2017年主管檢驗技師考試臨床血液學(xué)檢驗講義第二十九章血栓與止血檢查的基本方法

））））））第二十九章 血栓與止血檢驗的基本方法一、一期止血缺陷篩查試驗二、二期止血缺陷篩查試驗三、血管壁檢驗四、血小板檢驗五、凝血因子的檢測六、抗凝物質(zhì)測定七、病理性抗凝物檢測八、纖溶活性測定九、血液流變學(xué)檢測一、一期止血缺陷篩查試驗1.出血時間（bleedingtime ，BT）（1）原理：測定在皮膚受特定條件外傷后，出血自然停止所需的時間即為出血時間。 BT反映了毛細(xì)血管與血小板的相互作用 ，包括內(nèi)皮下組織與血小板黏附（通過 vWF的作用）、血小板的聚集和釋放等反應(yīng)，以及PGI2與TXA2的動態(tài)平衡。（2）臨床意義：出血時間延長見于血小板減少癥；先天性血小板功能異常 ，如血小板無力癥、血小板貯存池??；獲得性血小板功能異常，如尿毒癥、藥物影響、異常蛋白血癥、骨髓增生性疾??； 血管性血友??；遺傳性血管周圍結(jié)締組織病如艾 -唐綜合征。一般凝血因子缺乏出血時間不延長，但某些嚴(yán)重的因子缺乏（如因子Ⅹ和Ⅺ）及無纖維蛋白原血癥可以延長。出血時間縮短見于某些嚴(yán)重的高凝狀態(tài)和血栓性疾病。此外，出血時間還廣泛用于外科手術(shù)前的出血篩選和抗血小板藥物的監(jiān)控，以免發(fā)生出血。（3）注意事項：試驗前一周患者應(yīng)停服阿司匹林、噻氯吡啶等抗血小板的藥物。2.束臂試驗（tourniquettest 或capillaryfragilitytest ，CFT）1）原理：通過前臂局部加壓，使靜脈血流受阻，給毛細(xì)血管以負(fù)荷，觀察前臂皮膚一定范圍內(nèi)新出現(xiàn)的出血點數(shù)目，來估計血管壁的完整性及其脆性。（2）臨床意義：新出血點的數(shù)目超過正常為陽性，見于： ①血管壁結(jié)構(gòu)和（或）功能缺陷 ，如遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥、 過敏性紫癜、單純性紫癜及其他血管性紫癜； ②血小板的量和（或）質(zhì)異常，如））））））））））））原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥 、血小板增多癥、先天性（遺傳性）和獲得性血小板功能缺陷癥； ③血管性血友?。╲WD）。二、二期止血缺陷篩查試驗1.凝血酶原時間測定（ prothrombintime ，PT）1）原理：在受檢血漿中加入過量的組織凝血活酶（人腦、兔腦、胎盤及肺組織等制品的浸出液）和鈣離子，使凝血酶原變?yōu)槟福笳呤估w維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。觀察血漿凝固所需時間即凝血酶原時間。該試驗是反映外源凝血系統(tǒng)最常用的篩選試驗。（2）參考值及報告方式①患者及正常對照的PT秒數(shù)，參考值為11～14s。超過正常3s為異常。②凝血酶原時間比值（prothrombintimeratio，PTR）=受檢者PT（s）/正常對照PT（s）。宜用多份正常人血漿PT的幾何均數(shù)，或其混合血漿的PT，參考值為1±0.15。③國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（internationalnormalizedratioISI，參考值為0.8～1.5。，INR）INR=PTRISI：所用組織凝血活酶的國際敏感指數(shù)（internationalsensitivityindex，ISI）ISI是所用組織凝血活酶與ISI已知的國際參比品或經(jīng)其標(biāo)定過的參比品之間敏感度相比較的一個參數(shù)。測定方法是用多份不同凝血因子水平的血漿（包括正常人和口服抗凝劑患者），用參比品測得它們PT的對數(shù)（logPT），再用待標(biāo)定的組織凝血活酶測得它們的logPT，以前者為縱坐標(biāo)，后者為橫坐標(biāo)作圖。經(jīng)回歸求得直線斜率。則待標(biāo)定的組織凝血活酶的ISI=已知ISI×斜率。ISI值越低，試劑對有關(guān)凝血因子降低的敏感性越高。（3）臨床意義：①PT延長見于遺傳性外源凝血系統(tǒng)的因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和纖維蛋白原減低，但均很少見。②肝臟疾?。河捎谕庠葱阅蜃又饕诟闻K合成，因而肝臟疾病時，PT延長。③維生素K缺乏癥：膽石癥、膽道腫瘤、慢性腸炎、偏食、2～7月齡的新生兒以及長期服用廣譜抗生素的患者等，由于維生素K吸收或合成障礙，導(dǎo)致肝臟合成異常的凝血酶原、FⅦ、FⅨ、FⅩ等分子，PT延長。④血液循環(huán)中抗凝物質(zhì)增加，如肝素或FDP增多等。DIC和原發(fā)性纖溶時，由于FDP生成增加，F(xiàn)DP有較強的抗凝能力，故也使PT延長。⑤用于香豆素類等口服抗凝劑的監(jiān)控，一般認(rèn)為以維持PT值在參考值的2倍左右（1.3～2.5倍）即25～30s或PTR為1.3～1.5（最大不超過2），INR以2.0～3.0為宜。⑥PT縮短見于口服避孕藥、高凝狀態(tài)和血栓性疾病等。（4）注意事項：①HCT影響：不同患者HCT不同，導(dǎo)致血漿量多少不一，因此游離的Ca2+濃度不同，從而導(dǎo)致PT結(jié)果異常。對于HCT＜35%和＞55%的患者，采血量或抗凝劑用量按下述公式計算。