第五章體外技術(shù)

第五章體外分析技術(shù)體外分析技術(shù)主要是利用放射分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)在體外進(jìn)行肌體內(nèi)物質(zhì)種類和含量的分析測(cè)定。體外分析技術(shù)的典型代表——放射免疫分析（RIA）競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析法：非競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析法：標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原對(duì)抗體都有相同的結(jié)合能力，但是當(dāng)抗體的量有限時(shí)，這種結(jié)合就出現(xiàn)相互競(jìng)爭(zhēng)，彼此抑制。用標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的抗體，待測(cè)抗原同放射標(biāo)記抗體進(jìn)行全量反應(yīng)。RIA特點(diǎn)：靈敏度高(可測(cè)水平達(dá)10-12—10-15g)特異性強(qiáng)操作簡(jiǎn)便，成本低應(yīng)用廣泛目前可用RIA測(cè)定的微量物質(zhì)：激素、蛋白質(zhì)、環(huán)磷酸腺苷、抗原、抗體、維生素、藥物等300多種第一節(jié)放射免疫分析(RIA)放射性標(biāo)記的抗原和非標(biāo)記抗原(標(biāo)準(zhǔn)抗原或被測(cè)抗原)同時(shí)與限量的特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)，這種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系可用以下反應(yīng)來表示：*Ag：標(biāo)記抗原Ag：非標(biāo)記抗原Ab：特異性抗體*Ag-Ab：標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物Ag-Ab：非標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物一、基本原理：*Ag與Ag的免疫活性完全相同，對(duì)Ab具有同樣的親和力；當(dāng)*Ag和Ab為恒定量，Ag和*Ag的總量大于Ab上的有效結(jié)合點(diǎn)時(shí)，*Ag-Ab的形成是隨著Ag量的增加而減少，剩下來的未結(jié)合或游離的*Ag則隨著Ag量的增加而增加；測(cè)定*Ag-Ab或*Ag即可推出被測(cè)的Ag量。放射免疫分析原理示意圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線：

配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，分別向其中加入固定量的標(biāo)記抗原和抗體，反應(yīng)平衡后，分離抗原的結(jié)合部分和游離部分，測(cè)定*Ag-Ab的放射性B或游離*Ag的放射性F，計(jì)算出結(jié)合率B%［B/(B+F)×100%］或其他指標(biāo)。以B%或B/B0%為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫座標(biāo)，繪制曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(standardcurve)。（一）抗體：

抗體的親和力是抗體與抗原之間相互作用的一種結(jié)合能力或強(qiáng)度。親和力大即免疫結(jié)合既快又牢固，不易重新解離。Ag+Ab

Ag-Abk1k2親和力的大小用親和常數(shù)（affinityconstant）Ka值來表示，Ka＝k1/k2

，一般要求Ka值在1010～1012

L/mol之間。

二、基本試劑親和常數(shù)Ka的計(jì)算最常用的方法是標(biāo)準(zhǔn)作圖法：即以B/F為縱坐標(biāo)，以［B］為橫坐標(biāo)，得到一條直線，其斜率的負(fù)數(shù)即為Ka標(biāo)準(zhǔn)分析圖抗體的特異性

指抗體分別與相應(yīng)抗原和抗原結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合能力的比較。交叉反應(yīng)率=ED50（B）/ED50（A）×100%

抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合能力強(qiáng)，而與該抗原結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合能力弱，則特異性高。抗體與抗原結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合稱交叉反應(yīng)（crossreaction）抗體的滴度指抗體實(shí)際應(yīng)用時(shí)的稀釋倍數(shù)，稀釋倍數(shù)越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價(jià)越高。將抗血清稀釋成不同濃度，分別加入定量標(biāo)記抗原，充分反應(yīng)后分離B、F，以稀釋度為橫坐標(biāo)，B0%為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B0%為30%~50%的稀釋度為最佳稀釋度。（二）標(biāo)記抗原：

對(duì)標(biāo)記抗原的要求：1．比活度(specificactivity)：比活度越高，靈敏度越高。2．放射化學(xué)純度(radiochemicalpurity)：指具有免疫活性的標(biāo)記抗原的放射性占總放射性的百分率，一般要求大于95%。3．免疫活性：蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記過多的碘原子就可能引起免疫活性的改變，一般以每個(gè)蛋白質(zhì)分子上只標(biāo)1～2個(gè)125I原子為宜。4．半衰期：合適，保證制造、運(yùn)輸、分析整個(gè)過程。（三）標(biāo)準(zhǔn)品：

