第五章質譜法測定分子結構(二)大分子

有機質譜原理及應用第五章：質譜法測定分子結構(II),大分子1方法：ESI和MALDI兩種電離方法。對象：帶有官能團的可溶解高分子。1988年，Tanaka，最早報道聚乙烯醇(PEG)，~22,000。1992年，Danis，MALDI，聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，~30,000。

M.Karas&F.HillenkampMALDI，聚苯乙烯~70ku，PEG~40ku。1996年，C.Fenselau，聚苯乙烯~1500ku?！?.1高聚物質譜分析2一、質譜方法分析高聚物的特點1、人工合成高聚物的復雜性合成高分子是混合物，分子量是一種分布。不同的引發(fā)和終止反應所得的高分子有不同的端基。在隨機共聚物中，高分子鏈的組成呈現某種化學分布。在嵌段共聚物中存在著不同的嵌段長度和順序。非線性高分子，如環(huán)狀、支鏈和樹枝狀高聚物。2、質譜分析高聚物的特色樣品用量少、耗時短、速度快。儀器分辨率高．使單體分析和端基分析成為可能。直接測定絕對分子量，而不是相對分子量，精度高于光散射和膜滲透方法。測定分子量時，不需要標準品或Mark-Houwink常數。由分子量分布可獲得聚合反應的鏈增長常數。3二、MALDI-TOF方法測定高聚物影響因素1、基質基質的作用：從激光脈沖中吸收能量。要求：基質對激光光源必須有很強的吸收。使被測分子分離成單分子狀態(tài)。要求：基質和被測高分子具有很好的相容性，同時不能有強的分于間的相互作用。使用不同種類的激光(IR，UV)電離，需要用不同類型的基質。紫外激光解離的基質蒽三酚和銀鹽的混合是分析聚苯乙烯的首選，但是這個混合物不穩(wěn)定，見表格。紅外激光解離的基質YAG激光(3.27m，相當于3050cm-1)激發(fā)C-H的伸縮振動。應用于UV-MALDI的基質也可用于IR-MALDI。4MatricesPolymersHydrophilic2,5-dihydroxybenzoicacidPolypropyleneglycol-Cyano-hydroxycinnamicacidPolyvinylacetateFerulicacidPolytetramethyleneglycolIndoleacrylicacidPolymethylmethacrylateDithranolPolystyrenealltrans-RetinoicacidPolybutadieneDiphenylbutadienePolydimethylsiloxaneHydrophobic紅外激光與紫外激光電離的比較：紅外激光有較強的穿透能力，一次紅外激光照射能夠解吸更多的樣品，因此在一個樣品點上獲得的質譜圖較少，要經常更換激光照射點。紅外激光的脈沖較長。一般在10～20s，而通常的紫外激光的脈沖約在3～5s，這導致了IR-MALDI的分辨率較差。一般來講，紫外激光器更適于分析合成高分子，紅外激光器可用于一些鹵代高分予的分析?；|的選取：極性相似原則！常見基質的極性比較5基質Mr/cm-1(at337nm)PA(kJ/mol)2,5-DHB1540.79105-841~866854±14854±16-CHCA1890.79105-841933±9766±8芥子酸(SA)2241.10105-887894±13蒽三酚226-874±8IAA187-900±16HABA242-943766±8UV-MALDI基質的理化性質62、鹽效應高分子測定過程中的陽離子化不是質子轉移反應，而是金屬離子與高分子發(fā)生陽離子化反應，形成加合的高分子正離子。一般用Na+、K+等作為加合離子。有時不需要特別加入這些金屬，亦可以得到加合的正離子，這是由于容器上的Na+或K+所致。具有雜原子的合成高分子，在加鈉鹽、鉀鹽后產生加合金屬陽離子的正離子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。沒有雜原子的非極性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚異戊二烯在加入銀鹽或銅鹽后能夠成功的離子化，這些金屬陽離于與高分子中的雙鍵發(fā)生了作用。沒有雜原子和雙鍵的合成高分子．如聚乙烯和聚丙烯目前仍較難被MAIDI分析，因為它們的金屬陽離子結合能極低。73、樣品制備簡單混合法：在使用一個特定的樣品制備方法時，必須先選擇適用于基質、樣品和陽離子化鹽的溶劑，最理想的情況是使用一種溶劑．這樣可以減少樣品在靶上結晶時分層的危險。然而，鹽類幾乎不溶于用于非極性合成高分子的有機溶劑。一般來講，鹽可以先溶于一個中間溶劑．如丙醇中，然后再用用于基質和樣品的溶劑稀釋。制備樣品時，應選擇適當的溶劑、合適的濃度及配比，才能獲得較好的結果。電噴霧法一個很有前途的樣品制備方法是電噴霧沉積法，比起傳統(tǒng)的干點甚或薄層法，電噴霧法的優(yōu)點在于它可以形成小而均勻的結晶體。電噴霧沉積法制得樣品的點點之間重復性好，并且信號強度較大，層式的電噴霧效果更好一些。壓片法對于不溶的高分子樣品，如聚氨酯和大的多環(huán)芳香化臺物，發(fā)展了一砷新的制樣方法—壓片法．即將樣品和基質按一定比例混合后用球磨機研磨均勻，壓成薄片進行MALDI-TOF-MS分析。8三、MALDI-TOF方法測定高聚物的應用1、分子量的測定及分子量的分布計算公式：當分子量的分散度小于1.2時．可獲得符合Poisson分布的質譜圖，與GPC的結果一致。Mn：數均分子量Mw：重均分子量PD：分布常數ni：第i個寡聚物的相對豐度Mi：第i個寡聚物的質量PS2800的MALDI-TOF質譜圖PEG2000的MALDI-TOF質譜圖9PEG3100的MALDI-TOF質譜圖PS29ku的MALDI-TOF質譜圖聚合物數均分子量Mn重均分子量Mw分子量分布PD測定方法PS4600046760473191.01MALDI-TOF42000435001.03GPCPS7000073914745181.01MALDI-TOF66000675001.03GPCPEG1260012426124921.01MALDI-TOF11843123201.04GPCPEG23020022115221051.01MALDI-TOF20240212281.06GPCMALDI-TOF-MS方法與GPC方法所測分予量的比較102、末端基分析含有聯吡啶的共軛高分子結構聚合物的MALDI-TOF質譜(a)IAA為基質,(b)IAA為基質。并加入細AgTFA11高分子化合物3(n=5)，環(huán)狀寡聚物的實驗結果(左)和理論同位素分布(右)(a):[(C28H32N2S)5+H]+(b):[(C28H32N2S)5+Ag]+

