第二章預(yù)處理及固液分離技術(shù)2

第二節(jié)細(xì)胞破碎與分離2.1

概述2.2細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及特點2.3細(xì)胞壁的破碎2.1概述胞外產(chǎn)物霉菌產(chǎn)生糖化酶等胞內(nèi)產(chǎn)物基因重組產(chǎn)品等采用機(jī)械和非機(jī)械的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。2.2細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及特點微生物：細(xì)菌——肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)酵母——細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度及厚度真菌——細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)植物：主要是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價鍵微生物革蘭式陽性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（nm）20～8010～25100～300層單層多層多層主要組成肽聚糖(40~90%)肽聚糖(5~10%)葡聚糖(30~40%)多糖脂蛋白甘露聚糖（30％）胞壁酸脂多糖蛋白質(zhì)磷脂蛋白質(zhì)脂多糖蛋白質(zhì)脂類破碎難易程度難相對易最難表2.1各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成2.3細(xì)胞壁的破碎破碎方法的選擇：

破碎目的待破碎生物體的類型破碎目的：獲取產(chǎn)品，考慮破碎收率和能耗；

待破碎生物體的類型：不同生物體對破碎有不同的敏感度。2.3.1破碎率的評價破碎率的定義：

N0：原始細(xì)胞數(shù)N：經(jīng)t時間操作后，保存下來的細(xì)胞數(shù)N0和N的獲?。褐苯佑嫈?shù)法（平板計數(shù)，顯微鏡計數(shù)）間接計數(shù)法（測破碎細(xì)胞釋放出活性物質(zhì)量）電導(dǎo)率測定法3.1x＝R/RmR:破碎后釋放的化合物的量Rm:理論最大釋放量電導(dǎo)率測定法：細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的物質(zhì)被釋放到水相，使電導(dǎo)率上升，電導(dǎo)率隨破碎率的增加呈線性增加。

由于電導(dǎo)率與微生物的種類，處理條件，細(xì)胞濃度，溫度，懸浮液中電解質(zhì)含量有關(guān)，因此，正式測定應(yīng)采用其它方法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3.2破碎方法破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法液體剪切作用固體剪切作用干燥處理溶胞作用珠磨法壓榨高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學(xué)法物理法圖2.2細(xì)胞破碎方法分類圖2.3細(xì)胞破碎機(jī)理2.3.2破碎方法圖2.3HC23-高壓細(xì)胞破碎機(jī)高壓勻漿法圖2.4DY89-1型電動玻璃勻漿機(jī)作用機(jī)理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速(可達(dá)到450m／s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50～70MPa。

一、高壓勻漿法影響細(xì)胞破碎的因素：溫度壓力循環(huán)操作次數(shù)細(xì)胞濃度閥座形式高壓勻漿法影響破碎效率的因素溫度：破碎率隨溫度的增加而增加例如：操作溫度由5℃增加到30℃，破碎率約提高1.5倍。高溫對破碎有利，但應(yīng)考慮熱變性壓力每增加10MPa，溫度2℃。高壓勻漿法影響破碎效率的因素壓力：高壓勻漿法不能單純追求高破碎率，隨意增加操作壓力。影響破碎效率的因素閥座形式：在相同的操作壓力下，刃緣閥座比平邊閥座破碎率高，但更易磨損。高壓勻漿法圖2.4珠磨機(jī)簡圖二、

珠磨法生產(chǎn)廠商:

