發(fā)生了革命性的變化。二、建立在實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)上的生物技術(shù)的發(fā)展為人類帶來(lái)了巨大的利益和財(cái)富。生物技術(shù)將是未來(lái)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的新動(dòng)力第一次技術(shù)革命工業(yè)革命解放人的雙手第二次技術(shù)革命信息技術(shù)擴(kuò)展人的大腦第三次技術(shù)革命生物技術(shù)改造生命本身主要內(nèi)容細(xì)胞工程的概念細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞工程及應(yīng)用植物細(xì)胞工程及應(yīng)用微生物細(xì)胞工程及應(yīng)用細(xì)胞工程的含義

細(xì)胞工程是指在細(xì)胞水平上的遺傳操作，即通過(guò)細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的技術(shù)。第一節(jié)細(xì)胞融合技術(shù)一、細(xì)胞融合技術(shù)研究進(jìn)展二、細(xì)胞融合技術(shù)的涵義三、細(xì)胞融合的方法和步驟四、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用一、細(xì)胞融合技術(shù)研究進(jìn)展Muller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無(wú)脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國(guó)楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽牛——龍面花大麥——花生大麥——大豆小麥——矮牽牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麥——蠶豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細(xì)胞融合成功的例子植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比,右瓶為地面融合的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠二、細(xì)胞融合技術(shù)含義和意義細(xì)胞融合技術(shù)（Cellfusiontechnology)是指兩種不同親株經(jīng)酶法除去細(xì)胞壁得到兩個(gè)球狀原生質(zhì)體或原生質(zhì)體球,然后置于高滲溶液中，在以聚乙二醇（polyethylenegleol)助溶和CaCl2存在下，促使兩者互相凝聚集并發(fā)生細(xì)胞融合，進(jìn)而導(dǎo)致基因重組，獲得新的菌株，這種融合又稱為原生質(zhì)體融合，其融合頻率高于常規(guī)雜交育種數(shù)倍到幾十倍。通電前通電3分鐘通電10分鐘通電2分鐘融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過(guò)程圖解

概念：所謂細(xì)胞融合就是指在外力(誘導(dǎo)劑或促融劑)作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源(種、屬間)細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交。意義：細(xì)胞融合不受種屬的局限，可實(shí)現(xiàn)種間生物體細(xì)胞的融合，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能，因而是改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限和生殖壁壘，極大地?cái)U(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍；細(xì)胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，只需將細(xì)胞遺傳物質(zhì)直接轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中就能夠形成雜交細(xì)胞，因而能夠提高基因的轉(zhuǎn)移效率。在技術(shù)和儀器設(shè)備上的要求不象基因工程那樣復(fù)雜，投資少，有利于廣泛開展研究和推廣，并可以進(jìn)行遺傳標(biāo)記，可促進(jìn)基因重組，對(duì)遺傳育種，選育優(yōu)良品質(zhì)，達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)具有重要意義。此外，細(xì)胞工程不僅可以在植物與植物之間、動(dòng)物與動(dòng)物之間、微生物與微生物之間進(jìn)行雜交，甚至可以在動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞之間進(jìn)行融合，形成前所未有的雜交物種。癌是非常令人恐懼的，人們談癌色變是因?yàn)榘┘?xì)胞能夠無(wú)限地生長(zhǎng)，甚至可以在病人身上長(zhǎng)到幾十千克。如果不切除，它還會(huì)繼續(xù)長(zhǎng)下去，直到癌細(xì)胞將正常的組織所需的養(yǎng)分全部掠奪從而把病人折磨至死。但是，當(dāng)癌細(xì)胞離開人體后，這一特性卻能夠變害為益?，F(xiàn)代免疫學(xué)早已查明，一種抗體是由一種B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，人體內(nèi)約有一億種不同的B淋巴細(xì)胞，可產(chǎn)生一億種不同的抗體。雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體的制備只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。雜交瘤技術(shù)NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

