微生物學(xué)課件第2章 微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

第二章微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)學(xué)時(shí)安排：2學(xué)時(shí)要求：1、掌握微生物的分離和培養(yǎng)技術(shù)2、了解顯微鏡和顯微技術(shù)

第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無菌技術(shù)

概述（1）培養(yǎng)物：微生物學(xué)中，在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物。（2）純培養(yǎng)物和純培養(yǎng)的概念：微生物學(xué)中，將由一個(gè)細(xì)胞（或一種微生物）繁殖所得到的后代稱為純培養(yǎng)物。對(duì)微生物這種純種的培養(yǎng)，稱為微生物的純培養(yǎng)。（3）無菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其它微生物污染的技術(shù)稱為無菌技術(shù)。常用器具：試管、玻璃燒瓶、平皿等器皿都要滅菌培養(yǎng)基：培養(yǎng)微生物營養(yǎng)物質(zhì)。也要滅菌常用的滅菌方法：高壓蒸汽滅菌微生物培養(yǎng)的常用器具及滅菌接種：在無菌條件下，用接種環(huán)把微生物從一個(gè)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)器皿，叫做接種。接種方法：燒環(huán)—冷卻—開管—沾菌和塞管—開另管—涂菌—塞另一管—火焰燒環(huán)（視頻）接種操作二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)菌落（CFU)的概念：由單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度后，形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體叫菌落。菌落的大小、形狀、邊緣狀況、質(zhì)地、光澤、顏色及透明度等是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)。菌苔：固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片，呈片狀，這就是菌苔。平板：即培養(yǎng)平板，指盛有固體培養(yǎng)基的平皿

在自然界中，各種各樣的微生物總是混雜在一起的，要研究和利用某一微生物，就必須把它同其他微生物分開，才能得到只含有同一種微生物的純種微生物。這種方法叫純種微生物的分離純種微生物的分離涂布平板法稀釋到平板法平板劃線分離法稀釋插管法

純種微生物的分離方法涂布平板法和稀釋倒平板法

平板劃線分離法

用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)稀釋法：適用于原生動(dòng)物和藻類的分離和培養(yǎng)四、單細(xì)胞分離顯微分離法——單細(xì)胞分離法用毛細(xì)管提取單個(gè)原生動(dòng)物個(gè)體用顯微操作儀分離單個(gè)細(xì)菌五、選擇培養(yǎng)分離

選擇培養(yǎng)分離：根據(jù)微生物的營養(yǎng)、生理、生長條件等特點(diǎn)，通過選擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物的分離與純化技術(shù)稱為選擇培養(yǎng)分離。用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制非需要菌的生長，促進(jìn)需要菌的生長，這種培養(yǎng)基叫選擇培養(yǎng)基。高氏一號(hào)培養(yǎng)基加10%酚數(shù)滴，抑制其它菌的生長，分離出放線菌馬丁氏培養(yǎng)基加鏈霉素以抑制其它菌生長，分離出真菌。富集培養(yǎng)根據(jù)不同微生物間特點(diǎn)制定特定的環(huán)境條件，使需要的微生物生長旺盛，數(shù)量增加。加富培養(yǎng)基：一般指在培養(yǎng)基內(nèi)加入額外的營養(yǎng)物質(zhì)，使需要的微生物營養(yǎng)更充分，生長的更快，這種培養(yǎng)基叫加富培養(yǎng)基。土懸液—培養(yǎng)基+硫磺—分離出硫桿菌土懸液—以羥基苯甲酸為唯一碳源的培養(yǎng)基——分離出能降解羥基苯甲酸的微生物。六、二元培養(yǎng)物純培養(yǎng)物：只含有一種微生物的培養(yǎng)物叫做純培養(yǎng)物?；旌吓囵B(yǎng)物：含有兩種以上微生物的培養(yǎng)物叫做混合培養(yǎng)物。二元培養(yǎng)物:只含有二種微生物的培養(yǎng)物叫做二元培養(yǎng)物。例如寄生于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的病毒與細(xì)菌一起培養(yǎng)。七、微生物的保藏技術(shù)菌種保藏目的

