基因工程考試試卷試題

—名詞講解

基因工程

精選文檔1、限制與修飾系統(tǒng)：限制酶的生物學(xué)功能一般被以為是用來(lái)保護(hù)宿主細(xì)胞不受外源 DNA的感染，可講解外來(lái) DNA，進(jìn)而阻擋其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。一般來(lái)說(shuō)，與限制酶相伴而生的修飾酶是甲基轉(zhuǎn)移酶，或許說(shuō)是甲基化酶，能保護(hù)DNA不被講解。限制酶和甲基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成限制與修飾系統(tǒng)。2、各樣限制與修飾系統(tǒng)的比較區(qū)分位點(diǎn)切割位點(diǎn)簡(jiǎn)答

Ⅱ型4~6bp，大多為回文序列在區(qū)分位點(diǎn)中或湊近區(qū)分位點(diǎn)

Ⅰ型二分非對(duì)稱100bp

Ⅲ型5~7bp非對(duì)稱區(qū)分位點(diǎn)下游24~26bpStaractivity

？簡(jiǎn)述Staractivity

的影響要素及戰(zhàn)勝方法？答：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與區(qū)分序列相像的序列，這個(gè)轉(zhuǎn)變的特色稱為星星活性。惹起星星活性的的要素： ①高甘油濃度〔>5%〕；②酶過(guò)度〔>100U/μl〕；③低離子強(qiáng)度〔<25mmol/L〕；④高pH(>8.0) ；⑤有機(jī)溶劑如DMSO〔二甲基亞砜〕離子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+ 取代Mg2+。星星活性的抑制舉措：①削減酶的用量，防止過(guò)度酶切，削減甘油濃度；②保證反響系統(tǒng)中無(wú)有機(jī)溶劑或乙100～150mM〔在不抑制酶活性的前提下〕pH7.0Mg2+作為二價(jià)陽(yáng)離子。試答復(fù)影響限制性內(nèi)切核酸酶切割效率的要素？

〔影響酶活性的要素？〕答：外因：反響條件、底物純度〔能否有雜質(zhì)、能否有鹽離子和苯酚的污染〕的選擇、反響時(shí)間的長(zhǎng)短內(nèi)因：星星活性、底物甲基化、底物的構(gòu)象3DNA尾端長(zhǎng)度對(duì)酶切割的影響

、何時(shí)加酶、操作能否適合，反響系統(tǒng)答：限制酶切割DNA時(shí)，對(duì)區(qū)分序列兩頭的非區(qū)分序列有長(zhǎng)度要求，也就是說(shuō)在區(qū)分序列兩頭肯定要有必定數(shù)目的核苷酸，不然限制酶將難以發(fā)揮切割活性。在設(shè)計(jì) PCR引物時(shí)，假設(shè)要在尾端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順當(dāng)切割擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物尾端加上能夠知足要求的堿基數(shù)目。一般需加4、何為載體？一個(gè)抱負(fù)的載體應(yīng)具備那些特色？

3～4個(gè)堿基對(duì)。DNA或目的基因攜帶入宿主細(xì)胞的工具稱為載體。載體應(yīng)具備：①在宿主細(xì)胞內(nèi)肯定能夠自主復(fù)制〔具備復(fù)制原點(diǎn)〕；②肯定具備適合的酶切位點(diǎn)，供外源選擇；④其余：有必定的拷貝數(shù)，便于制備。

DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制；③有必定的選擇標(biāo)志，用于5抗性基因〔Resistant gene〕是當(dāng)前使用的最廣泛的選擇標(biāo)志，

常用的抗生素抗性有哪幾種？并舉兩例說(shuō)明其原理？答：氨芐青霉素抗性基因〔ampr〕、四環(huán)素抗性基因〔tetr〕、氯霉素抗性基因〔Cmr〕、卡那霉素和霉素抗性基因〔kanr,neor〕以及琥珀突變抑制基因 supF 。⑴青霉素抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成

，與相關(guān)的酶聯(lián)合，抑制轉(zhuǎn)肽反響并抑制其活性。氨芐青霉素抗性

Ampr編碼一個(gè)酶，可分泌進(jìn)入細(xì)胞的周質(zhì)區(qū)，并催化

β-內(nèi)酰胺環(huán)水解，進(jìn)而排解氨芐青霉素的毒性。30STetr399個(gè)氨基酸構(gòu)成的膜聯(lián)合蛋白，可阻擋四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。6.何為α-互補(bǔ)？怎樣利用α-DNA的重組質(zhì)粒？答：α-互補(bǔ)指lacZ 基因上缺失近操控基因區(qū)段的突變體與帶有完好的近操控基因區(qū)段的