選取2142.1u的單同位素峰來計算端基的質量。重復單元的質量是428.2,代入2142.1/428.2＝5，即428.25＝2141。這個峰的質荷比等于5個重復單元加1個質子比時帶上的氫原子的質量，因此可以椎測這個系列的高分子為環(huán)狀高分子．沒有端基。1235u+158u+H+237u6=1616u35u+140u+H+237u6=1598u17u+140u+H+237u6=1580un=6一種寡聚物的MALDI-TOF質譜分析兩種單體：三嗪聚胺的MALDI-TOF的質譜133、高分子混合物分析用MALDI分析不同種類的高分子混合物的文章很少．也許是因為離子化效率的顯著不同和其他一些歧視固素。例如二兩種窄分布的標準品PS10200和和PMMA9200分別溶解在THF中，以幾種體積比混合，接著以IAA為基質加甲酸鈉或以蒽三酚為基質加三氟乙酸銀。在第一套實驗方案中，PS和PMMA的體積比從0:1增加到199:1，基質是IAA/Na，也就是對PMMA是最佳條件，試驗結果十分令入驚奇，甚至PMMA是以05％的不純物存在干PS中，質譜圖仍然是PMMA的[M＋Na]+峰為主要峰。在第二套實驗中，PS和PMMA的體積比從1:0到1:9，基質是蒽三酚/Ag．也就是PS的最優(yōu)化條件。在所有混合物實驗中，PMMA是主要離子，而PS僅以相對干PMMA為10%的峰出現，質譜圖上主要是PMMA的峰。當然，這種有利于PMMA的歧視效應也許可以用來檢測PS中中痕量的PMMA．但是從這些結果中也可看出，用MALDI分析高分子混合物還要走很遠的一段路。144、嵌段型高分子分析嵌段共聚物之中嵌段和組成分布對于聚合物的最終性能有重要的影響。MALDI-TOF-MS也可以成功地應用于嵌段型高分子的研究。Dams等人用MALDI分析了-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。Wilezek-Vera等MALDI-TOFMS與1HNMR相結合，對苯乙烯/-甲基苯乙烯嵌段共聚物進行研究，測定了該共果物的組成分布和嵌段長度，我們研究組研究了榮乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。用MALDI/TOF測得的分子量和以GPC測定的結果參見表。從表中可以青出，對干這類窄分布的高分子化合物，MALDI/TOF所得結果與GPC法所得結果比較接近。但是MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有顯著的優(yōu)越性。MnMwPD共聚物GPC357737561.05No.1MALDI/TOF320735601.11共聚物GPC571963481.11No.1MALDI/TOF614265281.06GPC法和MALD/TOFMS法測得的分子量比較15§5.2藥物的質譜分析一、生物活性物質分析1、天然產物分析各種提取物的分析，HPLC/MS聯用分析RootsLeaves,Bark+Solvent