采血量（ml）=抗凝劑用量（ml）×9×（1-0.45）/（1-HCT）。②血漿標(biāo)本離心：相對離心力1500×g、離心10分鐘制備乏血小板血漿，若血漿中富含有血小板，PT將假性縮短。③溶血、脂血標(biāo)本：溶血時由于紅細(xì)胞中有促凝成分，可使PT假性縮短；脂血干擾某些儀器檢測過程中的濁度變化，因此會引起PT檢測結(jié)果的異常。2.活化部分凝血活酶時間測定（activatedpartialthromboplastintime，APTT）（1）原理：37℃條件下，以白陶土激活因子Ⅻ和Ⅺ，以腦磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第三因子，在Ca2+參與下，觀察乏血小板血漿凝固所需的時間，即為活化部分凝血活酶時間，是內(nèi)源凝血系統(tǒng)較敏感和常用的篩選試驗。（2）參考值））））））））））））男性：31.5～43.5s女性：32～43s受檢者的測定值超過正常對照 10s以上有病理意義。（3）臨床意義：①對內(nèi)源凝血途徑因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ）缺乏較 CT敏感（血小板異常不影響 APTT），能檢出Ⅷ： C小于25%的輕型血友病。對凝血酶原、纖維蛋白原缺乏則不夠敏感， 故APTT延長的最常見疾病為血友病 。此時可進一步作糾正試驗，即于患者血漿中加入 1/4量的正常新鮮血漿、硫酸鋇吸附血漿或正常血清（試劑參見凝血酶原消耗試驗的糾正試驗），再檢測 APTT。如正常血漿和吸附血漿能糾正延長的結(jié)果而血清不能糾正，則為因子Ⅷ缺乏；如吸附血漿不能糾正，其余兩者都能糾正，則為因子Ⅸ缺乏；如三者都不能糾正，則為病理性循環(huán)抗凝物質(zhì)。APTT及糾正實驗結(jié)果判定所含因子結(jié)果因子Ⅷ因子Ⅸ被糾正不被糾正正常新鮮血漿√√因子Ⅷ或Ⅸ缺乏正常血清×√因子Ⅸ缺乏病理性循環(huán)抗凝正常BaSO4√×因子Ⅷ缺乏物質(zhì)吸附血漿②在使用肝素治療時，多用 APTT監(jiān)測藥物用量 ，一般以維持結(jié)果為基礎(chǔ)值的 2倍左右（1.5～3.0倍）為宜（75～100s）。但應(yīng)事先檢測所用部分凝血活酶試劑是否對肝素敏感，即向正常人血漿中加入不同量肝素（從每毫升 0.1～1.0IU），看其 APTT是否相應(yīng)延長。③血管性血友?。河捎诨颊?vWF缺陷，使 FⅧ不穩(wěn)定，導(dǎo)致 FⅧ：C活性減低，故 APTT延長。不同類型vWDFⅧ：C活性降低不一樣，故APTT延長的程度也不同。異?？鼓镌龆啵貉巡患者長期輸注FⅧ，可產(chǎn)生FⅧ抑制物，引起APTT延長。一些患者存在狼瘡抗凝物（ LAC），使APTT延長。⑤纖溶亢進：原發(fā)性和繼發(fā)性纖溶亢進（如 DIC），產(chǎn)生大量的 FDP，使APTT延長。（4）注意事項：同 PT。三、血管壁檢驗血管性血友病因子檢測（vWF）：vWF是一種大分子蛋白多聚體，vWF的測定包括含量測定、功能分析，必要時還可進行基因診斷。（1）原理 ①vWF抗原測定：可利用免疫電泳法、 ELISA或膠乳凝集散射比濁法進行準(zhǔn)確定量。② vWF瑞斯托霉素輔因子活性檢測：在瑞斯托霉素存在的條件下， vWF通過與血小板膜 GPⅠb-Ⅸ相互作用使正常血小板發(fā)生凝集。凝集的強度與被檢血漿中 vWF的含量和結(jié)構(gòu)有關(guān)。將正常人混合血漿作為 100%瑞斯托霉素輔因子，用緩沖液將其稀釋成不同稀釋度，加入瑞斯托霉素和新鮮洗滌過的或甲醛固定過的正常血小板懸液，血小板會出現(xiàn)不同強度的凝集。根據(jù)正常血漿的稀釋度及其相應(yīng)的凝集反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。被檢血漿的瑞斯托霉素輔因子活性可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查到。（2）臨床意義：①vWF減低：主要用于 vWD的診斷和分型。②vWF增高：vWF是一種急性時相反應(yīng)蛋白，很多情況下都增高，常見于血栓性疾?。ㄈ缧募」Ｋ赖龋⒛I小球疾病、 DM、妊高征及大手術(shù)后。2.血漿6-酮-前列腺素 F1α（6-Keto-PGF1α）檢測（1）原理：ELISA法。將抗原（6-酮-PGF1α-牛血清白蛋白連接物）包被酶標(biāo)反應(yīng)板，加入受檢血漿或6-酮-PGF1α標(biāo)準(zhǔn)品和一定量的抗 6-酮-PGF1α抗血清，作用一定時間后， 再加入酶標(biāo)記第二抗體， 最后加入底））））））））））））物顯色。標(biāo)準(zhǔn)品或受檢血漿中的 6-酮-PGF1α與包被抗原競爭性的抗體結(jié)合，抗體與包被抗原結(jié)合的量與受檢標(biāo)準(zhǔn)品或血漿中的 6-酮-PGF1α量呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出受檢血漿中 6-酮-PGF1α的含量。（2）臨床意義：血漿6-酮-PGF1α減低 見于血栓性疾病 ，如急性心肌梗死、心絞痛、腦血管病變、糖尿病、動脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移、腎小球病變、周圍血管血栓形成及血栓性血小板減少性紫癜等。3.