瑞士WAB公司德國西門子機(jī)械公司形式：立式臥式（效率高）原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球和微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。產(chǎn)熱由夾套帶走。珠磨法珠磨機(jī)主體：立式和臥式圓筒型腔體一般，臥式比立式珠磨破碎效率高：因為立式機(jī)中向上流動的液體在某種程度上會使研磨珠流態(tài)化，從而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度為2.5g／cm3)或氧化鋯(密度為6.0g／cm3)微球(粒徑約0.1～10mm)，填充率為80％～85％。影響破碎效率的因素：轉(zhuǎn)盤外緣速度細(xì)胞濃度珠粒大小及裝載量溫度流速珠磨法影響破碎效率的因素細(xì)胞濃度：影響懸浮液的流變特性，從而影響蛋白質(zhì)的釋放，一般由實驗確定一般控制在40％左右，細(xì)胞濕重/體積珠磨法影響破碎效率的因素珠粒大小及裝載量：過少不易破碎過多，能耗大，熱擴(kuò)散性能降低，引起溫度升高，不利攪拌，一般控制80％～90%.珠磨法圖2.7微珠直徑對破碎率的影響對細(xì)菌，磨珠越小，破碎率越高；對酵母和藻類，存在最佳范圍實驗室：0.2mm工業(yè)：不小于0.4mm影響破碎效率的因素溫度：熱穩(wěn)定性，目的產(chǎn)物不受破壞夾套冷卻珠磨法影響破碎效率的因素流量：珠磨法圖2.8流量對破碎速率常數(shù)的影響影響破碎效率的因素微生物類型：酵母較細(xì)菌在珠磨機(jī)中更易破碎，因為細(xì)菌細(xì)胞的大小僅為酵母細(xì)胞的十分之一，在高速珠磨機(jī)中不易破碎。珠磨法影響破碎效率的因素延長研磨時間，增加珠體裝量，提高基本速度等均可提高細(xì)胞破碎率，但高破碎率，使能耗加大。同時:1、產(chǎn)生較多熱能，增加冷卻控溫的難度；2、大分子目的產(chǎn)物失活增加3、細(xì)胞碎片較小，碎片不易分離，給后續(xù)操作帶來困難。因此,破碎率控制在80％以下。珠磨法圖2.5JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)三、超聲波法作用機(jī)理：在超聲波作用下，液體發(fā)生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。超聲波法動力學(xué)方程：一級超聲波法x：蛋白質(zhì)釋放分率t：超聲波發(fā)射時間（min）k：蛋白質(zhì)釋放常數(shù)(min-1),取決于輸入聲能超聲波的負(fù)面影響：1、溫度上升：懸浮液預(yù)冷，夾套冷卻短期冷卻與短期破碎交替負(fù)載因素：聲波破碎/冷卻的時間比率。2、超聲處理會引起諸如游離基這樣的化學(xué)效應(yīng)，破壞目的產(chǎn)物，可加入游離基清除劑（組氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。超聲波法影響破碎細(xì)胞的因素：振幅：直接與聲能有關(guān)，影響比速率k粘度：影響能耗，并抑制空穴現(xiàn)象表面張力：表面活性劑顯著影響聲波破碎效率，因起泡使蛋白質(zhì)變性，空穴清除懸浮液體體積：大體積需要高的聲能超聲波法影響破碎細(xì)胞的因素：加入珠粒體積與直徑:加入細(xì)小珠粒，利于空穴形成，并有輔助“研磨效應(yīng)”，提高破碎率。在相同珠粒填充密度下，隨珠粒直徑變化，k存在最大值。探頭的材料和形狀：選擇具有良好聲學(xué)和機(jī)械性能并對生物物質(zhì)無毒的金屬材料，如：鈦，不銹鋼等；探頭的振幅與其面積呈反比，小直徑探頭，聲能限制在較小范圍內(nèi)，并且效率低。細(xì)胞懸浮液的流速：流速增加，破碎率低，處理量大工業(yè)未使用，向大量懸浮液通入足夠能量，很困難，產(chǎn)熱問題。超聲波法機(jī)械法破碎細(xì)胞的優(yōu)缺點：優(yōu)點：內(nèi)含物全部釋放時間短，效率高，成本低通用性強(qiáng)，適于實驗室和工業(yè)生產(chǎn)缺點：需要高的能量產(chǎn)生高溫，高剪切力，引起產(chǎn)品變性失活非專一性，碎片分布寬，給分離造成困難滲透壓沖擊法：滲透壓沖擊(Osmoticshock)是在各種細(xì)胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易于破碎的細(xì)咆，如動物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。四、物理法凍融法：將細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。凍結(jié)的作用是破壞細(xì)胞膜的琉水鍵結(jié)構(gòu)，增加其親水性和通透性。另一方面，出于胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外產(chǎn)生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細(xì)胞膨脹而破裂物理法2.3.2破碎方法干燥法：將細(xì)胞用不同的方法干燥（真空、冷凍、噴霧和氣流等），細(xì)胞膜結(jié)合水喪失，滲透性發(fā)生變化而破裂缺點：條件變化劇烈，易引起生物物質(zhì)變性物理法作用機(jī)理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵或某種特殊的物質(zhì)，從而達(dá)到破碎細(xì)胞壁的目的。分外加酶法和自溶法兩種。五、酶溶法優(yōu)點：產(chǎn)品釋放選擇性高抽提速率和收率高產(chǎn)品破壞少pH、溫度外界條件要求低不殘留細(xì)胞碎片酶溶法缺點：費用高通用性差存在產(chǎn)品抑制不適于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用：原生質(zhì)體融合釋放出克隆出的胞內(nèi)蛋白制取特殊的壁葡萄糖聚合物與機(jī)械法破碎細(xì)胞協(xié)同使用從細(xì)胞內(nèi)不同的位置選擇性的釋放蛋白酶溶法