Filter

ConcentrateLC-MSnWherearetherebiologicallyactivecompounds?16Methanolic

根部提取物024681012141618202224262830Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance11.9411.088.703.172.0718.0213.4618.5414.0718.8316.9219.0015.1319.421.60水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL進樣LC-UV(215nm)17LC-MS,基峰離子流圖2468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7219.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.8720.026.257.975.093.5421.421.07Unknow水-甲醇梯度0.25mL/min,C-18Column20uL進樣18300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5?(M-H)(M-H)負離子ESI全掃描質譜圖(FullScanMS)Δ+14uUnknown119120140160180200220240260280300320m/z1000102030405060708090480510152025303540RelativeAbundance293.1179.1149.2311.9219.1180.5169.0294.2327.9121.1195.3144.9211.7275.2225.8164.0255.9244.5281.5324.9293.3307.2193.3325.8219.2179.3294.3308.3131.5200.5159.9276.1265.4233.3334.5246.5155.0285.1m/z293310.9OOOHOHOOHOHOHOHNegativeIonESIDataDependantMS/MSSpectraUnknown1Δ+14um/z17920300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090RelativeAbundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61AV:8NL:1.28E6RT:11.78-11.94AV:4NL:7.42E5(M-H)(M-H)ProposedEchinacosideStructureatm/z487增加一個亞甲基21RT:0.11-21.822468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance9.494.814.5817.8811.896.7211.3919.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.876.257.975.093.5421.421.07ProposedEchinacosidesConfirmedEchinacosideOn-The-FlyAnalysis!22大腦促眠素的發(fā)現與確證從貓腦袋中取出腦髓液，用液相色譜分離各組分，用電噴霧串聯質譜、氣質聯用、薄層層析、紅外及核磁確定各組分的化學結構，目的是找出與睡眠規(guī)律有關的物質。在貓睡眠周期的不同時間點采取腦髓液樣品，測定各樣品的紫外吸收光譜，發(fā)現貓在處于即將入睡狀態(tài)時，腦髓液試樣有一個特別顯著的紫外吸收峰。電噴霧四極桿串聯質譜分析各樣品的色譜峰中有顯著差異的組分，發(fā)現m/z282的離子。并證明是MH+離子，用快原子轟擊磁質譜測得其分子式為C18H35NO。CID實驗：m/z282的MS2和MS3。在低質量范圍，m/z282的子離子譜顯示長鏈烷烴的特征。質量數為17和35的中性丟失是母離子m/z282電離產生子離子m/z265，m/z247時產生的。在以上質譜分析的基礎上，綜合其它分析手段的表征結果，初步推測出這種催眠素的結構為順-9,10-十八碳烯酰胺。該化合物的合成和結構表征證實這一結構推測是正確的。23大腦促眠素的MS/MS質譜確定大腦促眠素的化學結構腦髓液中分離出的促眠素化學結構24結構分析：確定代謝途徑，微量條件下進行。定量分析：確定生物利用度等，在復雜本底的條件下測定。

OCH3NHClOSNHNHOOOH+OH?parent例：一種非胰島素依賴型糖尿病藥物的代謝分析(Noninsulindependentdiabetesdrug)