血漿血栓調(diào)節(jié)蛋白（ thrombomodulinantigen ，TM：Ag）的檢測（1）原理：ELISA雙抗夾心法：包被抗 TM單克隆抗體，待測血漿中 TM與包被抗體結(jié)合，加入過氧化物酶標(biāo)記的抗體，形成復(fù)合物，最后加入底物顯色，顏色深淺與 TM含量成正比。（2）臨床意義：正常情況下，血漿中 TM水平很低，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，血漿 TM水平顯著升高，且與損傷程度相關(guān)。目前認(rèn)為， 血漿TM檢測是了解血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的最好的指標(biāo) 。血漿TM水平增高見于糖尿病、SLE、DIC、急性心肌梗死、 TTP、HUS、腦血栓、白血病等。四、血小板檢驗1.血小板生存時間（ plateletsurvivaltime ，PST）（1）原理：丙二醛（ MDA）法或TXB2法：由于阿司匹林能不可逆性抑制血小板 AA代謝過程中環(huán)氧酶的活性，使其代謝產(chǎn)物 MDA和TXB2生成減少。與此同時，因新生血小板未受阿司匹林的抑制， 故其MDA和TXB2含量正常。根據(jù)病人口服阿司匹林后，血小板 MDA和TXB2生成量的恢復(fù)曲線可推算出血小板的生存時間。MDA含量可用熒光分光光度計法測定， TXB2可以用放射免疫法或酶聯(lián)免疫法測定。 本試驗可反映血小板生成與破壞之間的平衡， 但在血小板計數(shù)過低時本法的敏感性較差 。（2）臨床意義：血小板生存期縮短，見于：①血小板破壞增多性疾?。喝缭l(fā)性血小板減少性紫癜 、同種和藥物免疫性血小板減少性紫癜、脾功能亢進、系統(tǒng)性紅斑狼瘡； ②血小板消耗過多性疾?。喝?DIC、血栓性血小板減少性紫癜（TTP）、溶血尿毒癥綜合征（HUS）；③血栓性疾?。喝缧募」Ｋ?、心絞痛、糖尿病伴血管病變、深靜脈血栓形成、肺梗死、妊娠高血壓疾病、惡性腫瘤。2.血小板相關(guān)免疫球蛋白（ plateletassociatedimmunoglobulin ，PAIg）檢測1）原理：PAIg包括PAIgG、PAIgM、PAIgA和PAC3?，F(xiàn)以PAIgG檢測為例。ELISA法（雙抗體夾心法）：將抗人IgG抗體包被在酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)，加入被檢血小板裂解液，若此液中存在PAIgG，便與包被的抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)的抗人IgG抗體，與結(jié)合在板上的PAIgG結(jié)合，最后加入底物顯色，其深淺與血小板裂解液中的PAIgG成正比。根據(jù)被檢者所測得的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出血小板裂解液中的 PAIgG含量。（2）臨床意義1）PAIg增高：見于 ITP，90%以上ITP患者的PAIgG增高，若同時測定 PAIgM、PAIgA和PAC3，其靈敏度可高達100%。但其特異性較低，許多疾病如同種免疫性血小板減少性紫癜（多次輸血、輸血后紫癜）、藥物免疫性血小板減少性紫癜、惡性淋巴瘤、慢性活動性肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、 Evan綜合征、良性單株丙球蛋白血癥等也有不同程度的升高，因此， PAIg只能作為篩查指標(biāo)。2）觀察病情：經(jīng)治療后， ITP患者的PAIg水平下降；復(fù)發(fā)后，則又可升高。3.血小板聚集試驗 （plateletaggregationtest ，PAgT）（1）原理：濁度法：在富含血小板血漿（ PRP）中加入致聚劑，血小板發(fā)生聚集，血漿濁度變化，透光度增加，血小板聚集儀將這種濁度變化轉(zhuǎn)換為電信號并記錄，形成血小板聚集曲線。根據(jù)血小板聚集曲線可了解血小板聚集的程度和速度。電阻法（阻抗法）是根據(jù)電阻抗原理，通過放大、記錄浸泡在全血樣品中電極探針間的微小電流或阻抗的變化來測定全血樣品血小板聚集性的方法。近年來，出現(xiàn)了一種采用激光散射法進行血小板聚集檢測的儀器。血小板聚集試驗（透射比濁法）））））））））））））血小板聚集曲線與血小板狀態(tài)對應(yīng)示意圖（2）臨床意義1）PAgT增高：反映血小板聚集功能增強。見于高凝狀態(tài)和（或）血栓前狀態(tài)和血栓性疾病 ，如心肌梗死、心絞痛、糖尿病、腦血管病變、妊娠高血壓綜合征、靜脈血栓形成、肺梗死、口服避孕藥、晚期妊娠、高脂血癥、抗原-抗體復(fù)合物反應(yīng)、人工心臟和瓣膜移植術(shù)等。2）PAgT減低：反映血小板聚集功能減低。 ①見于獲得性血小板功能減低 ，如尿毒癥、肝硬化、 MDS、原發(fā)性血小板減少性紫癜 、急性白血病、 服用抗血小板藥物 、低（無）纖維蛋白原血癥等。②遺傳性血小板功能缺陷，不同的血小板功能缺陷病對各種誘導(dǎo)劑的反應(yīng)不同。 血小板無力癥（Glanzmann?。篈DP、膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集減低和不聚集。巨大血小板綜合征： ADP、膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集正常，但瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板不凝集。 