β-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。

α-互補(bǔ)是鑒于在兩個(gè)不一樣的缺點(diǎn)

β－半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而成立的。實(shí)現(xiàn)

α-互補(bǔ)主要有兩局部構(gòu)成：

LacZ△M15，放在F 質(zhì)粒或染色體上，隨宿主傳代； LacZ”

，放在載體上，作為選擇標(biāo)志，LacZ”

中插入一個(gè)片斷后，將不行防止地以致產(chǎn)生無(wú)

α-互補(bǔ)力量的β－半乳糖苷酶片斷。在引誘物

IPTG 和X-gal〔同時(shí)可作為生色劑〕的作用下，含重組質(zhì)粒的菌落不行以產(chǎn)生有活性的gal ，表達(dá)白色，而含非重組質(zhì)粒的菌落則表達(dá)蘭色。以此到達(dá)選擇的目的。

β－半乳糖苷酶，不行以分解 X-1/6.2/6精選文檔7、試簡(jiǎn)述λ噬菌體的裂解生長(zhǎng)狀態(tài) Lyticgrowth 和溶原狀態(tài)Lysogenicstate 兩種循環(huán)的分化及其調(diào)理過(guò)程？答：裂解生長(zhǎng)狀態(tài)是λλ菌

溶原狀態(tài)為λ體基因組DNA經(jīng)過(guò)位點(diǎn)專一性重組整合到宿主染色體

DNA中隨宿主的生殖傳到子代細(xì)胞。調(diào)理過(guò)程：

由感染復(fù)數(shù)和細(xì)胞的養(yǎng)分狀態(tài)打算的，感染復(fù)數(shù)越高，養(yǎng)分狀態(tài)越差，則溶源化的頻次就越高。溶源現(xiàn)象的生化媒介可能是3”--5”cAMP ，它在細(xì)胞內(nèi)的濃度會(huì)隨養(yǎng)分條件的變化而轉(zhuǎn)變，當(dāng)細(xì)胞在富養(yǎng)分培育基中生長(zhǎng)時(shí)，有益于裂解生長(zhǎng)；在缺乏cAMP的突變細(xì)胞中，更有益于裂解生長(zhǎng)此外一個(gè)重要的調(diào)理要素是噬菌體的

cAMP的濃度較低，CDNACⅡ蛋白促使溶CCCintDNA與染色體整合，朝著溶源態(tài)生長(zhǎng)。9cDNA文庫(kù)的建立：將來(lái)自真核生物的⑴細(xì)胞總RNAmRNA的分別

mRNA體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與載體連結(jié)并轉(zhuǎn)變大腸桿菌的過(guò)程。⑵第一鏈合成：由

mRNAcDNA的過(guò)程為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化。⑶其次鏈合成：①自己引物合成法 ②置換合成法 ③指引合成法 ④引物—連接頭合成法⑷雙鏈cDNA里連結(jié)到質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入大腸桿菌中生殖10、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)答：文庫(kù)質(zhì)量是由文庫(kù)所含克隆的數(shù)目、均勻插入片段的長(zhǎng)度、插入效率、基因組掩蓋度和掩蓋倍數(shù)等要素打算。克隆數(shù)越多、均勻插入片段的長(zhǎng)度越長(zhǎng)、插入效率和基因組掩蓋度越高，文庫(kù)質(zhì)量越好。克隆數(shù)目能夠經(jīng)過(guò)屢次轉(zhuǎn)變累46倍掩蓋率。11、基因掩蓋倍數(shù)的估量方法答：有兩種，一：用公式計(jì)算 基因組掩蓋倍數(shù)=均勻插入片段的長(zhǎng)度ⅹ克隆數(shù) /基因組DNA長(zhǎng)度二：聯(lián)合基因掩蓋度檢測(cè)來(lái)估量。 基因組掩蓋度是指問(wèn)苦處克隆掩蓋基因組的范圍。即選擇必定數(shù)目的單拷貝基因作探針來(lái)選擇文庫(kù)。每個(gè)探針選擇的克隆數(shù)目，即為該基因位點(diǎn)的掩蓋倍數(shù)。12、講解并計(jì)算N=ln(1-P)/ln(1-f)式中N：代表一個(gè)基因組文庫(kù)所包括重組克隆個(gè)數(shù)f ：表示重組克隆均勻插入片段的長(zhǎng)度和基因組