作用機(jī)理：用化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分處理方法：表面活性劑；有機(jī)溶劑；EDTA螯合劑；變性劑取決于化學(xué)試劑的類型及細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與組成。六、化學(xué)滲透法優(yōu)點：產(chǎn)物釋放有一定的選擇性不需要特殊設(shè)備細(xì)胞外形保持完整，細(xì)胞碎片少，漿液粘度低，利于后續(xù)分離化學(xué)滲透法缺點：通用性差時間長，效率低某些化學(xué)試劑有毒比較項目機(jī)械法非機(jī)械法比較項目機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理切碎細(xì)胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片細(xì)小碎片較大設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備內(nèi)含物釋放全部部分通用性強(qiáng)差粘度高（核酸多）低（核酸少）經(jīng)濟(jì)成本低成本高時間時間短時間長應(yīng)用范圍實驗室、工業(yè)范圍實驗室范圍表2.3機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法的比較破碎技術(shù)的選擇原則：目的產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)中，需機(jī)械破碎法目的產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，可采用非機(jī)械破碎法目的產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用兩種方法結(jié)合處理量的大小，細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)，目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性，破碎后固-液分離的難易程度破碎技術(shù)的研究發(fā)展方向：多種破碎方法結(jié)合與上游過程結(jié)合

1、培養(yǎng)過程控制

2、寄主細(xì)胞選擇

3、克隆噬菌體溶解基因

4、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)與下游結(jié)合從后分離過程考察細(xì)胞破碎技術(shù)第三節(jié)固-液分離技術(shù)

固-液分離是指將發(fā)酵液中的懸浮固體，如細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片以及蛋白質(zhì)等的沉淀物或它們的絮凝體分離除去。方法：過濾：利用介質(zhì)過濾；重力沉降：在沉降槽中利用重力作用沉降固體顆粒；離心：分離心沉降、離心過濾；一、過濾技術(shù)最常用、最簡單的固-液分離方法。（過濾速度的強(qiáng)化）（一）基本原理利用多孔性介質(zhì)截留固-液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固-液分離的方法。濾漿、濾餅、濾渣、濾液。三種分類方法：按流動方向、按壓力、按方式分。（二）過濾介質(zhì)過濾介質(zhì)也稱濾材，應(yīng)由惰性材料制成，既不與濾液起反應(yīng)，也不吸附或很少吸附待濾液中的有效成分；耐酸、耐堿、耐熱，適用于各種濾液；過濾阻力小、濾速快、反復(fù)應(yīng)用易清洗；應(yīng)具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度；價廉、易得。①濾紙。②脫脂棉。③織物介質(zhì)。④燒結(jié)金屬過濾介質(zhì)。⑤多孔塑料過濾介質(zhì)。⑥垂熔玻璃過濾介質(zhì)。過濾介質(zhì)的種類常用濾紙的孔徑為1～7μm。適用于口服液體制劑的過濾。包括棉織品紗布、帆布等。⑦多孔陶瓷。⑧微孔濾膜。①普通漏斗。②垂熔玻璃濾器。③砂濾棒。④板框式壓濾機(jī)。⑤微孔濾膜過濾器。（三）過濾裝置常用玻璃漏斗和布氏漏斗，常用濾紙、長纖維和脫脂棉以及絹布等作過濾介質(zhì)。⑥其它：超濾裝置、鈦濾器、多孔聚乙烯燒結(jié)管過濾器等。（四）常用的過濾方法1.常規(guī)過濾2.錯流過濾（膜分離技術(shù)）常規(guī)過濾提高過濾速度和過濾質(zhì)量是過濾操作的目標(biāo)濾餅阻力是影響過濾的主要因素操作前可對懸浮液（培養(yǎng)液）優(yōu)化過濾設(shè)備及其結(jié)構(gòu)優(yōu)點過濾面積大，結(jié)構(gòu)簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強(qiáng)。缺點不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，非過濾的輔助時間較長。由多個中空濾框和實心濾板交替排列在支架上組成，是一種加壓下間歇操作的過濾設(shè)備。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。板框式壓濾機(jī)真空過濾機(jī)：真空度2.7X102～6.7X104Pa