代謝物是有效的還是有害的?二、藥物代謝分析LC/MS/MS技術2524681012141618202224Time(min)050100RelativeAbundance23.878.7210.6511.8913.0116.79Glyburide代謝物10xOn-lineLC-MSn26100150200250300350400450500550m/z0102030405060708090100RelativeAbundance510512222199279241123391532176399369FullscanMSSpectrumofpeakat8.72minOn-lineData-DependantLC-MSnTriggerMass27150200250300350400450500m/z0102030405060708090100RelativeAbundance369371395352492m/z510>MS2On-lineData-DependantLC-MS228100120140160180200220240260280300320340360m/z0102030405060708090100RelativeAbundance169171304306288m/z510>m/z369>MS3On-lineData-DependantLC-MS329m/z369OCH3NHClOSNH2OOH+m/z395OCH3NHClOSNHOOO+m/z352OCH3NHClOSOO+m/z304OCH3NHClONH2+m/z288OCH3NHClO+m/z169OOCH3Cl+m/z510OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHm/z492+OCH3NHClOSNHNHOOOHMS1MS2MS3FragmentationScheme30三、遠電荷碎裂反應(Charge-RemoteFragmentation)

遠電荷碎裂：斷裂發(fā)生在遠離電荷的位置，與質譜解析一章中裂解均與電荷或自由基有關不同。主要原因是這種遠電荷碎裂反應發(fā)生在具有較長的碳鏈化合物中，如長鏈脂肪酸、膽汁酸、類固醇等。遠電荷碎裂反應在蛋白質分析中有時也會發(fā)生。研究方法：高能、中能、低能碰撞誘導解離MS/MS質譜。

高能碰撞：2~10kV，磁質譜儀上，TOF/TOF等。低能碰撞:100V以內，四極桿質譜儀，離子阱質譜儀。中能碰撞：100~1000V，扇形電場磁場/TOF聯用質譜(特制質譜)。311、遠電荷碎裂的主要反應機理長鏈飽和化合物1,4氫消除反應(1)兩步均裂反應(2)產生荷基異位離子末端不飽和離子

長鏈不飽和化合物(a)近烯丙基鍵，記作"Ap斷裂，Proximalallylbond。遠烯丙基-乙烯基鍵distalallyl–vinylbond,"Avd近烯丙基-乙烯基鍵，記作Avp斷裂，proximalallyl–vinylbond。X=O+

或

OLi2+。3213-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的遠電荷碎裂譜圖33十八烷酸CID-MIKES譜圖，[M-Ht2Li]+

(A)4,7-二烯十八烷酸,m/z293(B)6,9-二烯十八烷酸m/z293高能碰撞,6kV給出較多的信息，常用的遠電荷碎裂的方法。34長鏈脂肪酸[M-H]+離子的ES-MS/MS譜圖(a)硬脂酸，m/z283;(b)油酸,m/z281;(c)亞油酸,m/z279.譜圖采自于AutoSpec-OATOF儀器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞氣體。中能碰撞，400eV特殊設計的儀器上實現，有較多的信息。35低能CID譜，[M-Ht2Li]+，(4,7,10,13,16,19)-六烯二十二烷酸(docosahexaenoicacid,m/z341)。低能碰撞，400eV信息較少，特殊情況使用。36§5.3糖類的質譜分析糖：生命體的能源供給者，傳統(tǒng)的認識。糖的生物活性：與蛋白質、脂質、磷酸脂結合成“糖復合物”(glycoconjugate)，血漿、酶、激素及細胞外膜均有含糖蛋白。糖復合物參與細胞的識別、增生、分異；維持生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經系統(tǒng)和新陳代謝平衡。寡糖和多糖具有增強免疫力，抗輻射、抗腫瘤活性，成為藥物，中藥應用，生物多糖，保健藥物，保健品。糖結構的復雜性：單糖的組成為CnH2nOn(n=3~9)，其中n=5和6最為常見。每個單糖有多個手性碳原子。有鏈式結構和環(huán)式結構。寡糖和多糖的糖鏈是由含多元羥基的環(huán)狀己糖或戊糖通過苷鍵連接而成。各羥基環(huán)上有順反異構體，各單糖分子上有五個手性碳，連接的位置和構型多種多樣。37糖類分析的困難性：強極性，分離難，HPLC峰形不好。連接方式復雜，立體化學復雜。同系物多，糖苷鍵弱，復雜混合體系。電離效率不高、種類有限。16種單糖的常見結構一、單糖及多糖的結構1,核糖-D-呋喃核糖Rib2,阿戊糖-L-吡喃阿戊糖Ara3,戊醛糖-D-呋喃戊醛糖Xyl4,葡萄糖-D-吡喃葡萄糖Glc5,甘露糖-D-吡喃甘露糖Man6,半乳糖-D-吡喃半乳糖Gal7,海藻糖L-吡喃海藻糖Fuc8,乙酰氨基葡萄糖N-乙?；?(-D-吡喃葡萄糖酰胺)GlcNAc389,葡萄糖醛酸GlcA10,鼠李糖L-吡喃鼠李糖Rha11,乙酰神經氨糖酸NeuNAc12,胞壁酸2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脫氧--D-葡萄糖Mur14,雞納糖6-脫氧--D-葡萄糖15,泰威糖Tyv16,D-果糖Fru一個典型的雙觸角氮連接多糖的結構特征

