轉(zhuǎn)基因食品安全分析-課程-第四部分轉(zhuǎn)基因生物安全管理與檢測

第四章

轉(zhuǎn)基因生物安全管理與檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植情況轉(zhuǎn)基因生物安全管理轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)主要內(nèi)容轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植情況1996-2011年全球轉(zhuǎn)基因作物增長趨勢1.48億公頃，占全球農(nóng)作物種植面積的10%主要轉(zhuǎn)基因作物種植情況大豆玉米棉花油菜主要轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植比例常規(guī)作物轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)基因農(nóng)作的主要性狀轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植分布2010年全球轉(zhuǎn)基因植物面積達到1.48億公頃,涉及24種作物184個品系，種植國家有29個，發(fā)達國家占10個。共有59個國家批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物的種植和進口，包括美國、日本、加拿大、墨西哥、澳大利亞、南非、歐盟、中國等。玉米最多有60個品系批準(zhǔn)應(yīng)用，其次是棉花（35）、油菜（15）、大豆（14）。轉(zhuǎn)基因安全管理國際組織對轉(zhuǎn)基因生物安全管理國際食品法典委員會（CAC）聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）于1963年聯(lián)合創(chuàng)立的，其職責(zé)在于保護消費者健康，保證開展公正的食品貿(mào)易和協(xié)調(diào)所有食品標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。最早提出應(yīng)用風(fēng)險分析原則進行食品安全管理。165個成員國。1999年食品法典委員會建立了政府間特設(shè)生物技術(shù)食品工作組,在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域制定風(fēng)險分析原則和指南2000年發(fā)布了《關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物性食物的健康安全性問題》的文件，運用“實質(zhì)等同性”概念建立有效的安全性評估框架。/web/index_en.jsp并于2003年7月1日，在羅馬召開的聯(lián)合國食品標(biāo)準(zhǔn)署會議上，國際食品法典委員會通過了三項有關(guān)生物技術(shù)食品的原則和準(zhǔn)則，即“現(xiàn)代生物技術(shù)食品風(fēng)險分析原則”（CAC/GL44-2003）“重組DNA植物食品安全評估準(zhǔn)則”（CAC/GL45-2003）“重組DNA微生物食品安全評估準(zhǔn)則”（CAC/GL46-2003）食品法典委員會設(shè)立了食品標(biāo)簽法規(guī)委員會(TheCodexCommitteeonFoodLabelling，CCFL)2006年CCFL第34屆會議上通過建議一個實體工作組（physicalWorkingGroup）討論轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識的主要問題國際食品法典委員會（CAC）經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）經(jīng)濟合作與發(fā)展組織，簡稱經(jīng)合組織（OECD），是由34個市場經(jīng)濟國家組成的政府間國際經(jīng)濟組織，旨在共同應(yīng)對全球化帶來的經(jīng)濟、社會和政府治理等方面的挑戰(zhàn)，并把握全球化帶來的機遇。1986年，藍皮書《重組DNA安全性考慮》—轉(zhuǎn)基因生物總體指南1992年，《生物技術(shù)安全性考慮—1992》—明確生物安全的概念和原則1992年，《生物技術(shù)作物田間試驗安全考慮》—確定分階段原則和個案原則1993年，《現(xiàn)代生物技術(shù)加工食品風(fēng)險評估概念和原理》—實質(zhì)等同原則，現(xiàn)在有67個國家把這一原則作為轉(zhuǎn)基因食品安全評估的基本原則。1995年以來，風(fēng)險評估信息共享，已出版65個生物安全共識文件/topic/0,3699,en_2649_34385_1_1_1_1_37401,00.htm國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(InternationalOrganizationforStandardization,ISO)是一個全球性的非政府組織，1946年成立于瑞士日內(nèi)瓦,負責(zé)制定在世界范圍內(nèi)通用的國際標(biāo)準(zhǔn),ISO現(xiàn)有117個成員，包括117個國家和地區(qū)。ISO轉(zhuǎn)基因食品檢測標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會（ISOTC34/SC16），主管轉(zhuǎn)基因食品國際標(biāo)準(zhǔn)的制修訂工作。技術(shù)委員會負責(zé)起草國際標(biāo)準(zhǔn)，通過一致的標(biāo)準(zhǔn)來消除現(xiàn)存的貿(mào)易壁壘，推進國際商品和服務(wù)的交流。目前為止，ISO制訂6個轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測ISO標(biāo)準(zhǔn)一般性原則和要求蛋白檢測采樣核酸檢測核酸提取定性PCR檢測定量PCR檢測核酸檢測方法增補原則ISO24276:2006，Generalrequirementsanddefinitions