給微生物一特定的條件，使其不污染、不改變特性而存活下來。菌種保藏原理

用人工方法降低微生物的代謝強(qiáng)度，限制微生物的生長和繁殖，使其處于休眠狀態(tài)。傳代培養(yǎng)保藏——隔絕空氣低溫保藏冷凍保藏——保護(hù)劑+菌種——零下196度速凍保存，或-70度冷凍室保存，-20~-30度普通冰箱冷凍室保存。干燥保藏——砂土管保存法和冷凍真空干燥保藏法紙片保藏法、薄脈保藏法、寄主保藏法等菌種保藏方法

第二節(jié)

顯微鏡和顯微技術(shù)

決定顯微觀察效果的兩個(gè)重要因素：分辨率：指能辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力反差：指樣品區(qū)別于背景的程度一、顯微鏡的種類及原理普通光學(xué)顯微鏡

光學(xué)顯微鏡的分辨率(最小分辨距)：

D=0.5λ/nsinθ

式中λ為光源波長；n為玻片到物鏡介質(zhì)的折射率；θ為物鏡鏡口角的半數(shù)，它取決于物鏡的直徑和工作距離。nsniθ叫作數(shù)值孔徑。不同介質(zhì)的折射率：空氣為n=1.0；水n=1.33；香柏油n=1.55。因此，油鏡的分辨率高。暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡利用特殊聚光器實(shí)現(xiàn)給樣品斜射照明，由樣品反射或折射的光再進(jìn)入物鏡，這樣整個(gè)視野是暗的，只有樣品是明亮的。主要用于觀察生活細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。暗視野和相差顯微鏡下的微生物(a)梅毒螺旋體(Treponema

pallidum),引起梅毒的螺菌；暗視野。(b)團(tuán)藻屬(Volvox)和水棉屬(Spirogyra)的綠藻；暗視野。注意在成熟團(tuán)藻菌落中形成的子菌落菌，及水棉屬的螺旋狀葉綠體。(c)迂回螺菌(Spirillum

volutans),具有束狀鞭毛的一種個(gè)體很大的細(xì)菌。相差。(d)肉毒梭菌(Clostridum

botulinum),引起肉毒毒素中毒的細(xì)菌，它具有近端生卵形內(nèi)生孢子；相差。(e)草履蟲(Paramecium)染色后觀察到的中央大核和在其邊上的球形小核；相差。

相差顯微鏡

當(dāng)光線通過標(biāo)本時(shí)，由于直射光和衍射光的光程不同，就會(huì)是光波相位發(fā)生改變而產(chǎn)生相位差。相差顯微鏡具有環(huán)狀光闌和相差板，能將光相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿说娜庋劭梢圆煊X的振幅差（明暗差），從而使原來的透明物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異。對(duì)比度增強(qiáng)。因此可以在不染色的情況下，觀察到細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡熒光：熒光素吸收紫外線會(huì)轉(zhuǎn)放出可見光，這就是熒光熒光顯微技術(shù)：把標(biāo)本用不同的熒光素作標(biāo)記，在熒光顯微鏡下，經(jīng)過紫外線照射，標(biāo)本會(huì)在黑暗背景下表現(xiàn)出有光亮的物體。使標(biāo)本更便于觀察。透射電子顯微鏡

用電子波代替光源，最短波長的可見光λ=450nm；而電磁波的波長最短可以達(dá)到λ=0.005nm。所以，電鏡的分辨率遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡。掃描電子顯微鏡（SEM）

電子槍發(fā)出電子束被磁透鏡會(huì)聚成極細(xì)的探針，在樣品表面進(jìn)行掃描，電子束探針掃描到的地方可以激發(fā)樣品表面放出二次電子，二次電子的多少與樣本表面的立體形狀有關(guān)。二次電子由探測(cè)器收集并被閃爍器變成光信號(hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器再編成電壓信號(hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度。掃描隧道顯微鏡（STM）