觸角

核心區(qū)39二、質譜分析電離方式：FAB：傳統(tǒng)的電離方法，主要集中于低聚寡糖的分析。ESI：對于常規(guī)的ESI，天然多糖的電離不如肽和蛋白，納升噴霧可以改善電離效率，可以達到與肽和蛋白相當的程度。寡糖的親水性限制了ESI霧滴的表面活性，靈敏度低。納噴霧霧滴小，可以突破親水性的限制，靈敏度顯著升高。多糖的衍生化，減小親水性，可提高靈敏度，導致靈敏度提高的是表面活性的增加，而不是樣品的揮發(fā)性。MALDI：低聚物糖的電離效率基本與分子量無關。由于糖的不穩(wěn)定性，MALDI電離時會產生某些分解，尤其會產生亞穩(wěn)離子分解，可以用源后解離(PSD)技術測定亞穩(wěn)離子，但會使譜圖變得復雜。多糖碎片代號表示法非還原端用A,B,C表示。還原端用X,Y,Z表示。左上角標表示，環(huán)中兩根斷裂鍵所連碳原子的編號(從環(huán)上氧原子開始計數，紅色數字)，右下角的數字表示殘基的序號。40414243HumanGenomeProject§5.4核苷酸(Oligonucleotide)的質譜分析UnderstandingTheGenomeToFightTheDiseaseY2KDrugDesign44500600700800900100011001200m/z05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance919.1915.41098.61102.9787.81107.3922.5784.5686.1790.6817.11147.9689.1851.6691.7956.7609.91070.71064.7905.3768.7617.31153.71061.7720.3959.3664.8901.71174.31040.0590.0549.1522.1NegativeIonESIOf18mer(200fg/uL)進樣速度：3uL/min

乙腈-甲醇-丙酮(70:20:10,v/v/v,5%TEA)

毛細管溫度:100°COLIGO22#209-213RT:1.96-1.99AV:5NL:1.49E5T:-pFullms[450.00-1200.00]45OLIGO22#217-225RT:2.03-2.09AV:8NL:1.63E5T:-pFullms[450.00-1200.00]650700750800850900950100010501100m/z0102030405060708090100RelativeAbundance1102.91098.6918.8915.4787.5784.5689.3686.4611.2-5-6-7-8NegativeIonChargeStatesof18mer46#1RT:0.00P:-NL:3.85E5T:-pFullms[450.00-1200.00]48005000520054005600580060006200mass0102030405060708090100RelativeAbundance5520.05498.05541.05565.05745.04788.05972.05579.05385.05017.05221.04908.05116.06086.05762.06206.04821.0GATTCGTAGCTACGAATCReportedAvg.Mol.Wt:5500MonoisotopicMass:5497.7NegativeIonDeconvolutedSpectra47NegativeIonMS2Spectraofthe-5and-7ChargeStatesOLIGO22#435-444RT:4.86-4.98AV:10NL:1.29E5T:-cFullms21098.00@35.00[305.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance926.81071.51134.41068.51236.0817.91290.81167.9782.6610.11009.91347.11636.1850.3617.71388.0770.21480.01637.0481.21854.3506.1426.11997.7OLIGO22#495-507RT:5.62-5.79AV:13NL:2.65E5T:-cFullms2784.00@35.00[215.00-2000.00]400600800100012001400160018002000m/z020406080100RelativeAbundance765.3886.7875.8617.8923.21134.3610.3860.1673.61014.81135.1461.51347.1549.31636.11235.1426.21413.11485.3306.31782.01880.2GATTCGTAGCTACGAATCGATTCGTAGCTACGAATC48§5.5蛋白質分析一、氨基酸和小肽小肽斷裂碎片離子定義49研究小肽的結構：MS/MS分析例：一個五肽的分析具有保護基的五肽的一級結構：