連續(xù)操作，輔助設(shè)備多，投資大。結(jié)構(gòu)：由篩板組成能轉(zhuǎn)動的水平圓筒，其上有一層金屬絲網(wǎng)，網(wǎng)上覆蓋濾布。圓筒內(nèi)沿徑向被筋板分成若干個空間，每個空間以單獨孔道通到圓筒頸端面的分配頭上，分配頭內(nèi)沿徑向隔離成3個室，分別與待濾液、真空、壓縮空氣管路相通。圓筒轉(zhuǎn)速：0.5～2r/min，依次進(jìn)行過濾\洗滌\吸干\吹松\卸餅等操作。過濾面積：1、5、20、40，最大50m2GP型為刮刀卸料，GP－X型為繩索卸料?；旌衔镏袘腋☆w粒的性質(zhì)和大小混合液的黏度操作條件助濾劑的使用過濾分離設(shè)備和技術(shù)（王）影響過濾的因素一般情況下，懸浮顆粒越大，粒子越堅硬，大小越均勻，過濾越容易進(jìn)行。流體黏度越大，過濾越困難。通?；旌弦旱慕M成越復(fù)雜，濃度越高，黏度越大。（1）混合物中懸浮顆粒的性質(zhì)和大?。?）混合液的黏度（3）操作條件溫度升高，流體黏度降低；調(diào)整pH也可改變流體黏度。

助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，吸附膠體，擴(kuò)大過濾面積，濾速增大。

常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。

助濾劑的使用方法有兩種：一種是在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，另一種是直接加入發(fā)酵液，也可兩種方法同時兼用。（4）助濾劑的使用助濾劑使用要點②根據(jù)過濾介質(zhì)和過濾情況選擇助濾劑品種①根據(jù)目的物性質(zhì)選擇助濾劑品種③粒度選擇：實驗確定④用量的確定預(yù)涂助濾劑時，間隙操作助濾劑的最小厚度為2mm；連續(xù)操作則要根據(jù)所需的過濾速率來確定。②增大過濾的表面積①選擇合適的過濾介質(zhì)③增加助濾劑④增加過濾推動力⑤提高溫度。（5）過濾分離設(shè)備和技術(shù)為提高過濾速率和效果一般采用如下措施：二、沉降重力沉降是由地球引力作用而發(fā)生的顆粒沉降過程。根據(jù)沉降力的不同分成重力沉降式和離心沉降式兩類。主要有矩形水平流動池、圓形徑向流動池等。設(shè)備體積龐大、分離效率低；設(shè)備簡單、能耗低。

三、離心技術(shù)〔分離較難分離物系〕在液相非均勻體系中，利用離心力來達(dá)到液液分離、液固分離、液液固分離的方法都稱為～離心分離。其中液固分離分離心沉降和離心過濾。

離心分離方法（1）差速離心分離－生化工業(yè)中最常用分離方法實際物系的特點、分離目的、分離程度（目標(biāo)產(chǎn)物和其它組分的性質(zhì)及相互作用等）選擇適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件（離心轉(zhuǎn)數(shù)和時間）使料液的不同組分得到分級分離細(xì)胞破碎液

離心600g,10min沉降層/細(xì)胞核（4－6μm)上清液(細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶菌體、核糖體、水溶性物質(zhì)離心(10000g,10min)

沉降層（細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶菌酶）

上清液（核糖體、水溶性物質(zhì)）離心（100000g，3h)上清液(水溶性物質(zhì)）沉降層（核糖體）細(xì)胞破碎液的差速離心分離（2）速率區(qū)帶離心－生化研究的重要分離手段

（差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心）在離心管中用某種低分子溶質(zhì)（如蔗糖）調(diào)配好密度梯度（從大到小加入）在密度梯度之上加待處理的料液然后進(jìn)行離心操作區(qū)帶離心法可用于蛋白質(zhì)、核酸等生