P：代表所期望的目的基因在文庫(kù)中消滅的概率DNA長(zhǎng)度的比值計(jì)算：大腸桿菌基因組大小約

4.6mbP=99%，均勻插入片段大小為

20kb，f=20kb/4600kb,則N=1057.20kb的大腸桿菌基因組文庫(kù)中選擇到隨便一個(gè)感興趣的基因的概率達(dá)99%，該基因文庫(kù)起碼應(yīng)包括1057個(gè)重組克隆。選擇適合的載系統(tǒng)統(tǒng)和挑去必定的陽(yáng)性克隆是建立基因組文庫(kù)時(shí)第一考慮的問(wèn)題。1cDNA文庫(kù)的均一化辦理

闡述題兩條門路：基因組DNA飽和雜交法和基因組DNA飽和雜交法⑴基因組DNA飽和雜交法原理：利用不一樣表達(dá)水平的基因?qū)?yīng)的基因組拷貝數(shù)相對(duì)全都的特色，能夠?qū)?/p>

cDNA文庫(kù)進(jìn)展均一化辦理步驟①將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化固定，消化后的基因組DNA扁形為相對(duì)較短的單鏈且最大可能的掩蓋基因組。②分別純化獨(dú)立cDNA文庫(kù)的混淆質(zhì)粒③文庫(kù)cDNA與固定的基因組DNA充分飽和雜交，固定住相應(yīng)的特長(zhǎng)：應(yīng)用簡(jiǎn)潔、沒(méi)有一儀器上的限制

cDNA，并將它洗脫從頭轉(zhuǎn)變受體菌。弊端：由于基因組DNA相對(duì)很簡(jiǎn)單，很難獵取掩蓋基因組的單鏈 DNA片段，以致基因丟掉；在基因組DNA與文庫(kù)DNA雜交的過(guò)程中，文庫(kù)DNA自己雜交的速度會(huì)很快，以致基因丟掉。⑵基因組DNA飽和雜交法DNA在加熱變后再?gòu)?fù)性形成雙鏈

DNA的速度依據(jù)二次復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理。即與組分中的單鏈 DNA濃度相關(guān)，

cDNA文庫(kù)中高豐度的cDNA復(fù)性所需要的時(shí)間短，低豐度的

cDNA復(fù)性所需的時(shí).3/6間長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)對(duì)復(fù)性時(shí)間的掌握，能夠使高豐度的

精選文檔cDNA復(fù)性成雙鏈狀態(tài)，低豐度的 cDNA保持單鏈狀態(tài)。利用羥

cDNA分開(kāi)，再用獵取的單鏈 cDNA轉(zhuǎn)變宿主細(xì)菌，即可獵取均一化

cDNA文庫(kù)。特長(zhǎng)：幾乎不會(huì)以致文庫(kù)中 cDNA的丟掉；均一化成效明顯弊端：基因組DNA飽和雜交法成功率高，而基因組 DNA飽和雜交法在參數(shù)掌握上存在著比很多的要素。2、扣除雜交cDNA文庫(kù)原理：利用分子雜交原理，去除非差異表達(dá)基因的

cDNA，保存差異表達(dá)的基因的

cDNA用于制備文庫(kù)。待測(cè)樣本tester:

待測(cè)樣本的總cDNAdriver:

表達(dá)譜背景全都但不含目的基因的總

cDNA。tester 與過(guò)度的driver

雜交，用特定方法將兩者共同表達(dá)的

cDNA去除。如：抑制性扣除雜交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)原理：含目的基因的cDNA稱為供體tester ，不含目的基因的cDNA稱為驅(qū)動(dòng)driver 。它們是由對(duì)應(yīng)的mDNA組分在體外獨(dú)立反轉(zhuǎn)錄成的。同時(shí)利用區(qū)分4個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶為二，分別接上二種不一樣的接頭。

RsaΙcDNA消化成平尾端小片段。將供體一分第一輪雜交：過(guò)度的驅(qū)動(dòng)cDNA分別與帶有2中不一樣接頭的供體cDNA雜交，在2個(gè)獨(dú)立的雜交系統(tǒng)中，供體與驅(qū)動(dòng)cDNA4種種類的cDNAa、供體中既沒(méi)有與供體雜交，也沒(méi)有與驅(qū)動(dòng)雜交的b、供體中自己雜交的 cDNA分子。c、供體與驅(qū)動(dòng)中共同表達(dá)的基因雜交形成的雙鏈d、驅(qū)動(dòng)中自己雜交和不行以自己或與供體雜交的