BOC－Gly－Ala－D－Val－Leu－Ile－OBzBOC=t-Butyloxycarbony,Bzl=benzyl.離子類型MH+[MH-56]+[MH-100]+y4"y3"y2"y1"b4b3b2b1m/z662606562505434335222441328229158yn"=yn50各離子的生成途徑[MH-56]+McLafferty重排[MH-100]+51bn系列離子

yn"系列離子,yn"=yn+252

bn和yn"系列離子生成的另一種機理53氨基酸名稱單同位素相對分子量羥胺正離子質量氨基酸名稱單同位素相對分子量羥胺正離子質量甘氨酸(glycine,Gly/G)57.0214630天冬氨酸(asparticacid,Asp/D)115.0269487丙氨酸(alanine,Ala/A)71.0371144谷氨酰胺(glutamine,Gln/Q)128.05858101絲氨酸(serine,Ser/S)87.0320360賴氨酸(lysine,Lys/K)128.09496101脯氨酸(proline,Pro/P)97.0527670谷氨酸(glutamicacid,Glu/E)129.04259102纈氨酸(valine,Val/V)99.0684172甲硫氨酸(methionine,Met/M)131.04049104蘇氨酸(threonine,Thr/T)101.0476874組氨酸(histidine,His/H)137.05891110半胱氨酸(cysteine,Cys/C)103.0091976苯丙氨酸(phenylalanine,Phe/F)147.06841120異亮氨酸(isoleucine,Ile/I)113.0840686精氨酸(arginine,Arg/R)156.10111129亮氨酸(leucine,Leu/L)113.0840686酪氨酸(tyrosine,Tyr/Y)163.06333136天冬酰氨(asparagine,Asn/N)114.0429388色氨酸(tryptophan,Trp/W)186.0793115920種氨基酸殘基（NH-HCR-C=O）和羥胺正離子的質量54500600700800900100011001200130014001500160017001800m/z0100%998.2942.7893.2848.6808.3616.2771.5738.0617.21060.5999.61131.11061.81211.81132.51137.51305.01413.71541.91696.3160001700018000m/z0100%16951.4去卷積deconvolution20fmole馬心肌紅蛋白(HorseHeartMyoglobin)ESI質譜圖二、蛋白質分析55原始數據去卷積混合物：主要兩種betalactuglobulin56人血紅蛋白MALDI-TOF質譜圖57雞蛋溶菌酶ESI質譜圖58m/z1=895m/z2=945肌紅蛋白ESI質譜圖59§5.6蛋白質組學及應用什么是蛋白質組？由基因組，細胞或組織所表達的所有蛋白質成分。

蛋白質組的重要性

研究基因組功能的重要途徑。

藥物目標-在分子水平研究健康和疾病的相關。蛋白質組學是一門在整體水平上研究細胞內蛋白質組成及其活動規(guī)律的新興學科。蛋白質組學的終極目標是測定生物物種的所有生命活動中的所有蛋白質。Why蛋白質組學?mRNA表達水平不能預測蛋白質表達水平