該顯微鏡有一個(gè)半徑極細(xì)的金屬探針，將探針的針尖與樣品接近相距0.5—2nm時(shí)，進(jìn)行掃描，此時(shí)再在探針和樣品之間加上零點(diǎn)幾伏的電壓，會(huì)有納安級(jí)的電流產(chǎn)生，這種電流就是隧道效應(yīng)電流。通過電流變化來了解樣品表面的形貌。二、顯微觀察樣品的制備光學(xué)顯微鏡觀察樣品的制備活體觀察：

壓滴法、懸滴法、菌絲埋片法染色觀察：

一般微生物個(gè)體小而無色透明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的折光率與背景相差很小，在光學(xué)顯微鏡下，很難看清細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。通過對(duì)微生物染色，借助顏色的反襯作用，提高觀察樣品不同部位的反差，從而提高對(duì)細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察效果。染色的一般步驟：涂片—干燥—固定—染色—水洗—干燥—鏡檢固定的目的:一是殺死細(xì)菌，二是使菌體粘附于玻片上，三是增加其對(duì)染料的親和力。常用的固定方法有:火焰加熱法和化學(xué)固定法。細(xì)菌的染色方法

1884年，由丹麥病理學(xué)家革蘭創(chuàng)造并使用的一種能鑒別細(xì)菌的染色方法。染色過程:革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏染色法甲菌乙菌結(jié)晶紫初染碘液媒染95%酒精脫色番紅復(fù)染紫色紅色載網(wǎng)：銅網(wǎng)、不銹鋼載網(wǎng)支持膜：塑料膜、碳膜、金屬膜負(fù)染色技術(shù)：用電子密度高、本身不顯示其結(jié)構(gòu)，而且不與樣品反應(yīng)的物質(zhì)如磷鎢酸鉀對(duì)樣品染色，可以清楚的襯托出樣品表面結(jié)構(gòu)。實(shí)際是讓背景著色，使背景與標(biāo)本產(chǎn)生較大反差。投影技術(shù)：在樣品斜上方噴鍍金屬鉑或鉻，金屬面散射電子能力強(qiáng)，表現(xiàn)為暗區(qū)，無噴涂面散射電子能力弱，表現(xiàn)為亮區(qū)。這樣就可以了解樣品的高度和立體形狀。電子顯微鏡觀察樣品的制備透射電鏡的樣品制備超薄切片技術(shù)：標(biāo)本需要制作成100納米以下的超薄切片，方能看到內(nèi)部結(jié)構(gòu)?；静僮鬟^程：取樣—固定—脫水—浸透與包埋—切片—撈片—染色—觀察

取樣—脫水干燥——表面噴涂金屬導(dǎo)電層掃描電鏡的樣品制備第三節(jié)

顯微鏡下的微生物微生物類型：細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類細(xì)胞型微生物：細(xì)菌、古生菌、真核微生物非細(xì)胞型微生物：病毒、類病毒、朊病毒（見第三章）一、細(xì)菌和古生菌形態(tài)：球狀—球菌，桿狀—桿菌，螺旋狀——螺菌和弧菌。排列：?jiǎn)蝹€(gè)、成對(duì)、鏈狀、成簇特殊形態(tài)的細(xì)菌如柄細(xì)菌有柄、菌絲、附器等球衣菌有衣鞘支原體無細(xì)胞壁，只有細(xì)胞膜，故柔軟形態(tài)多變有些細(xì)菌不同生長階段具有不同形態(tài)：如放線菌形成營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲。細(xì)菌的形態(tài)也受環(huán)境條件的影響，培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等均能引起形態(tài)的改變。細(xì)菌的形態(tài)和排列球菌Staphylococcusaureus金黃色葡萄球菌Enterococcus

faecium屎腸球菌鏈球菌肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae化膿鏈球菌Streptococcuspyogenes球菌細(xì)胞形態(tài)及