ISO21571:2005Nucleicacidextraction

ISO21570:2005QuantitativenucleicacidbasedmethodsISO21572:2004ProteinbasedmethodISO/TS21098:2005InformationtobesuppliedandprocedurefortheadditionofmethodstoISO21569,ISO21570orISO21571prENISO21568:2005Sampling21569:2005

Qualitativenucleicacidbasedmethods發(fā)達國家轉(zhuǎn)基因生物安全管理規(guī)定各國均以風(fēng)險分析為基礎(chǔ)，理念、內(nèi)容、方法無明顯差異，不同的戰(zhàn)略選擇和政策導(dǎo)向形成不同的管理模式—美國模式，以產(chǎn)品為基礎(chǔ)，風(fēng)險分析中應(yīng)用“可靠科學(xué)原則”只要在科學(xué)上無法證明它有危險性，就不應(yīng)該限制—歐盟模式，以過程為基礎(chǔ)，風(fēng)險分析中應(yīng)用預(yù)防原則只要不能否定其危險性，就應(yīng)該限制—日本模式，以過程為基礎(chǔ)，風(fēng)險分析中應(yīng)用“可靠科學(xué)”美、歐、日等，重視轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，通過立法和技術(shù)指南規(guī)范研發(fā)和應(yīng)用行為歐盟轉(zhuǎn)基因生物安全管理

法律體系分為指令Directive和法規(guī)Regulation兩個層次，頒布的法令在各國采納后對采納的國家有效，頒布的法規(guī)則直接有效。按照預(yù)防原則對轉(zhuǎn)基因生物進行單獨立法管理歐洲食品安全局負責(zé)風(fēng)險評價，負責(zé)GMOs的審批和市場投放,實施從農(nóng)田到餐桌的的各環(huán)節(jié)進行監(jiān)控，保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的可追溯性指令2001/18/EC《轉(zhuǎn)基因生物有意環(huán)境釋放》—規(guī)范任何可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物與環(huán)境接觸行為法規(guī)1829/2003/EC《轉(zhuǎn)基因食品和飼料管理條例》—轉(zhuǎn)基因食品審批和執(zhí)行制度法規(guī)1830/2003/EC《轉(zhuǎn)基因生物追溯性及標(biāo)識辦法以及含轉(zhuǎn)基因生物成分的食品及飼料產(chǎn)品的追溯性管理條例》—轉(zhuǎn)基因食品追蹤和標(biāo)識制度歐盟法規(guī)美國轉(zhuǎn)基因生物安全管理1976年，國家衛(wèi)生研究院（NIH）《重組DNA分子研究指南》全球首個轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全管理法規(guī)全球首個轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全管理法規(guī)，對重組DNA研究項目的進行審查、評價和監(jiān)控1986年頒布了《生物技術(shù)法規(guī)協(xié)調(diào)框架》將基因工程工作納入現(xiàn)有法規(guī)進行管理，由農(nóng)業(yè)部、環(huán)保署和食品藥品管理局在現(xiàn)有的法規(guī)框架下協(xié)調(diào)管理轉(zhuǎn)基因生物。農(nóng)業(yè)部（USDA），管理目的是確保轉(zhuǎn)基因生物（GMOs）的安全種植。有兩個機構(gòu)涉及該項工作，即：動植物檢疫局（APHIS）和食品安全及檢查局（FSIS）。環(huán)保署（EPA），負責(zé)管理轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境釋放。依照《聯(lián)邦殺蟲劑、殺菌劑、殺鼠劑法》、《聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法》對殺蟲劑（包括植物殺蟲劑，即轉(zhuǎn)抗蟲、抗病基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)）進行管理。具體負責(zé)殺蟲劑對農(nóng)業(yè)的影響和確定或免除殺蟲劑在食品中最高殘留量的管理。食品與藥物管理局（FDA），依照《聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法》，負責(zé)食品和食品添加劑的安全管理，確保所轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的蛋白質(zhì)對人類健康的安全。--負責(zé)食品標(biāo)識管理。美國管理部門日本轉(zhuǎn)基因生物管理、法規(guī)