蛋白質的修飾和加工不能從基因序列直接推導

蛋白質組是動態(tài)的并反映生物系統(tǒng)的狀態(tài)60蛋白質組學面臨的挑戰(zhàn)?蛋白質沒有可進行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。?在生物處理過程中蛋白質是高度動態(tài)變化的。?物理化學性質的多樣性。?動態(tài)范圍的挑戰(zhàn)：相對含量超過106范圍(血清中可達1012)質譜測量在蛋白質組學中的作用?質譜是肽(不是蛋白質)的一級序列分析的最普遍和最有效的工具。?質譜是一種精確的定量工具，尤其是內標法定量(如對同位素比的測量)。?質譜在確定蛋白質高級結構時不是很有效。?質譜對已知肽和蛋白質重復定量分析不是很有效。61經典的氨基酸序列分析方法N–端氨基酸單元的分析最常用的有下列兩種方法：桑格爾(SangerF)方法：利用肽鏈N–端游離氨基與2,4–二硝基氟苯(DNP)發(fā)生芳香親核取代反應，而將肽鏈上的氨基酸逐個分解。埃德曼(Edman)方法：用異硫氰酸苯酯(PITC)和N–端的游離氨基反應，將肽鏈上的氨基酸逐個分解。

C–端氨基酸單元的分析：通過羧肽酶催化水解用特定的酶催化使含某種氨基酸的肽鍵部位水解經典分析方法的缺點工作量大、測序速度慢、樣品用量大。62蛋白質的二維分離63

儀器 鑒定率肽質量指紋譜 MALDI ~50%

(PeptideMassFingerprinter,

PMF)多肽序列標簽 LC/MS/MS ~80%

(PeptideSequenceTag,

PST)從新測序

LC/MS/MS >

80%

(DeNovo)蛋白質及混合物的定量分析：同位素編碼親和標記(Isotope-CodedAffinityTags,ICAT)蛋白質序列研究的三個層次64蛋白質組研究技術路線樣品(組織、細胞等)凝膠圖象分析蛋白質鑒定二維數據庫酶解HPLC-MS、MS/MS數據庫檢索二維凝膠電泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指紋譜肽序列標簽從新測序65

一、肽質量指紋譜(PeptideMassFingerprinter,

PMF)PMF測定速度快。PMF靈敏。

PMF需要完整和準確的蛋白質序列數據庫。66分離的酶解的蛋白質96/384位樣品靶數據處理和數據庫檢索質譜樣品的準備MALDI質譜分析蛋白質一級結構結果PMF方法的一般流程67

洗膠/去污

脫水

減少S-S鍵

洗滌/脫水1、In-gel酶切/消化Multiprobe(4x96WellPlat)

樣品體積0.5-100L

板上加熱和冷卻

消化板加熱37oC

肽存儲在-4oC冷卻板

酶試劑存儲在-4oC冷卻板

修正-SH基

加入trypsin溶液5-12小時

肽提取2、質譜分析樣品的制備

靈敏度：500fmolesBSAin-gel。

移液和消化時間8小時(1x96wellplat)。

最多可進行4x96wellplat的同時消化?；灸芰?83、質譜測定設這檢索的條件，不同軟件有不同的參數和用法。MALDI-TOF質譜測定4、數據庫檢索parmeters參數的選擇樣品-1樣品-2樣品-3ProgramusedMS-FitPeptIdentPeptIdentpIrangeNO3~73.7~7.7Proteinmassrange20~50kD15~45kD15~45kDSpeciesearchedMAMMALSMAMMALSMAMMALSDigestusedTrypsinTrypsinTrypsinPeptidemassaccuracy±2Da±0.5Da±0.5DaMethioniceisOxidizedOxidizedOxidizedCysteineisCarbamidomethylation(Cys-CAM)PepptidemassesareAverageMonoisotopicMonoisotopicMumberofpeptides555Numberofmissedcleavages111Numberofpeptideusedinsearch11171569樣品1樣品2樣品3數據庫檢索結果：帶*號的峰為與數據庫中的峰相匹配的峰。樣品1：甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶樣品3：丙糖磷酸異構酶70PMF實驗，同一點上經常是蛋白質的混合物SomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithhighconfidenceSomeproteinsareidentifiedwithlowconfidenceRowdata71AndtherearestillpeptidesunassignedtoaproteinFinalresult72特有的搜索引擎73二、多肽序列標簽(PeptideSequenceTag,