共同獲得1984年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

單克隆抗體應(yīng)用十分廣泛，被人們譽(yù)為對(duì)付癌癥的“生物導(dǎo)彈”。如采用抗癌細(xì)胞的單克隆抗體與放射性同位素、化學(xué)藥物或毒素相結(jié)合，注入體內(nèi)同癌細(xì)胞結(jié)合，能在原位殺死癌細(xì)胞，而對(duì)其它正常細(xì)胞則毫無(wú)損傷，因此，單克隆抗體還被喻為“抗癌明星”。單克隆抗體本身也可以起到治療作用，比如，注射乙肝病毒的單克隆抗體可以達(dá)到預(yù)防乙肝的目的。

二、細(xì)胞融合技術(shù)意義生物技術(shù)發(fā)展至今，細(xì)胞成了科學(xué)家們隨意發(fā)揮想像力的樂(lè)園，甚至可以把生命像積木那樣組裝起來(lái)，進(jìn)行細(xì)胞水平上的生命組合游戲。

最具代表的是美國(guó)耶魯大學(xué)教授克萊白特等的杰作。在黑毛鼠、白毛鼠、黃毛鼠的受精卵分裂成8個(gè)細(xì)胞時(shí)用特制的吸管把8細(xì)胞胚吸出輸卵管，然后用一種酶將包裹在各個(gè)胚胎上的粘液溶解，再把這三種鼠的8細(xì)胞胚放在同一溶液中使之組裝成一個(gè)具有24個(gè)細(xì)胞的“組裝胚”。再把“組裝胚”移植到老鼠的子宮內(nèi)，不久，一只奇怪的組裝鼠問(wèn)世，鼠全身披著黃、白、黑三種不同顏色的皮毛。

迄今為止，英國(guó)和美國(guó)還組裝成功了綿羊和山羊的嵌合體——綿山羊。據(jù)說(shuō)，世界各國(guó)科研人員熱情高漲，正在組裝“五位一體”、“六位一體”的生物。FirstClonedAnimalsbySCNTSheep,1997Mice,1998Calves,1998Goats,1999Pigs,2000Cat,2002Rabbit,2002Mule,2003Horse,2003Rats,2003Dogs,2005Ferrets,2006三、細(xì)胞融合的方法和步驟

誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有三種：（一）生物方法（病毒）采用病毒促進(jìn)細(xì)胞融合，如仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合，也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。（二）化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）（三）物理方法（電激和激光）?；瘜W(xué)和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之后，質(zhì)膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過(guò)程中便可誘導(dǎo)相接觸的細(xì)胞發(fā)生融合。

用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖

聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程電融合誘導(dǎo)法原理示意圖步驟舉例：人、鼠細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)分三步進(jìn)行∶

第一步、首先用熒光染料標(biāo)記抗體∶將小鼠的抗體與發(fā)綠色熒光的熒光素(fluorescin)結(jié)合,人的抗體與紅色熒光的羅丹明(rhodamine)結(jié)合；第二步、將小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞在滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)下進(jìn)行融合；第三步、將標(biāo)記的抗體加入融合的人、鼠細(xì)胞中，讓標(biāo)記抗體同融合細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合。開始,融合的細(xì)胞一半是紅色,一半是綠色。在37℃下40分鐘后,兩種顏色的熒光在融合的雜種細(xì)胞表面呈均勻分布，這說(shuō)明抗原蛋白在膜平面內(nèi)經(jīng)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)而重新分布。三、細(xì)胞融合的方法和步驟（一）氨基酸生產(chǎn)菌種的育種（二）酶制劑生產(chǎn)菌種的育種（三）酵母菌的育種（四）醬油曲霉菌的育種四、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體核移植動(dòng)物細(xì)胞工程其它動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程及其應(yīng)用重點(diǎn)人造皮膚一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)1、概念：

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖.2、原理：細(xì)胞增殖定義：人們通常將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。胰蛋白酶處理取出組織胚胎或幼齡動(dòng)物器官組織剪碎單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)（貼壁生長(zhǎng)長(zhǎng)成單層細(xì)胞。有接觸抑制現(xiàn)象）。①原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)這只老鼠身上的“人耳”是由我國(guó)科學(xué)家曹誼林教授利用生物技術(shù)培養(yǎng)出來(lái)的.