日本在1979年制定了《重組DNA實驗管理條例》，開始生物技術(shù)的安全管理。所涉及的部門主要是科學(xué)技術(shù)廳、通產(chǎn)省、農(nóng)林水產(chǎn)省和厚生勞動省。科學(xué)技術(shù)廳：依照《重組DNA實驗準(zhǔn)則》，規(guī)范實驗室和封閉溫室的研究，負責(zé)審批試驗階段的重組DNA研究。厚生勞動?。∕HLW)：依照《重組DNA準(zhǔn)則》，負責(zé)對重組DNA技術(shù)生產(chǎn)藥品和食品的管理-食用安全。通產(chǎn)省（MITI)。：依照《遺傳工程體工業(yè)化準(zhǔn)則》，對將重組DNA技術(shù)的成果應(yīng)用于工業(yè)化活動進行管理-飼料安全。農(nóng)林水產(chǎn)?。∕AFF）：依照《農(nóng)、林、漁及食品工業(yè)應(yīng)用重組DNA準(zhǔn)則》負責(zé)管理GMO在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、漁業(yè)和食品工業(yè)中應(yīng)用-環(huán)境、飼料安全。MAFF和MHLW分別頒布了食品標(biāo)識體系，規(guī)范轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識標(biāo)準(zhǔn)。中國法律法規(guī)和制度要求特點：與國際組織及多數(shù)國家的理念、要求、做法一致中國生物安全網(wǎng)，/biosafety/jsbz/2001年，國務(wù)院《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》2002年，農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價辦法》2002年，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口管理辦法》2002年，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》2006年，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物加工審批辦法》

2004年，質(zhì)檢總局《進出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》

——一個《條例》，5個辦法規(guī)范了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、進口安全管理、標(biāo)識管理、加工審批、產(chǎn)品進出境檢驗檢疫工作，形成了一整套適合我國國情并與國際接軌的法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)程和管理體系。我國的法律法規(guī)制度國務(wù)院部際聯(lián)席會議，由農(nóng)業(yè)、科技、環(huán)境保護、衛(wèi)生、外經(jīng)貿(mào)、檢驗檢疫等有關(guān)部門負責(zé)人組成。農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全領(lǐng)導(dǎo)小組農(nóng)業(yè)部科技教育司（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室）國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會及其秘書處管理機構(gòu)農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管中心、農(nóng)業(yè)部植物新品種測試中心），承辦國家生物安全專家委員會秘書處的日常聯(lián)絡(luò)工作，是全國轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會秘書處掛靠單位，全國轉(zhuǎn)基因檢測體系和機構(gòu)能力建設(shè)、檢測監(jiān)測--農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)督檢驗測試中心等?；虬踩芾硖?，負責(zé)生物安全評價等具體技術(shù)工作，承辦兩個秘書處及生物安全網(wǎng)的具體事務(wù)。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全檢定處，負責(zé)轉(zhuǎn)基因檢測體系及機構(gòu)能力建設(shè)、檢測標(biāo)準(zhǔn)、全國性監(jiān)測的具體技術(shù)工作。技術(shù)支撐機構(gòu)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)全球主要國家轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識管理情況如何進行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測？