PST)和肽階梯序列(PeptideLadderSequencing)1、肽序列標簽蛋白質的常見氨基酸有20種，一般3個氨基酸的肽段碎片將有8000種可能的排列方式4個氨基酸將有160000種排列方式，因此即使對于不是很大的原核生物的蛋白質組來說，一個短的序列片段也具有很高的特異性。肽序列標簽：一個多肽的部分氨基酸序列和該肽的質量以及該肽未測序部分的質量。MannM.etal,Anal.Chem.,1994,66,4390forPSTMannM.etal,TrandsinBiochem.Sci.,1996,21,494.74

例：馬心肌紅蛋白鑒定

馬心肌紅蛋白胰酶酶切產物的ESI-Q-TOF肽指紋譜75馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(雙電荷離子)的MS/MS譜圖肽序列標簽：G—L—S—D—G—E—W—Q—Q—V—L—N—V—W—G—Ky10,1257.8y3,390.3C端N端W—Q—Q—V—L—N—V—WY3,390.3y10,1257.8檢索結果：76N端Y—A—M—I—G—D—P—T—G—A—L—RC端y10,1000.5y7,715.4

例：m/z為691.43Da(M2+)，質量數為1380.6Da。

MS/MS圖肽序列標簽：檢索結果：來自乙醇脫氫酶715.4(DGI)1000.5772、肽階梯序列(PeptideLadderSequencing)梯狀測序法(laddersequencing)：用化學探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，經質譜檢測，由相鄰峰的質量差知道相應氨基酸殘基，與Edman法相似。AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AanPC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPITC+5%PICATZ(AA1)+AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnAcid(TFA)

aftermcyclesFurthercycles(withoutseparation)PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA2-AA3-AA4-AA5--AAn

PC-AA3-AA4-AA5--AAnPC-AA4-AA5--AAn

PC-AAm--AAn一步MALDI-MS階梯序列數據B.Chaitetal.,Science

262,89,1993.原理：78血纖維蛋白肽:ProteinladderSequencing[Glu1]fibrinopeptideB79傳統(tǒng)的低能量CADMS/MS質譜圖80MALDIPSD與高能CID的比較81可選擇性的碎裂方式：光誘導解離(UV-193nm)

相當于高能CID。多光子電離(IR-10.6μm)

相當于低能CAD。表面解離(SID)相當于低能CAD。電子捕獲解離(ECD)c和z類型碎片增強。注：這些方法在自動化大批量實驗中并不是常規(guī)的方法。

數據庫搜索為什么會失敗蛋白質不在數據庫里或者不正確的搜索參數(酶特征，分類法等等)。在數據庫里蛋白質表達不正確(DNA核苷酸序列，基因內區(qū)序列等等預測失敗)。蛋白質變性.-變性的氨基酸殘基-N端和C端的變化：蛋氨酸的形成，序列信號變化，C鏈縮短-可變的序列(同族以及選擇性結合的變體)-后修飾變化(糖基化，磷酸化等)-不希望的化學誘導修飾(在尿素中氨甲酰化)搜索引擎不夠完善成熟。82三、重新測序(Denovosequence)數據庫中沒有的蛋白質分析樣品來源于非序列化基因組蛋白質經多重高度修飾在實際生物體中，非同尋常的酶活性處理古生物樣本，樣品處理時肽被修飾(污染)合成肽重新測序的原因

譜圖的預處理多電荷峰轉化成單電荷峰多同位素峰轉化成擔同位素峰簡化譜圖提高信噪比83譜圖處理譜圖分析84

16O/18OC端標記為了提高對串聯質譜數據的解讀能力，尤其是對y和b型離子系列的辨別能力，用化學修飾方法使辨別更容易。

16O/18OC端標記：在蛋白質酶解時，酶解液中H218O和H216O各占50%，酶解后肽段羧基端上的羥基氧18O/16O的(M+2/M)同位素豐度比高于正常的峰強度，據此可以分辨出y系列離子。給出C-端離子的唯一特征碎片離子85denovo序列解釋馬爾可夫鏈蒙特卡洛(MarkovchainMonteCarlo)denovo

序列產生算法貝葉斯規(guī)則(Bayesian)斷裂方式和譜圖匹配算法Beta牛乳糖m/z841.5的MS/MS