◆取供體細(xì)胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞.◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩二、核移植供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細(xì)胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)條件。有人說(shuō)它三個(gè)母親體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題在研究方面，克隆動(dòng)物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動(dòng)物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問(wèn)題。這些問(wèn)題尚在研究中。在應(yīng)用上，生產(chǎn)克隆動(dòng)物費(fèi)用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。三、動(dòng)物細(xì)胞工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用激素疫苗藥用蛋白植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞的全能性第三節(jié)植物細(xì)胞工程及應(yīng)用

當(dāng)植物細(xì)胞脫離了原來(lái)所在植物體的器官或組織而處于離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。

在生物的個(gè)體發(fā)育中，由于基因在特定時(shí)間和空間下選擇性地表達(dá)而形成不同器官，因此，要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的全能性，首先必須使生物體的細(xì)胞處于離體狀態(tài)。受精卵的全能性最高；其次是生殖細(xì)胞（尤其是卵細(xì)胞）；體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞低得多。

一、植物組織培養(yǎng)離體的植物器官、組織或細(xì)胞脫分化（又叫去分化）愈傷組織（排列疏松而無(wú)規(guī)則，高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）再分化根或芽等器官植物體植物組織培養(yǎng)的條件：

適宜的養(yǎng)料和激素，適宜的溫度和無(wú)菌條件切取形成層誘導(dǎo)愈傷組織的形成試管苗的形成培養(yǎng)室移栽脫分化再分化無(wú)菌接種在植物組培過(guò)程中，為什么要進(jìn)行一系列的消毒、滅菌，并且要求無(wú)菌操作？無(wú)菌操作技術(shù)細(xì)胞工程培養(yǎng)中最重要的，也是最基本的要求就是各項(xiàng)操作應(yīng)從無(wú)毒害、無(wú)污染的培養(yǎng)環(huán)境來(lái)考慮。培養(yǎng)基、器皿材料、接種工具、操作環(huán)境、培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)等各個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)注意。瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正確錯(cuò)誤

防止操作帶來(lái)的污染，接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求

正確錯(cuò)誤

接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正確錯(cuò)誤

接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶?jī)A斜，以免空氣中微生物落入瓶中正確錯(cuò)誤

二、植物體細(xì)胞雜交

將不同種植物的體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的技術(shù)。不同種生物之間存在著生殖隔離，所以用傳統(tǒng)的有性雜交方法是不可能做到這一點(diǎn)的問(wèn)題自然界中有一種含有葉綠體的原生動(dòng)物──眼蟲，說(shuō)明植物的細(xì)胞器同樣可以在某些動(dòng)物細(xì)胞中存活。請(qǐng)?zhí)接懀簞?dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞之間可以實(shí)現(xiàn)雜交嗎？獅虎獸與虎獅獸生殖隔離.

如果動(dòng)植物細(xì)胞理論上可以實(shí)現(xiàn)雜交，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)出具體實(shí)驗(yàn)方案。異想天開三、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用繁殖植物的新途徑微型育種作物脫毒人工種子育種新方法單倍體育種誘導(dǎo)突變體細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)沒有種子，如何繁殖？三倍體無(wú)子西瓜的培育過(guò)程優(yōu)點(diǎn)：繁殖率高，可大批量生產(chǎn)取材少培養(yǎng)周期短保持優(yōu)良性狀不受自然生長(zhǎng)季節(jié)限制1、微型繁殖繁殖植物的新途徑試管苗大規(guī)模培養(yǎng)2、作物脫毒長(zhǎng)期進(jìn)行無(wú)性繁殖的作物，易積累感染的病毒，導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)變差，而分生區(qū)附近（莖尖、根尖）一般不會(huì)感染病，用分生區(qū)的細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，就能得到大量的脫毒苗。人工種子結(jié)構(gòu)：人工薄膜+胚狀體（不定芽、頂芽、腋芽）優(yōu)點(diǎn)：不受氣候、季節(jié)、地域的限制保留優(yōu)良性狀時(shí)間短，占地少作物新品種的培育1