染色體水平

轉(zhuǎn)錄組水平

蛋白組水平

代謝組水平GM——Non-GM？轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測一般流程提取核酸或蛋白質(zhì)核酸檢測蛋白質(zhì)檢測或定性PCR定量PCR芯片檢測核酸測序側(cè)向流動試紙條酶聯(lián)免疫吸附轉(zhuǎn)基因生物檢測基于蛋白的轉(zhuǎn)基因檢測方法1.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。最常見的檢測方法是夾心法。將樣品提取液加入包被有目標(biāo)蛋白抗體的微孔板中，轉(zhuǎn)基因植物表達的外源蛋白的抗體與被檢測樣品中的外源蛋白結(jié)合。加入用酶（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的目標(biāo)蛋白抗體，抗原抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合。洗滌以后，加入底物顯色。辣根過氧化物酶催化底物成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量分析。ELISA檢測基本原理標(biāo)記有蛋白抗體的酶標(biāo)板根據(jù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)外源蛋白標(biāo)準(zhǔn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線××××根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理工作。2、側(cè)向流動型免疫試紙條方法原理快速檢測試紙條法應(yīng)用了雙抗體夾心法，首先將CP4EPSPS（抗草甘膦）蛋白特異的抗體，偶連于顯色試劑，并參入試紙條。當(dāng)試紙條被插入含有CP4EPSPS蛋白的植物組織的小量萃取物時，偶連抗體與蛋白之間就發(fā)生了結(jié)合，與偶連于顯色試劑上的某些但不是全部抗體形成夾心物。膜片含有兩個捕獲區(qū)，一個捕獲區(qū)可捕獲結(jié)合的CP4EPSPS蛋白，另一個捕獲區(qū)可捕獲顯色試劑。當(dāng)夾心物和未反應(yīng)的顯色試劑被膜片上的特定區(qū)捕獲時，這些捕獲區(qū)就顯現(xiàn)出紅色。若膜片上僅存在一條紅色對照線，便說明受檢樣品為陰性樣品，若存在兩條線，便說明受檢樣品為陽性樣品。蛋白檢測試劑盒蛋白檢測特點ELISA具備了酶反應(yīng)的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的特異性，具有簡便、快速、費用低等特點，但易出現(xiàn)本底過高的問題，且只能檢測目的蛋白抗原性沒有明顯變化的粗加工產(chǎn)品。側(cè)向流動免疫測定試紙條是一種很快速簡便的定性檢測方法，將試紙條放在待測樣品抽提物中，5～10分鐘就可得出結(jié)果，不需要特殊儀器和熟練技能。但一種試紙條只能檢測一種蛋白質(zhì)，且只能檢測有無存在外源蛋白而不能區(qū)分具體的轉(zhuǎn)基因品種?；诤怂岬霓D(zhuǎn)基因檢測方法35SpromoterEPSPSCP4NOSterminatorCaMVAgrobacteriumtumefaciens檢測主要依據(jù)是目的DNA鏈與特定的生物大分子結(jié)合或者與特異序列的雜交目的DNA主要由具有特定功能的基因及其相應(yīng)的調(diào)控元件組成。核酸檢測方法策略啟動子基因內(nèi)含子終止子篩選檢測基因特異性檢測構(gòu)建特異性檢測轉(zhuǎn)化體特異性檢測低植物基因組高ArneHAetal.,EuroFoodResTech,2007植物基因組TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA模板+引物

+

三磷酸脫氧核苷酸+

Taq

DNA聚合酶+

PCR反應(yīng)緩沖液（鹽離子）定性PCR檢測方法原理TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep1:變性94°C

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep2:退火T°依賴于引物

CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep3:延伸72°CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGATGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA量加倍TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA定性PCR產(chǎn)物電泳檢測DNA分子量大小對照檢測產(chǎn)物定性PCR檢測關(guān)鍵因子引物——設(shè)計PCR引物時使用輔助軟件既可節(jié)省時間，也能避免犯錯誤。如Oligo、PrimerExpress、PrimerPrimier5.0、VectorNTIsuite9和PrimerSelect(DNASTARINC)等專業(yè)的引物設(shè)計軟件?！锏膲A基組成、長度及靶序列的特異性是決定PCR成敗的關(guān)鍵。——引物是指DNA聚合酶啟動DNA合成時必需的一段寡核苷酸，是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵因素，PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性是由一對上下游引物所決定的。dNTPs是PCR反應(yīng)過程中DNA合成的原材料。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20～200mol/L。三磷酸脫氧核苷酸（dNTPs）dNTP濃度過高，堿基的錯誤摻入率增加，低濃度的dNTP可提高特異擴增的精確性。

反應(yīng)體系中4種dNTPs的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制TaqDNA聚合酶的活性。TaqDNA聚合酶最早是從一種嗜熱水生菌ThermusaquaticusYT-1菌株中分離純化獲得的，后來在嗜熱脂肪芽孢桿菌及其它幾種耐熱菌中也分離提純到此類DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶

酶量過多會使非特異性擴增產(chǎn)物增加，過少則使產(chǎn)量降低。反應(yīng)緩沖液

反應(yīng)緩沖液一般含有10～50mmol/LTris·Cl，50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度Mg2+(一般為1.5mmol/LMgCl2)。Mg2+濃度既影響酶的活性和真實性，又影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體形成等，因此，合適的Mg2+濃度是PCR的關(guān)鍵。