貯存池?。褐旅茴w粒缺陷時，ADP誘導(dǎo)的聚集常減低，無二相聚集；膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集正常； α顆粒缺陷時，血小板凝集和聚集均正常。血小板花生四烯酸代謝缺陷： ADP誘導(dǎo)的聚集常減低，無二相聚集，膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集均低下。（3）操作注意事項1）采血順利，避免反復(fù)穿刺將組織液抽到注射器內(nèi)，或?qū)馀莼烊搿?）抗凝劑采用枸櫞酸鈉抗凝，不能以 EDTA作為抗凝劑。3）阿司匹林、潘生丁、肝素、華法林等藥物均可抑制血小板聚集，故采血前一段時間不應(yīng)服用此類藥物。4）測定應(yīng)在采血后 3h內(nèi)完成，時間過長會導(dǎo)致聚集強度和速度降低。））））））））））））血小板釋放反應(yīng)產(chǎn)物測定1）原理：β-血小板球蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）和血小板第四因子（plateletfactor4，PF4）是血小板α顆粒中特有的蛋白。當(dāng)體內(nèi)有過多的血小板被激活，釋放反應(yīng)亢進時，二者血漿中的濃度升高，因此，β-TG和PF4是血小板活化的重要指標(biāo) 。二者的檢測多采用 ELISA法。（2）臨床意義1）增高：反映血小板被激活及其釋放反應(yīng)亢進，見于血栓前狀態(tài)和（或）血栓性疾病 ，如心肌梗死、腦血管病變、尿毒癥、妊高征、糖尿病、腎病綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血、靜脈血栓形成等。2）減低：見于先天性或獲得性貯存池病（α顆粒缺陷癥）。（3）注意事項：注意避免血小板體外被活化，否則導(dǎo)致假陽性。另外，當(dāng)腎臟排泄功能異常、血小板破壞過多時，血漿β-TG和PF4也可增高，因此，在評價其臨床意義時應(yīng)除外影響因素。5.血漿血栓烷B2（thromboxaneB2，TXB2）測定（1）原理：將TXB2-牛血清白蛋白包被酶標(biāo)反應(yīng)板，加入受檢血漿或TXB2標(biāo)準(zhǔn)品和抗TXB2抗體。包被的TXB與受檢血漿中或標(biāo)準(zhǔn)品中TXB競爭性與抗TXB抗體結(jié)合，包被的TXB與抗體結(jié)合的量與受檢血漿中22222的含量呈負(fù)相關(guān)。TXB（2）臨床意義1）增高：見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病 ，如心肌梗死、心絞痛、糖尿病，動脈粥樣硬化、妊高征、深靜脈血栓形成、肺梗死、腎小球疾病、高脂血癥、大手術(shù)后等。2）減低：見于環(huán)氧酶或 TX合成酶缺乏癥、服用抑制環(huán)氧酶或 TX合成酶的藥物如阿司匹林 、苯磺唑酮、咪唑及其衍生物等。（3）注意事項：注意避免血小板體外被活化，否則導(dǎo)致假陽性 。6.血小板膜糖蛋白（ plateletmembraneglycoprotein ，GP）測定（1）原理：血小板膜糖蛋白分為 質(zhì)膜糖蛋白和顆粒膜糖蛋白，前者包括 GPⅠb-Ⅸ-V、GPⅡb-Ⅲa、GPⅠa-Ⅱa等，后者包括CD62P和CD63。CD62P又稱P-選擇素、GMP140，在未活化的血小板上，CD62P分子僅表達于顆粒膜上?；罨螅珻D62P分子在質(zhì)膜呈高表達。CD63在靜止血小板僅分布于溶酶體膜，血小板活化后隨脫顆粒而表達在血小板膜表面。 因此CD62P和CD63在質(zhì)膜上高表達被視為血小板活化的分子標(biāo)志物。目前多采用熒光素標(biāo)記的抗血小板 GP的特異性單克隆抗體作為探針，流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確測定血小板 GP。（2）臨床意義1）血小板功能缺陷：GPⅠb缺乏，見于巨大血小板綜合征； GPⅡb/Ⅲa缺乏，見于血小板無力癥；活化后 CD62P表達減低或缺乏，見于血小板貯存池缺陷病。2）血栓前或血栓性疾病： CD62P、CD63表達增加是血小板活化的特異性分子標(biāo)志物。 急性心肌梗死、心絞痛、急性腦梗死、 DM、高血壓、外周動脈血管病均可見血小板活化顯著增加。3）注意事項：分析血小板活化時，必須注意血液標(biāo)本采集與樣本處理過程中可能導(dǎo)致的體外激活，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。7.血塊收縮試驗（ clotretractiontest ，CRT）1）原理：在富含血小板血漿中加入Ca2＋和凝血酶，使血漿凝固形成凝塊，血小板收縮蛋白使血小板伸出偽足，偽足前端連接到纖維蛋白束上。當(dāng)偽足向心性收縮，使纖維蛋白網(wǎng)眼縮小，測定析出血清的體積可反映血小板血塊收縮能力。2）臨床意義1）減低：見于原發(fā)性血小板減少性紫癜、血小板增多癥、血小板無力癥、紅細(xì)胞增多癥、低（無）纖維蛋白原血癥、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥等。2）增高：見于先天性（遺傳性）因子ⅩⅢ缺乏癥等 。五、凝血因子的檢測1.血漿纖維蛋白原（ fibrinogen ，F(xiàn)IB）含量測定））））））））））））（1）原理：FIB檢測有凝血酶凝固法（ Clauss法）、比濁法（ PT衍生法）以及免疫學(xué)的方法等。