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的要求：1．標(biāo)準(zhǔn)品(standard)與被測(cè)物應(yīng)屬同一種物質(zhì)2．在與抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，應(yīng)與被測(cè)物具有相等的活性和親和力3．高度純化4．定量精確已知含量并呈梯度濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)抗原，做標(biāo)準(zhǔn)曲線用。（1）分離的目的是使抗原抗體復(fù)合物和游離抗原分開，以便測(cè)量B與F；（2）游離抗體及非標(biāo)記抗原無放射性，不干擾測(cè)量；（3）分離方法主要是使大分子和小分子物質(zhì)分離。（四）分離方法雙抗體法(測(cè)量B)：用抗原免疫動(dòng)物而產(chǎn)生的抗體稱為第一抗體，用第一抗體再免疫另一種動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體稱為第二抗體。當(dāng)RIA反應(yīng)完成后，于反應(yīng)液中加入第二抗體，第二抗體則與含有第一抗體的免疫復(fù)合物B相結(jié)合形成第二抗體復(fù)合物，其分子量比第一抗體復(fù)合物大，可用離心方法分離出來，稱為雙抗體法（doubleantibodymethod）。優(yōu)點(diǎn)：B和F分離較為完全，非特異性結(jié)合低，使用方便。缺點(diǎn)：分離時(shí)間長(zhǎng)，第二抗體用量多，易受反應(yīng)環(huán)境中蛋白質(zhì)及鹽含量的影響。雙抗體示意圖沉淀法(測(cè)量B)：某些中性鹽和有機(jī)溶劑（如聚乙二醇（PEG）或堿金屬中性鹽等）在一定條件下，能使抗體與抗原復(fù)合物沉淀。優(yōu)點(diǎn)：本法操作簡(jiǎn)便，分離速度快，價(jià)格低廉。缺點(diǎn)：分離效果易受pH值、離子強(qiáng)度、溫度、蛋白質(zhì)含量的影響，且非特異性結(jié)合較高。雙抗體＋沉淀法(測(cè)量B)：將雙抗體和沉淀法兩者結(jié)合進(jìn)行分離。本法具有兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，并克服了雙抗體分離時(shí)間長(zhǎng)和沉淀法非特異性結(jié)合高的缺點(diǎn)?；钚蕴课椒?測(cè)量F)：活性炭吸附小分子游離抗原，離心分離后，復(fù)合物留在上清液中，游離抗原在沉淀物中，測(cè)量沉淀物中的放射性F。優(yōu)點(diǎn)：本法操作簡(jiǎn)便，分離速度快，價(jià)格低廉。缺點(diǎn)：易于解離，分離效果時(shí)間和溫度的影響較大，非特異性結(jié)合較高。固相分離法(測(cè)量B)：將抗體或抗原通過特殊技術(shù)聯(lián)結(jié)在固相載體上，免疫反應(yīng)在固相載體上完成，達(dá)到平衡后形成固相的Ag-Ab復(fù)合物，可與游離部分分離。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，迅速，分離效果好，非特異性結(jié)合低。（五）放射性測(cè)量?jī)x器γ井型計(jì)數(shù)器：測(cè)γ射線，125I標(biāo)記液體閃爍計(jì)數(shù)器：測(cè)β射線，3H、14C等標(biāo)記配計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，自動(dòng)測(cè)量、數(shù)據(jù)處理、打印結(jié)果。基本操作過程：

放免測(cè)定一般包括加樣、溫育、分離B與F、測(cè)量與數(shù)據(jù)處理五個(gè)步驟放射免疫分析法的必備條件和基本步驟質(zhì)量控制（qualitycontrol，QC）包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制（internalqualitycontrol）與實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制又包括批內(nèi)質(zhì)控與批間質(zhì)控。三、質(zhì)量控制(一)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制：是一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部實(shí)驗(yàn)方法的質(zhì)量控制，以便在一個(gè)人的同一批或不同批實(shí)驗(yàn)中，不同操作者和不同方法之間有可比性。

零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率（B0%）：即最大結(jié)合率，指不加非標(biāo)記抗原時(shí)，標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率，一般要求在30%～50%，該指標(biāo)主要用來反映標(biāo)記物與抗體的質(zhì)量是否穩(wěn)定。非特異性結(jié)合率（NSB%）：指不加抗體時(shí)標(biāo)記抗原與非特異物質(zhì)的結(jié)合率，一般要求＜5%～10%。最低濃度管與最高濃度管的結(jié)合率之差：＞30%。標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸的參數(shù)：包括截距a、斜率b和相關(guān)系數(shù)r，要求a、b值穩(wěn)定，r＞0.99。ED25、ED50與

ED75：指標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)合率在25%、50%和75%時(shí)對(duì)應(yīng)的抗原濃度值，它反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性，有助于批間結(jié)果的比較。質(zhì)控圖：連續(xù)測(cè)定10批以上高、中、低三種已知濃度的質(zhì)控血清的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），畫出均數(shù)線與兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的范圍，將以后每次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的高、中、低值標(biāo)在圖上，即為質(zhì)控圖。WHO要求在一次實(shí)驗(yàn)中有下列情況之一者，其結(jié)果應(yīng)舍棄：①三種QCS中有一個(gè)測(cè)定值＞3s；②三種QCS中在同一方向上有兩種＞2s；③三種均在同一方向上＞1s。1、精密度(precision)：批內(nèi)CV＜5%，批間CV＜5%~10%又稱重復(fù)性，指同一樣品在多次重復(fù)測(cè)定中所得結(jié)果的一致程度。以標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)表示(二)試劑盒質(zhì)量控制：指測(cè)定方法的最小可檢出量，即從生物樣品中能夠檢出某物質(zhì)的最小濃度。2、靈敏度（sensitivity）：準(zhǔn)確度(accuracy)指測(cè)定值與已知真實(shí)值的符合程度?？捎没厥章剩╮ecoveryrate）來表示:回收率%＝