必要時在反應(yīng)緩沖液中還可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT）或100g/ml的牛血清蛋白（BSA），以穩(wěn)定Taq酶的活性。50mmol/L的KCl有利于引物退火，高于75mmol/L時PCR反應(yīng)明顯受到抑制。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCR檢測方法關(guān)鍵方法特異性9種轉(zhuǎn)基因玉米檢測方法的特異性示意圖(A)：GA21玉米；(B)：NK603玉米；(C)：BT176玉米；(D)：CBH351玉米；(E)：MON863玉米；(F)：TC1507玉米；(G)：T25玉米；(H)：BT11玉米；(I)：MON810玉米；(J)：玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因。泳道1～14分別是：空白對照、GA21玉米、NK603玉米、BT176玉米、CBH351玉米、MON863玉米、TC1507玉米、T25玉米、BT11玉米、MON810玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因油菜RT73和轉(zhuǎn)基因MON531棉花；泳道M為DL2000DNA分子量Marker.方法檢測極限（LOD）相對LOD值，指的是能夠檢測到的最低轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的含量，一般是以“xx%”表示的；以一系列不同轉(zhuǎn)基因含量的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品為PCR擴增模板，經(jīng)過至少三次重復(fù)后，確定可以獲得PCR擴增到的DNA樣品的最低轉(zhuǎn)基因含量為相對LOD值。

絕對LOD值，指的是能夠檢測的最低轉(zhuǎn)基因植物DNA的質(zhì)量，一般是以“xxpg”或“xx拷貝”表示的。以純的基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以不同濃度梯度DNA樣品為PCR模板擴增，經(jīng)過至少三次重復(fù)后，確定可以獲得PCR擴增到的DNA樣品的最低DNA質(zhì)量為絕對LOD值。已有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCR檢測方法

基因特異性：epsps、cry1Ab、Pat、bar、Gox、cry9C、NptII等

篩選特異性：CaMV35s啟動子、NOS啟動子和終止子、FMV35s等

構(gòu)建特異性：主要的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系

轉(zhuǎn)化體特異性：主要的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系上述方法LOD都達到0.1％，且很多已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化成為ISO和我國國家標(biāo)準(zhǔn)！??！熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。定量PCR檢測方法熒光定量PCR儀熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。

閉管反應(yīng)

(lowcontaminationrisk)

無需PCR后操作

(nogels,filmsetc)自動化高通量

單一反應(yīng)管檢測可以同時分析多個反應(yīng)管定量PCR檢測方法特點

蓋子PCR管加熱板

樣品透鏡熒光域值（threshold）以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍.熒光信號PCR循環(huán)

(高濃度)高CT

(低濃度)real-timePCRamplificationplots(7x10-folddilns.+NTC)終點（不能定量）閾值低CTCt值循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；Ct值取決于閾值；Ct值與模板DNA的起始拷貝成反比，與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系；兩個重要概念定量PCR檢測方法×實時熒光定量PCR方法絕對定量法，測樣品中的轉(zhuǎn)指的是利用定量PCR反應(yīng)及其構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得檢基因植物基因組或外源目的基因的質(zhì)量或拷貝數(shù)。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量PCR檢測，主要可以分為兩種方法：一種是絕對定量法，另一種是相對定量法。相對定量法，是指利用定量PCR反應(yīng)和構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析獲得檢測樣品中轉(zhuǎn)基因植物基因組或外源目的基因在樣品基因組DNA中的百分含量，結(jié)果可以用轉(zhuǎn)基因基因組DNA和樣品基因組DNA的質(zhì)量比或者轉(zhuǎn)基因植物和樣品的質(zhì)量比表示。108106102104T絕對定量法外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線＊獲得的是樣品中的植物基因組DNA或外源目的基因的絕對質(zhì)量或拷貝數(shù)。

絕對定量法

基因植物（外源基因）基因組質(zhì)量或拷貝數(shù)×100樣品轉(zhuǎn)基因含量（%）＝植物（內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因）基因組質(zhì)量或拷貝數(shù)相對定量法內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因外源基因ΔCT(ΔCT=參照基因的CT–轉(zhuǎn)基因的CT值）VS