cDNA分子。分子。cDNA分子。其次輪雜交：將第一輪雜交的兩個(gè)系統(tǒng)混淆，再參加過(guò)度的驅(qū)動(dòng) cDNA，進(jìn)入其次輪雜交。雜交結(jié)果進(jìn)一步形成了 a、b、c、d。也形成了e〔帶不一樣接頭a形成的〕。將其次輪雜交的產(chǎn)物進(jìn)展尾端補(bǔ)齊，再進(jìn)展兩輪 PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過(guò)程中，由于a、d兩頭沒(méi)有引物聯(lián)合位點(diǎn)而不行以再擴(kuò)增。b兩頭帶有同樣的接頭序列，形成蝸柄構(gòu)造，不行以進(jìn)展指數(shù)擴(kuò)增。c 只有一個(gè)引物接頭，只好被線性擴(kuò)增。只有 e是均一化的，差異表達(dá)的基因。用巢式引物進(jìn)展其次輪建扣除雜交cDNA文庫(kù)

PCR，降低PCA產(chǎn)物的背景，富集差異的基因。最終將

PCR產(chǎn)物用T/A克隆載體進(jìn)展克隆構(gòu)3、煙草酸性焦磷酸酶法建立全長(zhǎng)原理：煙草酸性焦磷酸酶〔

cDNA文庫(kù)TAP〕，能特異性地區(qū)分真核生物mRNA的5’端帽子構(gòu)造并將其去除。暴露出切口 5’端的磷酸基團(tuán)，可在該切口處連結(jié)一段特異的接頭來(lái)指引

cDNA其次鏈的合成。①在反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈前對(duì)

mRNA進(jìn)展去磷酸化辦理，使不完好的

mRNA5’磷酸基團(tuán)被去掉。②在反響中參加

TAP，特地的去掉完好mRNA5’尾端的帽子構(gòu)造，暴露出

5’磷酸基團(tuán)。T4RNA連結(jié)酶的作用下，能夠在

5’端連結(jié)上一段特異的

RNA接頭，不完好的mRNA分子中，由于缺乏磷酸基團(tuán)而不行以接上接頭。所以，只有增加了接頭的全長(zhǎng)合成的cDNA都是全長(zhǎng)的cDNA。

mRNA分子才能在接頭指引下合成其次鏈

cDNA。理論上講，用此法4、酵母雙雜交系統(tǒng) 〔繪圖〕P207簡(jiǎn)稱雙雜交系統(tǒng)〔two-hybriclsystem〕也叫相互作用圈套〔interactiontrap〕是依據(jù)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特色，創(chuàng)立的一種體內(nèi)判定基因的方法。其選擇的基因不是“探針”的直接編碼產(chǎn)物，而是能夠與其相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因，即選擇與始終基因產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白的編碼基因。很多真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子有兩個(gè)功能地區(qū)，一是DNA聯(lián)合構(gòu)造域〔DNAbindingdomain,BD〕，DNA序列的特定位點(diǎn)即上游激活序列聯(lián)合；二是轉(zhuǎn)錄激活構(gòu)造域〔

activationdomain,AD 〕,關(guān)心RNA聚合酶‖復(fù)合體激活上游激活序列下游基因的轉(zhuǎn)錄。將 X與BD交融，蛋白Y與AD交融，將它們導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)，假設(shè) X和Y相互作用，則會(huì)以致BDAD在空間上湊近，形成一個(gè)有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。.4/65、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法〔繪圖〕

精選文檔原理：根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個(gè)大的致瘤質(zhì)?！?tumorinducingplasmid 〕,簡(jiǎn)稱Ti 質(zhì)粒，當(dāng)根癌農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，TiT-DNADNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞并插入基因組中，T-DNA中的基因利用植物的酶系統(tǒng)進(jìn)展轉(zhuǎn)錄和翻譯，其表達(dá)產(chǎn)物可引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的基因構(gòu)造主要分為〔virulenceregion

區(qū)〔transferredDNAregion〕、

〕、Vir 區(qū)Con區(qū)〔regionencodingconjugation 〕和Ori區(qū)〔originofreplication 〕4個(gè)區(qū)段。T-DNA區(qū)稱為轉(zhuǎn)移DNA區(qū)。即根癌農(nóng)桿菌侵染植物時(shí)轉(zhuǎn)移到植物基因族中的一段

DNA序列，該序列上的基因與腫瘤的形成相關(guān)。 Vir 區(qū)與T-DNA區(qū)相鄰，該基因可激活

T-DNA的專一，使植物致瘤，故稱毒性區(qū)。Con 區(qū)段上存在與細(xì)菌聯(lián)合轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)移，故稱為過(guò)程：①農(nóng)桿菌對(duì)受體的區(qū)分②農(nóng)桿菌附著到受體細(xì)胞③引誘和啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)