測(cè)定值/真實(shí)值×100%一般要求達(dá)到90%～110%。3、準(zhǔn)確度：5、穩(wěn)定性：4、特異性：取決于抗體的特異性，交叉反應(yīng)越少，特異性越好。指試劑盒在適宜的溫度等條件下，在有效期內(nèi)保持原有性能不變的能力。健全性（perfection）是評(píng)價(jià)被測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)品的免疫活性是否相同的指標(biāo)。用標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品稀釋曲線的平行性分析來判斷方法的可靠性。平行性好者可靠性好。健全性6、健全性：(三)實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)量控制：實(shí)驗(yàn)室外質(zhì)量控制是對(duì)各實(shí)驗(yàn)室之間測(cè)定結(jié)果按統(tǒng)一評(píng)價(jià)方案及方法比較分析，以提高各實(shí)驗(yàn)室之間所得結(jié)果的可信性和可比性。

第二節(jié)免疫放射分析(IRMA)一、原理將過量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合，分離結(jié)合的標(biāo)記抗體與未結(jié)合的多余的標(biāo)記抗體，測(cè)定復(fù)合物的放射性，其活度與待測(cè)抗原的量呈正相關(guān)。Ag＋*Ab

Ag-*Ab＋*AbAg：抗原*Ab：標(biāo)記抗體Ag-*Ab：抗原與標(biāo)記抗體的復(fù)合物二、特點(diǎn)免疫放射分析法有以下特點(diǎn)：1．以標(biāo)記抗體作為示蹤劑。2．反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：因標(biāo)記抗體是過量的，且反應(yīng)是非競(jìng)爭(zhēng)性的，抗原抗體是全量反應(yīng)，故反應(yīng)速度比RIA快。3．靈敏度明顯高于放射免疫分析，約為放射免疫分析的10～100倍。4．標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬。5．特異性高。6．穩(wěn)定性好。7．目前僅限于蛋白質(zhì)和多肽抗原。三、常用方法抗體夾心法（最常用）：

將分離抗體涂在反應(yīng)容器的壁上，稱固相抗體。固相抗體先與待測(cè)抗原反應(yīng)，形成固相抗體－抗原復(fù)合物，再與標(biāo)記抗體反應(yīng)，形成固相抗體－抗原－標(biāo)記抗體復(fù)合物附著在管壁上，傾去上清液直接測(cè)量反應(yīng)容器的放射性。

標(biāo)記第三抗體法：用雙抗夾心法中的第二抗體（標(biāo)記抗體）作為抗原免疫其他的動(dòng)物獲得的抗體為第三抗體。反應(yīng)后得到固相抗體－抗原－第二抗體－標(biāo)記第三抗體的復(fù)合物。IRMA和RIA的區(qū)別：反應(yīng)機(jī)制不同反應(yīng)試劑分離方法不同劑量關(guān)系反應(yīng)中的NSBIRMA和RIA工作原理的主要區(qū)別：RIAIRMA競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的AgAb的量與待測(cè)Ag的量呈負(fù)相關(guān)AgAb的量與待測(cè)Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū)非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素一、酶標(biāo)記的免疫分析法（enzymeimmunoassay,EIA）：將抗原抗體結(jié)合的高特異性與酶促反應(yīng)的高靈敏度有機(jī)結(jié)合起來，用酶標(biāo)記抗體（抗原），檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本中未知抗原（抗體），當(dāng)相應(yīng)的抗原抗體特異性結(jié)合后，加入相應(yīng)的酶的底物，酶可以高效專一催化和分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。根據(jù)顏色有無和深淺，可以判斷待測(cè)標(biāo)本中有無特異性抗原（抗體）以及量的多少。

可以定性、定量，是一種敏感、特異、簡(jiǎn)便、只需一般光譜分析儀器的微量測(cè)定技術(shù)。

第三節(jié)非放射免疫分析

二、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemicalluminescentimmunoassay，CLIA）：以發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記示蹤物，標(biāo)記抗原或抗體；是一種超微量分析法。其突出特點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，試劑穩(wěn)定，無放射性污染。

如是標(biāo)記抗原，則待測(cè)抗原與熒光標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量抗體，反應(yīng)達(dá)到平衡后，將游離標(biāo)記抗原與發(fā)光標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物分離，然后處理復(fù)合物，使其發(fā)光物質(zhì)發(fā)光，其中發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)抗原呈負(fù)相關(guān)；非競(jìng)爭(zhēng)法中，用發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗體，與IRMA法原理相似。三、時(shí)間分辨熒光分析法（timeresolvedf