轉(zhuǎn)基因含量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量PCR方法的關(guān)鍵參數(shù)特異性Specificity靈敏度Sensitivity準(zhǔn)確度Accuracy重復(fù)性Repeatability重演性Reproducibility特異性與靈敏度只能在含有靶序列的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中檢測出陽性信號!需要測試不同植物品種需要測試不同的轉(zhuǎn)基因植物足夠低的檢測靈敏度，滿足轉(zhuǎn)基因標(biāo)識的要求檢測極限（LOD）定量極限（LOQ）定量PCR方法可接受和應(yīng)用基本要求熒光染料：

SYBRGreenI、EvaGreen

引物特異性探針：

Amplifluor(Intergen)Scorpions探針通用模板探針（AUDP,UT）

LUX（LightUponExtension）探針序列特異性探針：熒光能量共振轉(zhuǎn)移探針（FRET)

雙標(biāo)探針（TaqMan、TaqManMGB、LNA、Allglo）分子信標(biāo)（MolecularBeacons，MB)實時熒光定量PCR熒光探針類型和基本原理5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI原理熒光染料法5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission優(yōu)點：（1）高度的通用性，幾乎可以用于任何型號的定量PCR儀和任何目標(biāo)DNA序列的擴增。（2）無需另外設(shè)計熒光探針，無需特別優(yōu)化條件，簡便易行，成本較低。（3）PCR反應(yīng)后可以進行融解曲線分析，分析反應(yīng)的特異性和目標(biāo)序列的突變等。缺點：（1）不具備目標(biāo)序列特異性，不能用于MultiplexPCR反應(yīng)，容易受污染物，非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體的干擾。（2）定量的準(zhǔn)確性不高，重復(fù)性不強。（3）高濃度的染料會抑制PCR反應(yīng)。Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針（FRETProbe）序列特異型探針優(yōu)點：（1）為雜交型探針，自身不被降解，其熒光信號是可逆的，PCR反應(yīng)后可以進行融解曲線分析，突變分析，SNP基因分型以及產(chǎn)物鑒別。（2）包含兩條探針，具備很高的目標(biāo)序列特異性，不受引物二聚體和非特異擴增的影響。缺點：由于需要合成兩條探針，探針的末端要封閉以避免延伸反應(yīng)，所以合成的成本會比較高，也比較麻煩。RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqManProbe）優(yōu)點：（1）具備目標(biāo)序列特異性，良好的穩(wěn)定性和靈敏度。（2）有多種不同波長的熒光基團對可供選擇，可以實現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測MultiplexPCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性。（3）探針自身對PCR反應(yīng)的影響較小，定量的準(zhǔn)確性高。

TaqMan是應(yīng)用最廣泛，最成熟的熒光定量技術(shù)，廣泛的應(yīng)用于人類傳染病診斷、動物疾病檢測以及轉(zhuǎn)基因作物定量檢測等。缺點：（1）探針設(shè)計有一定難度，需要驗證效果，探針的合成和雙熒光標(biāo)記成本高。

(2)探針較長使得兩端基團距離較遠，導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團也會產(chǎn)生不同波長的熒光，本底信號偏高，信噪比不高。（3）其為水解型探針，反應(yīng)中探針會水解，熒光信號不可逆，不能用于融解曲線分析。TaqManMGB

針對Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司推出了一種新TaqMan探針,即TaqManMGB，其工作原理與TaqMan探針相同。TaqManMGB優(yōu)點（1）3‘端采用了非熒光性的淬滅基因。（2）MGB探針的3‘端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交,升高探針Tm值，提高探針的特異性。（3）探針可以設(shè)計得更短，熒光報告基團和淬滅基團的距離更近,淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高。

（4）MGB探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，可以檢測單堿基突變。現(xiàn)在它也是轉(zhuǎn)基因作物定量檢測中的一種常用的定量技術(shù)。RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）序列特異型探針缺點:(1)雜交時探針不能完全與模板結(jié)合，因此穩(wěn)定性較差。(2)探針合成時標(biāo)記較復(fù)雜。