聯(lián)合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。Ori區(qū)主要調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之

為復(fù)制開(kāi)端區(qū)。④近似聯(lián)合孔復(fù)合物的合成和裝置T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)6、一元載體的建立的基根源理Ti質(zhì)粒上T-DNA中的致瘤基因全部去掉，使其喪失對(duì)植物的致瘤性

。僅保存其雙側(cè)界限與 T-DNA正確轉(zhuǎn)移所必25個(gè)堿基序列，故這類載體又稱

②由于根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒比較大，難以進(jìn)展體外遺傳操作 ，需要引入一個(gè)較小的中間載體，將欲轉(zhuǎn)變的目的基因建立于中間載體上。③在卸甲載體T-DNA區(qū)中刪除致癌基因的位點(diǎn)插入一段與中間載體同源的質(zhì)粒序列。④將中間載體轉(zhuǎn)移到含有卸甲載體的根癌農(nóng)桿菌中。

由于卸甲載體的 T-DNA與中間載體擁有同源序列，故可在根癌農(nóng)桿菌中發(fā)生同源重組。

將中間載體整合到卸甲載體的

T-DNA區(qū)，并與卸甲質(zhì)粒一同復(fù)制。⑤為發(fā)生整合的中間載體因其沒(méi)有在根瘤農(nóng)桿菌中的復(fù)制元件，會(huì)自行消逝。⑥依據(jù)中間載體上所攜帶的抗性基因進(jìn)展抗性選擇，即可。7、二元載體的建立的基根源理原理：關(guān)于一元載體來(lái)說(shuō)，由于其 T-DNA與Vir區(qū)是在同一載體上，

故又稱順式載體。而事實(shí)上，T-DNA與Vir 區(qū)完好沒(méi)有必需必定要建立到同一載體。當(dāng)它們處于不一樣載體上時(shí)，

Vir 區(qū)經(jīng)過(guò)反式作用照舊能夠使

T-DNA發(fā)生轉(zhuǎn)移。

Ti質(zhì)粒，一個(gè)稱為微型

Ti質(zhì)粒，一個(gè)稱為關(guān)心

Ti質(zhì)粒。此中微型Ti 質(zhì)粒缺失了Vir 區(qū)，其T-DNA也進(jìn)展了卸甲辦理，同時(shí)引入多個(gè)酶切位點(diǎn)，便利外源基因的插入，其余，擁有 廣譜的復(fù)制原件，可同時(shí)在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中生計(jì)。經(jīng)過(guò)改造的微型

Ti質(zhì)粒相當(dāng)小，可像一般質(zhì)粒同樣進(jìn)展遺傳操作。關(guān)心Ti質(zhì)粒相對(duì)較大，只去除了 T-DNA，可激活微型Ti質(zhì)粒上的T-DNA發(fā)生轉(zhuǎn)移。

T-DNA中含有中間載體，它們會(huì)伴同外源目的基因一同被轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)，而二元載體的不會(huì)帶入大批無(wú)用的冗長(zhǎng)

DNA序列。所以外源基因的轉(zhuǎn)變效率高于一元載體 。8、Sanger 雙脫氧鏈停頓法〔繪圖〕 P158雙脫氧鏈停頓測(cè)序法使用雙脫氧核苷酸，它與脫氧核苷酸的主要不一樣在于：雙脫氧核苷酸分子中脫氧核糖的置的羥基〔—OH〕缺失。擴(kuò)增時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，其5’地點(diǎn)的磷酸基團(tuán)與上位脫氧核苷酸的

3’位3’地點(diǎn)的羥基聯(lián)合，可是，由于其自己

3’地點(diǎn)的羥基缺失，以致下位的

5’地點(diǎn)的磷酸基沒(méi)法與之聯(lián)合。即，雙脫氧核苷酸整合到正在合成的

DNA鏈中，該DNA的合成就到此停頓。9、載體的分類按功能分：克隆載體：〔主要用于擴(kuò)增或保存 DNA片段，是最簡(jiǎn)潔的載體。擁有強(qiáng)盛的包裝力量〕表達(dá)載體：〔帶有目標(biāo)細(xì)胞識(shí)其余啟動(dòng)子〕其余載體：〔整合載體、穿越載體等〕.5/6按根源分：質(zhì)?！布?xì)菌等原核生物染