其分裂面的圖解Esherichiacoli

大腸桿菌桿菌Bacillusanthracis

炭疽桿菌桿菌Pseudomonasaeruginosa

綠膿桿菌芽孢桿菌芽孢：細(xì)菌用來躲避不利環(huán)境的方式梭菌肉毒梭菌Clostridiumbotulinum破傷風(fēng)梭菌Clostridiumtetani弧菌Vibrio

cholerae霍亂弧菌

螺旋體Borrelia

burgdorferi布氏疏螺旋體Treponema

pallidum蒼白密螺旋體（梅毒密螺旋體）桿狀細(xì)菌的排列方式常因生長階段和培養(yǎng)條件而發(fā)生變化故難作為分類依據(jù)有纖毛和鞭毛的大腸桿菌大腸桿菌纖毛大腸桿菌鞭毛有鞭毛的桿菌柄細(xì)菌

古生菌與細(xì)菌有類似的形態(tài)，它們大多都生活在生存條件十分惡劣的極端環(huán)境里。如隱蔽熱網(wǎng)菌是最耐熱生物之一，它的最適生長溫度為105度。古生菌的形態(tài)

古生菌的細(xì)胞形態(tài)圖解球菌大小以直徑表示；桿菌和螺旋菌以其長度和寬度表示。但是，經(jīng)過干燥處理的菌體要比活菌縮短1/3——1/4；如果用襯托菌體的負(fù)染色法，器菌體可能比活菌還大。原核微生物的細(xì)胞大小

細(xì)菌大小測(cè)量微生物的表達(dá)單位為：

微米(μm=10-3mm)

納米(nm=10-6mm)

o

埃(A

=10-7mm)

微生物界研究大小范圍大致0.25~10μm(最大)0.75mm/50nm(最小)

=10~100億(細(xì)菌間)真核微生物菌物界單細(xì)胞真菌---酵母菌絲狀真菌-----霉菌大型真菌-----蕈菌粘菌假菌顯微藻類原生生物二、真菌霉菌的菌絲霉菌霉菌：絲狀真菌的總稱菌絲體：許多菌絲交織在一起，形成菌絲體菌絲種類：無隔菌絲和有隔菌絲菌絲分化：營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、繁殖菌絲霉菌的菌絲體霉菌大多酵母菌為單細(xì)胞以芽殖或裂殖進(jìn)行無性繁殖酵母菌酵母菌的出芽生殖釀酒酵母的繁殖

－－出芽生殖三、藻類除藍(lán)細(xì)菌、苔蘚植物和維管束植物之外，有葉綠素，能夠進(jìn)行光合作用，并伴隨釋放氧氣的一大類真核生物。藻類在供水系統(tǒng)長期存在可影響水質(zhì)。如自來水有怪味。藻類在近海大量繁殖，可消耗大量氧氣，引起大量的海洋生物死亡，這就是赤潮。放大200倍的斜紋藻四、原生動(dòng)物原生動(dòng)物是一類缺少真正細(xì)胞壁，細(xì)胞通常無色，具有運(yùn)動(dòng)能力，并進(jìn)行吞噬營養(yǎng)的但細(xì)胞真核生物。如草履蟲、變形蟲等。第二章重點(diǎn)內(nèi)容1、解釋名詞無菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其它微生物污染的技術(shù)稱為無菌技術(shù)。純培養(yǎng)物和純培養(yǎng)的概念：微生物學(xué)中，將由一個(gè)細(xì)胞（或一種微生物）繁殖所得到的后代稱為純培養(yǎng)物。對(duì)微生物這種純種的培養(yǎng)，稱為微生物的純培養(yǎng)接種：在無菌條件下，用接種環(huán)把微生物從一個(gè)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)器皿，叫做接種菌落的概念：由單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度后，形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體叫菌落。菌苔：固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片，呈片狀，這就是菌苔。平板：即培養(yǎng)平板，指盛