分子信標(biāo)是轉(zhuǎn)基因定量檢測的常用的技術(shù)，它還可以用于突變檢測，SNP檢測，在其基礎(chǔ)上發(fā)展的技術(shù)有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等。目前常用的序列特異性探針比較完成驗證方法44個，正在進行中31個！5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR2.3.1Amplifluor引物特異性探針優(yōu)點：1它是引物特異性探針，不需要引物以外的探針，節(jié)約成本，反應(yīng)體系優(yōu)化更加方便。2它是積累性熒光，信號不可逆，可用于融解曲線分析。3其探針序列是通用的，可用于檢測任何目標(biāo)序列，更節(jié)約成本。缺點：（1）對引物的擴增效率影響比較大，影響定量的準(zhǔn)確性。（2）其穩(wěn)定性不太好，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)對其標(biāo)記染料的淬滅能力有限，容易出現(xiàn)淬滅不徹底，導(dǎo)致本底信號強。該技術(shù)是在分子信標(biāo)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的技術(shù)，具了分析信標(biāo)的一般特點。通過優(yōu)化各個引物對之間的濃度比，達到同時特異性擴增的目的。同時擴增8種轉(zhuǎn)基因玉米的多重PCR——Harik.etal,2008轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測新技術(shù)和趨勢復(fù)合PCR檢測技術(shù)檢測LOD可以達到0.25%，這種方法快速，靈敏，高特異性，價格低廉，方便操作，可用于日常轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測。Harik.etal,2008什么是基因芯片技術(shù)？簡單的概括就是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補配對原理，與標(biāo)記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布進而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。基因芯片的基本原理？基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern、northern)一致，應(yīng)用已知的核酸序列作為探針與互補的靶序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析。基因芯片檢測技術(shù)基因芯片發(fā)展歷史Southern&Northern雜交斑點雜交微芯片Microarray芯片探針的設(shè)計第一部分品系特異性芯片-針對品系特異性的探針第二部分物種特異性芯片-針對內(nèi)標(biāo)基因的探針第三部分篩選特異性芯片-針對篩選元件的探針第四部分對照探針(i)提取樣品：裂解細胞，提取DNA（或者RNA）并純化。(iii)雜交和沖洗：按堿基配對原理DNA/cDNA樣品與芯片探針進行雜交，然后對芯片進行清洗。非特異性的結(jié)合可以部分的沖洗掉。(iv)掃描和成像：用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ箻?biāo)記底物激發(fā)熒光或者顯色，掃描儀器記錄每個樣點的信號值，樣點信號的強度取決于雜交的樣品DNA/cDNA的量。(v)數(shù)據(jù)處理與分析。讀取芯片樣點的信號值，對信號進行標(biāo)準(zhǔn)化等處理，通過計算機分析得出結(jié)果。工作流程(ii)樣品的擴增與標(biāo)記：樣品DNA/RNA通過PCR擴增、反轉(zhuǎn)錄等技術(shù)擴增并摻入熒光標(biāo)記分子或放射性同位素。Notomi,T.,H

etal.,2000,Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes.28:e63.引物設(shè)計原理核酸等溫擴增技術(shù)循環(huán)擴增2、反應(yīng)混合物加入SYBRGreenI1、反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳圖LAMP產(chǎn)物檢測表面等離子共振式傳感器(Opticalbiosensors)

原理：當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面時，可引起金屬自由電子的共振，使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完全消失的入射角稱為SPR角。SPR隨表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。因此可以通過獲取生物反應(yīng)過程中SPR角的動態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號。

將目標(biāo)DNA和固定在傳感器表面的探針雜交，使得溶液表面的折射率改變，該折射率的改變和雜交的目標(biāo)DNA的質(zhì)量成正比。傳感器檢測技術(shù)優(yōu)點：靈敏度高無需標(biāo)記實時監(jiān)測近紅外光譜法就是一種可以同時對農(nóng)產(chǎn)品中所有有效成分進行一次性系統(tǒng)分析的研究方法。近紅外光譜主要是由于分子振動的非諧振性使分子振動從基態(tài)向高能級躍遷時產(chǎn)生的，記錄的主要是含氫基團Ｘ－Ｈ（Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ）振動的倍頻和合頻吸收，適合用于碳氫有機物質(zhì)的組成與性質(zhì)測量。其工作原理是，樣品的組成相同，其光譜也相同，反之亦然。如果建立了光譜與待測參數(shù)之間的對應(yīng)關(guān)系（稱為分析模型），則只要測得樣品的光譜，通過光譜和上述對應(yīng)關(guān)系，就能很快得到所需要的質(zhì)量參數(shù)數(shù)據(jù)。近紅外光譜法（NIR）轉(zhuǎn)基因檢測技發(fā)展趨勢