①Clauss法：以凝血酶作用于待測血漿中的 FIB，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，血漿凝固。血漿中 FIB的含量與凝固時間呈負(fù)相關(guān)，檢測結(jié)果與參比血漿制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比可得出纖維蛋白原的含量。②PT衍生法：當(dāng) PT測定完成時，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，其形成的濁度與 FIB的含量成正比，因此無須另加任何試劑，即可由產(chǎn)生的濁度，用終點法或速率法算出 FIB含量。③免疫學(xué)方法：是利用抗 FIB多克隆抗體與 FIB特異性結(jié)合反應(yīng)進行測定。方法有免疫濁度、單向免疫擴散和 ELISA等。（2）臨床意義：增高見于糖尿病、急性心肌梗死、急性傳染病、結(jié)締組織病、急性腎炎、多發(fā)性骨髓瘤、休克、大手術(shù)后、妊高征、急性感染、惡性腫瘤和應(yīng)急狀態(tài)等。降低見于先天性低或無FIB血癥、遺傳性FIB異常、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝硬化等。（3）方法學(xué)評價： Clauss法和PT衍生法：測定的是纖維蛋白原的功能，由于 FIB的異質(zhì)性，當(dāng) FDP增高時，Clauss法測定結(jié)果會受到影響；免疫學(xué)方法測定的是纖維蛋白原的含量。血漿因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ的促凝活性測定1）原理：一期法是將待測血漿分別與乏FⅧ、FⅨ、FⅪ和FⅫ基質(zhì)血漿混合，進行APTT測定。將正常人混合血漿與乏因子血漿混合，測定APTT，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線中分別計算出受檢血漿中FⅧ：C、FⅨ：C、FⅪ：C和FⅫ：C相當(dāng)于正常人的百分率（ %）。（2）臨床意義1）增高：主要見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病 ，如靜脈血栓形成、 肺栓塞、妊娠高血壓疾病、晚期妊娠、口服避孕藥、腎病綜合征、惡性腫瘤等。2）減低：FⅧ：C減低見于血友病 A、血管性血友病、血中存在因子Ⅷ抗體、 DIC；FⅨ：C減低見于血友病 B、肝臟病、維生素 K缺乏癥、DIC、口服抗凝藥物 ；FⅪ：C減低見于因子Ⅺ缺乏癥、肝臟疾病、 DIC等；FⅫ：C減低見于先天性因子Ⅻ缺乏癥、肝臟疾病、 DIC和某些血栓性疾病等。（3）注意事項1）FⅧ：C：在嚴(yán)重肝實質(zhì)損傷時，F(xiàn)Ⅷ：C可明顯升高。FⅧ：C減低時，需與vWF含量同時測定，以篩選出vWF缺陷的可能。2）目前認(rèn)為，凝血因子促凝活性測定不必等待逐級篩選和糾正試驗的結(jié)果，可以在單純 APTT延長時檢測。3）受檢標(biāo)本檢測凝固時間不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可稀釋后檢測。血漿因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ的促凝活性測定（1）原理：將待測血漿分別與缺乏 FⅡ、FⅤ、FⅦ和FⅩ基質(zhì)血漿混合，進行 PT測定。將正常人混合血漿與乏因子血漿混合，測定 PT，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線中分別計算出受檢血漿中 FⅡ：C、FⅤ：C、FⅦ：C和FⅩ：C相當(dāng)于正常人的百分率（ %）。（2）臨床意義1）增高：見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病 。2）減低：見于維生素 K缺乏癥（FV除外）、肝臟疾病、 DIC、口服抗凝劑和血中存在相應(yīng)的抑制物 。先天性因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ缺乏癥較罕見。目前因子 FⅡ：C、FⅤ：C、FⅦ：C和FⅩ：C的測定主要用于肝臟受損的檢查，因子Ⅶ： C在肝臟早期可下降，因子Ⅴ的測定在肝損傷和肝移植中應(yīng)用較多。4.血漿因子ⅩⅢ定性試驗1）原理：在鈣離子作用下，因子ⅩⅢ能使溶解于尿素溶液的可溶性纖維蛋白單體聚合物變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白。因此，含因子ⅩⅢ的血漿鈣化凝固后不再溶于尿素溶液中，而缺乏ⅩⅢ的血漿則聚合物可溶于5mol/L尿素溶液中。））））））））））））（2）臨床意義：本試驗簡單、可靠，是十分有用的過篩試驗。在臨床上若發(fā)現(xiàn)傷口愈合緩慢、滲血不斷或懷疑有因子ⅩⅢ缺陷者，可首選本試驗。若纖維蛋白在 24h內(nèi)，尤其是 2h內(nèi)完全溶解，表示因子ⅩⅢ缺乏，見于先天性因子ⅩⅢ缺乏或獲得性因子ⅩⅢ缺乏，后者見于肝臟疾病、 SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡性淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性肝癌、 DIC及原發(fā)性纖溶等。5.血漿因子ⅩⅢ亞基抗原測定（1）原理：凝血因子ⅩⅢ由兩個亞基 α和β構(gòu)成。檢測方法為免疫火箭電泳法：在含有 FⅩⅢα亞基和β亞基抗血清的瓊脂凝膠板中，加入受檢血漿（抗原），在電場作用下，出現(xiàn)抗原 -抗體反應(yīng)形成的火箭樣沉淀峰，此峰的高度與受檢血漿中 FⅩⅢ亞基的濃度成正比。根據(jù)沉淀峰的高度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出 FⅩⅢα：Ag和FⅩⅢβ：Ag相當(dāng)于正常人的百分率（ %）。（2）臨床意義：同上。六、抗凝物質(zhì)測定1.抗凝血酶Ⅲ（ antithrombin Ⅲactivity ，AT-Ⅲ：A）測定（1）血漿抗凝血酶Ⅲ活性測定原理：發(fā)色底物法：受檢血漿中加入過量凝血酶，使 AT-Ⅲ與凝血酶形成 1:1復(fù)合物，剩余的凝血酶作用于發(fā)色底物 S-2238，釋出顯色基因?qū)ο趸桨罚?PNA），顯色的深淺與剩余凝血酶呈正相關(guān)，而與 AT-Ⅲ呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出 AT：A的含量。（2）血漿抗凝血酶Ⅲ抗原（ AT：Ag）檢測1）原理：免疫學(xué)方法如火箭電泳法、免疫酶標(biāo)及免疫比濁法。2）臨床意義①增高見于血友病、白血病和再生障礙性貧血等的急性出血期以及口服抗凝藥物治療過程中。②減低見于先天性和獲得性AT-Ⅲ缺乏癥，后者見于血栓前狀態(tài)、血栓性疾病和肝臟疾病、腎病綜合征等。3）注意事項：①標(biāo)本不能用肝素抗凝 。②AT-Ⅲ抗原和活性測定最好同時檢測，以利于進行先天性 AT-Ⅲ缺乏的分型。③在疑難 DIC診斷時，AT-Ⅲ水平下降具有診斷價值；急性白血病時 AT-Ⅲ水平降低更可看作是 DIC發(fā)生的信號；抗凝治療中，如懷疑肝素抵抗，可測定 AT-Ⅲ來確定；抗凝血酶代替治療時，也應(yīng)首選 AT-Ⅲ檢測來監(jiān)測。2.血漿蛋白 C（proteinC ，PC）測定（1）血漿蛋白 C活性測定原理：血漿蛋白 C活性（proteinCactigen,PC ：A）測定，發(fā)色底物法：受檢血漿中加入蛋白 C激活劑（從蛇毒中提取）。PC被激活為活化蛋白 C（APC），APC作用于發(fā)色底物，釋出顯色基團對硝基苯胺 （PNA），顯色的深淺與受檢血漿中 PC的含量成平行關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出 AT：A的含量。（2）血漿蛋白 C抗原測定1）原理：血漿蛋白 C抗原（proteinCantigen ，PC：Ag）檢測，免疫火箭電泳法2）臨床意義：減低：①見于先天性 PC缺陷：根據(jù) PC：A和PC：Ag可分為Ⅰ型（PC：Ag與PC：A均減低）和Ⅱ型（PC：Ag正常而PC：A減低）；②獲得性PC缺陷：DIC、肝功能不全、手術(shù)后、口服雙香豆素抗凝劑、呼吸窘迫綜合征等。血漿蛋白S測定（1）血漿總蛋白 S測定1）原理：血漿總蛋白 S（total protein S，TPS）包括游離 PS（FPS）和與補體 C4結(jié)合的PS（C4bp-PS）。由于二者對于抗人蛋白 S抗體有相似反應(yīng)，因此用免疫學(xué)方法（如火箭電泳、酶聯(lián)免疫法）檢測的是 TPS。2）臨床意義：減低見于先天性和獲得性 PS缺陷癥，后者見于肝臟疾病、口服抗凝藥物等。（2）血漿游離蛋白 S（freeproteinS ，F(xiàn)PS）測定））））））））））））1）原理：凝固法。受檢血漿中加入缺乏 PS基質(zhì)血漿（提供除 PS外的其他凝血因子）， PS可促進APC對因子Ⅴa的抑制作用，纖維蛋白形成所需的時間與受檢血漿中 FPS的量呈正相關(guān)。受檢者凝固時間可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出 FPS的含量。2）臨床意義：參見血漿總蛋白 S測定。七、病理性抗凝物檢測1.狼瘡抗凝物質(zhì)（ lupusanticoagulants ，LAC）測定（1）篩檢試驗1）原理：在腦磷脂和激活劑存在的條件下，檢測血漿凝固時間（即 APTT）。若被檢血漿中有狼瘡抗凝物質(zhì)存在，則血漿凝固時間（ APTT）延長。2）臨床意義：篩檢試驗的血漿凝固時間延長（篩檢試驗陽性）見于有狼瘡抗凝物質(zhì)存在的患者、先天性凝血因子缺乏、口服抗凝劑、肝素治療以及 DIC等。（2）確診試驗1）原理：篩檢是陽性的血漿，若屬于有狼瘡抗凝物質(zhì)存在者，則在加入血小板溶解物后，延長的 APTT被糾正。2）結(jié)果判斷：篩選試驗測定值 /確診試驗測定值＝ 0.8～1.2。若篩查試驗和確診試驗的凝固時間都延長，且比值在正常范圍內(nèi)，提示被檢血漿中無狼瘡抗凝物存在，可能有其他異?？鼓锎嬖?；若篩查試驗的凝固時間延長，而確診試驗的凝固時間縮短（被糾正），提示有狼瘡抗凝物存在。3）臨床意義：狼瘡抗凝物質(zhì)存在見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（ SLE）、自發(fā)性流產(chǎn)、多發(fā)性血栓形成和血小板減少癥等。4）臨床評價：LAC的檢測也可利用改良的 Russell 蛇毒稀釋試驗進行檢測，該試驗不受 FⅫ及FⅦ異常的影響，受檢血漿中肝素含量＜ 1.0U/ml 對結(jié)果也無影響。2.凝血因子Ⅷ抑制物檢測（1）原理：將受檢血漿與正常人新鮮血漿等量混合，在 37℃中放置一定時間，按一期法測定混合血漿中的FⅧ活性，同時與正常血漿中的 FⅧ活性比較。若受檢血漿中存在因子Ⅷ抗體，則正常人血漿的 FⅧ活性被抑制或被中和。以 Bethesda單位來計算抑制物的含量，能抑制正常人 FⅧ活性50%的因子抗體定為 1個Bethesda單位。抑制正常人血漿 FⅧ活性50%的受檢血漿最高稀釋倍數(shù)為 FⅧ抗體的單位數(shù)。（2）參考范圍：正常人無 FⅧ抑制物。（3）臨床意義：陽性見于反復(fù)輸血、接受抗血友病球蛋白治療的血友病 A患者、SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、妊娠、惡性腫瘤、 DM、結(jié)節(jié)病等。（4）臨床評價： Bethesda法還可用于其他因子如 FⅨ、FⅩ、FⅪ等抑制物的評價。本法對同種免疫引起的因子抑制物測定較為敏感，對自身免疫、藥物免疫、腫瘤免疫和自發(fā)性凝血因子抑制物則不敏感。 FⅧ抑制物的確定最終還需進行 LAC檢測以進行排除。血漿游離肝素時間（甲苯胺藍(lán)糾正試驗）（1）原理1）甲苯胺藍(lán)糾正試驗：如果待測血漿的凝血酶時間（ TT）延長，加入一定量甲苯胺藍(lán)后， TT明顯縮短或恢復(fù)正常，提示血漿中肝素或類肝素物質(zhì)增多。2）血漿肝素定量：在待測血漿中加入過量的抗凝血酶（ AT）和FⅩa，普通肝素又稱未分級肝素（ UFH）和低分子量肝素（ LMWH）均可與 AT形成復(fù)合物并滅活 FⅩa，剩余的 FⅩa水解發(fā)色底物（ S-2765），釋放出黃色對硝基苯胺，顏色的深淺與血漿中 UFH或LMWH濃度呈負(fù)相關(guān)。（2）臨床意義：血液中肝素增多主要見于普通肝素抗凝治療及體外循環(huán)、血液透析等。血漿中肝素濃度是監(jiān)測普通肝素用量的最好方法，肝素濃度一般維持在 0.2～0.4U/ml 時，可取得較好的療效。肝素樣抗凝物增多見于嚴(yán)重肝病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、流行性出血熱、過敏性休克等。（3）結(jié)果判讀：加入甲苯胺藍(lán)后，比未加前 TT縮短5s以上，提示肝素或類肝素物質(zhì)增多，血漿肝素））））））））））））濃度0.001～0.009U/ml。（4）臨床評價：如果將已知不同濃度的肝素加入正常血漿中， 測定其相應(yīng)的 TT，可以制作肝素濃度 -TT標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測定待測血漿中肝素濃度。由于不同種類 UFH或LMWH有其自身的特異性抗 FⅩa活性，當(dāng)用于治療劑量監(jiān)測時，實驗中所用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與臨床使用的相同。八、纖溶活性測定凝血酶時間（thrombintime，TT）及甲苯胺藍(lán)糾正試驗（1）原理：受檢血漿中加入“標(biāo)準(zhǔn)化”凝血酶溶液，測定開始出現(xiàn)纖維蛋白絲所需的時間。糾正試驗：甲苯胺藍(lán)可糾正肝素的抗凝作用，在 TT延長的血漿中加入少量的甲苯胺藍(lán)，若延長的 TT明顯恢復(fù)正常和縮短，表示受檢血漿中肝素或類肝素樣物質(zhì)增多，否則為其他類抗凝物或是纖維蛋白原異常。（2）參考值：TT：16～18秒；加入甲苯胺藍(lán)后， TT縮短5秒以上，提示血漿中肝素或類肝素樣物質(zhì)增多。（3）臨床意義：受檢 TT值延長超過正常對照 3秒為延長，見于低（無）纖維蛋白原血癥；血中 FDP增高（DIC）；血中有肝素和類肝素物質(zhì)存在（如肝素治療中、 SLE和肝臟疾病等）。2.血漿纖溶酶原測定（1）血漿纖溶酶原活性（ plasminogenactivity ，PLG：A）測定1）原理：發(fā)色底物法，受檢血漿中加鏈激酶（ SK）和發(fā)色底物（ S-2251），受檢血漿中的 PLG在SK的作用下，轉(zhuǎn)變成 PL，后者作用于發(fā)色底物，釋出對硝基苯胺（ PNA）而顯色。顯色的深淺與纖溶酶的水平呈正相關(guān)，通過計算求得血漿中 PLG：A的含量。2）臨床意義：增高表示纖溶活性減低，見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。減低表示纖溶活性增高，見于+原發(fā)性纖溶、繼發(fā)性纖溶和先天性 PLG缺乏癥。PLG缺陷癥：可分為 CRM型（PLG：Ag或PLG：A減低）和CRM型-（PLG：Ag和PLG：A均減低）。此外，前置胎盤、腫瘤擴散、大手術(shù)后、肝硬化、重癥肝炎、門脈高壓、肝切除等獲得性PLG缺陷癥，也存在PLG減低。2）血漿纖溶酶原抗原（plasminogenantigen，PLG：Ag）測定1）原理：ELISA法，將純化的兔抗人纖溶酶原抗體包被在酶標(biāo)反應(yīng)板上，加入受檢血漿，血漿中的纖溶酶原與包被在反應(yīng)板上的抗體結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記的兔抗人纖溶酶原抗體，酶標(biāo)記的抗體與結(jié)合在反應(yīng)板上的纖溶酶原結(jié)合，最后加入底物顯色，顯色的深淺與受檢血漿中纖溶酶原的含量呈正相關(guān)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出血漿中纖溶酶原的含量。2）臨床意義：見 PLG：A測定。血漿組織纖溶酶原活化劑測定（1）血漿組織纖溶酶原活化劑活性（ tissueplasminogenactivatoractivity ，t-PA：A）測定1）原理：發(fā)色底物法。血漿優(yōu)球蛋白部分含有 t-PA及全部凝血因子，但不含 PAI。受檢血漿加入過量PLG和纖維蛋白的共價物， 血漿中的 t-PA吸附于纖維蛋白上， 并使PLG轉(zhuǎn)變成PL，PL使發(fā)色底物（S-2251）釋出PNA而顯色，顯色的深淺與受檢血漿中 t-PA的含量呈正相關(guān)。所測得的 A值，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出受檢血漿中 t-PA:A 的含量。2）臨床意義：①增高：表明纖溶活性亢進，見于原發(fā)性纖溶癥、繼發(fā)性纖溶癥如 DIC等。②減低：表明纖溶活性減弱，見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，如動脈血栓形成、深靜脈血栓形成、高脂血癥、口服避孕藥、缺血性中風(fēng)等。（2）血漿組織纖溶酶原活化劑抗原（ tissueplasminogenactivatorantigen ，t-PA：Ag）測定1）原理：ELISA法。將純化的抗 t-PA單克隆抗體包被在酶標(biāo)反應(yīng)板上， 加入受檢血漿，血漿中的 t-PA與包被在反應(yīng)板上的抗體結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記的 t-PA抗體，酶標(biāo)記的抗體與結(jié)合在反應(yīng)板上的 t-PA結(jié)合，最后加入底物顯色， 顯色的深淺與受檢血漿中 t-PA的含量呈正相關(guān)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出血漿中 t-PA的含量。2）臨床意義：同 t-PA：A檢測。））））））））））））4.血漿纖溶酶原活化抑制物測定（1）原理：血漿纖溶酶原活化抑制物活性（plasminogenantigeninhibitoractivity，PAI：A）檢測，發(fā)色底物法。（2）臨床意義：增高見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。減低見于原發(fā)性和繼發(fā)性纖溶癥。根據(jù)PAI：A和PAI：Ag的檢測結(jié)果，可將PAI-1缺陷分為＋-CRM型和CRM型。5.血漿α2纖溶酶抑制物測定（1）原理：血漿α2纖溶酶抑制物活性（α2plasmininhibitoractivity，α2PI：A）檢測，發(fā)色底物法。（2）臨床意義：增高見于靜脈和動脈血栓形成、惡性腫瘤、分娩后等。減低見于肝病、DIC、手術(shù)后、先天性α2PI缺乏癥。根據(jù)α2PI：A和α2PI：Ag檢測的結(jié)果，可將α2PI缺陷分為+-CRM型和CRM型。6.血漿魚精蛋白副凝固（plasmaprotamineparacoagulationtest，3P）試驗（1）原理：受檢血漿中加入硫酸魚精蛋白溶液，如果血漿中存在可溶性纖維蛋白單體-纖維蛋白降解產(chǎn)物復(fù)合物，則魚精蛋白使其解離釋出纖維蛋白單體。纖維蛋白單體自行聚合成肉眼可見的纖維狀物，此為陽性反應(yīng)結(jié)果。2）結(jié)果判斷：正常人為陰性。3）臨床意義：陽性見于DIC的早、中期，但在惡性腫瘤、上消化道出血、外科大手術(shù)后、敗血癥、腎小球疾病、人工流產(chǎn)、分娩等也可出現(xiàn)假陽性。 陰性見于正常人、晚期 DIC和原發(fā)性纖溶癥。7.血清纖維蛋白降解產(chǎn)物 [fibrin （ogen）degradationproducts ，F(xiàn)DP]測定（1）原理：膠乳凝集法，于被檢血清中加入 FDP抗體包被的膠乳顆粒懸液，當(dāng)血清中 FDP的濃度等于或超過5μg/ml，便與膠乳顆粒上的抗體結(jié)合，則膠乳顆粒發(fā)生凝集。根據(jù)被檢血清的稀釋度可計算出血清FDP的含量。2）臨床意義：血清FDP增高見于原發(fā)性纖溶癥、DIC、惡性腫瘤、急性早幼粒細(xì)胞白血病、肺栓塞、深靜脈血栓形成、腎臟疾病、肝臟疾病、器官移植的排斥反應(yīng)、溶栓治療等。8.血漿D-二聚體（D-dimer，D-D）測定（1）原理：膠乳凝集法，被檢血漿中加入標(biāo)記 D-二聚體單抗的膠乳顆粒懸液，如果 血漿中D-二聚體含量大于0.5mg/L時，便與膠乳顆粒上的抗體結(jié)合，膠乳顆粒則發(fā)生凝集。根據(jù)被檢血漿的稀釋度可計算出血漿D-二聚體的含量。（2）臨床意義：在DIC時，為陽性或增高，是診斷 DIC的重要依據(jù)。高凝狀態(tài)和血栓性疾病時，血漿D-二聚體含量也增高。D-二聚體在繼發(fā)性纖溶癥為陽性或增高，而原發(fā)性纖溶癥為陰性或不升高，此是兩者鑒別的重要指標(biāo)。九、血液流變學(xué)檢測全血黏度血漿黏度1）原理：毛細(xì)管黏度計法。通過一定體積的受檢血漿流經(jīng)一定直徑和一定長度的毛細(xì)管所需的時間與該管兩端壓力差計算出血漿黏度值。2）參考范圍：（1.64±0.05）mPa·S3）臨床意義：增高見于血漿球蛋白和血脂增高的疾病，如多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性