定量檢測技術(shù)為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的主要檢測技術(shù)

轉(zhuǎn)化事件特異性檢測為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測趨勢

簡單、快速、現(xiàn)場、高通量檢測方法

多種檢測技術(shù)的聯(lián)合使用GMODetectionMethodDatabase(GMDD)－－NucleicAcid-basedMethodsListProtein-basedMethodsList核酸DNA提取主要包括裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。基本原則分離純化核酸總的原則——保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；——排除其它分子對于提取和純化的DNA的污染。核酸的純化三點要求

核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時應(yīng)去除RNA，反之亦然。

其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到最低程度；核酸制備的步驟多聚糖、酚復(fù)合物、蛋白質(zhì)和其它細胞溶解物破碎細胞或包膜－核酸游離在裂解體系中沉淀核酸以去除鹽、有機溶劑等雜質(zhì)，最后得到純化的核酸。裂解抽提沉淀機械破壞

（如：碾磨、超聲波處理、低滲裂解）化學(xué)處理法

（如：去污劑裂解、離液劑處理、硫醇還原等）酶消化（溶菌酶、纖維素酶等）裂解核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。通常使用苯酚和氯仿的混合物常用來除去多聚糖、酚復(fù)合物、蛋白質(zhì)和其它細胞溶解物。酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。最后用氯仿抽提是為了去除核酸溶液中的痕量酚。抽提沉淀常用醇來沉淀核酸以去除鹽、有機溶劑等雜質(zhì)。核酸是多聚陰離子的水溶液化合物，常用的有機溶劑有乙醇、異丙醇等。乙醇優(yōu)點：對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點：需要量大，一般要求低溫操作異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。CompanyLogoDNA提取方法DNA提取的方法BECDACTAB法SDS法聚乙烯吡咯烷酮法其它親和誘捕核酸純化方法核酸質(zhì)量評估與定量熒光定量測定法紫外分光光吸收法瓊脂糖凝膠電泳檢測法SGSGMO檢測報告解讀35S啟動子：位于外源目標(biāo)基因的起點控制區(qū)NOS終止子：位于外源目標(biāo)基因的終點控制區(qū)這兩種篩選測試已經(jīng)能夠覆蓋市場上大部分的轉(zhuǎn)基因植物，測試中的任何一個陽性結(jié)果可能反映基因改造成分的存在。在以上兩種測試中發(fā)現(xiàn)呈陽性結(jié)果的樣品，需要通過以下兩個測試，驗證是否存在其它的外源目標(biāo)基因。RoundupReady：抗除草劑草甘膦的基因（一種極普通的外源目標(biāo)基因）Bt內(nèi)毒素：抗蟲的基因（一種極普通的外源目標(biāo)基因）陰性對照：在進PCR時以水代替樣品DNA做模板，判斷樣品在實驗過程中是否存在污染。陽性對照：以陽性樣品的DNA作模板，用作樣本分析時指示PCR產(chǎn)物的位置。檢測限對照：選用來自國際標(biāo)準(zhǔn)署（IRMM）的轉(zhuǎn)基因標(biāo)樣，如果PCR反應(yīng)信號超過或等于0.1％標(biāo)準(zhǔn)值，即指示樣本呈陽性結(jié)果。內(nèi)對照：幾乎每一物種都含有自己特定的遺傳物質(zhì)，如果無法在樣品中檢測該種遺傳物質(zhì)，即認為沒有可檢測的DNA，或者DNA已經(jīng)降解，并不適宜用作轉(zhuǎn)基因成分測試。對于不知道樣品材料來源的部分的樣品，我們會使用幾乎所用真核生物細胞中都含有的一種特定遺傳物質(zhì)作內(nèi)對照。SGSGMO檢測報告解析SGSGMO檢測報告解析35S啟動子NOS終止子CP4-EPSPSBt基因：35S啟動子：花椰菜花葉病毒的啟動子，是一種強啟動子，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中，對它進行改造的許多啟動子可以有效提高外源基因的表達水平。同時對該啟動子的一些元件進行串聯(lián)，也可以有效提高外源基因的表達水平。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測，一般檢測CaMV35S啟動子是一段長195bp的堿基序列。

GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGT