微生物工程發(fā)酵第二章菌種制備原理與技術

微生物工程發(fā)酵第二章菌種制備原理與技術第一頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.1發(fā)酵工業(yè)微生物菌種概述菌種是微生物工程的核心；選育、保藏、復壯第二頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.1.2發(fā)酵工業(yè)常用微生物種類細菌主要生產氨基酸、核酸、酶、多糖、有機酸等常用菌種：Escherichiacoli;Bacillussubtilis;Lactobacilluslactis;Corynebacteriumglutamicum第三頁，共四十三頁，2022年，8月28日放線菌主要生產抗生素、某些特定的酶；常用菌種：Streptomyceslividans;S.coelicolor;S.hygroscopicus;Micromonosporaechinospora;Actinoplanesferrugineus;第四頁，共四十三頁，2022年，8月28日酵母主要生產酒精、有機酸、單細胞蛋白常用菌種：SaccaromycescerevisiaePichiapastorisCandidaglabrataC.tropicalsPhaffiarhodozymaYarrowialipolitica第五頁，共四十三頁，2022年，8月28日霉菌主要生產：抗生素、有機酸、酶、色素；PenicilliumchrysogenumAspergillusnigerA.oryzaeRhizopusoryzae第六頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.1.3發(fā)酵工業(yè)微生物的基本要求遺傳穩(wěn)定易于產生繁殖體必須是純種或明確的少數(shù)幾種菌組成的簡單混菌系統(tǒng)，不應帶有雜菌及噬菌體；種子的生長必須旺盛、迅速；產生所需產物的時間短；容易分離提純；有自身保護機制，抵抗雜菌和噬菌體污染的能力強；能保持較長的良好經(jīng)濟性能；菌株對誘變劑處理比較敏感，可能選育出高產的菌株；菌種不是病原菌，不產生任何有害的生物活性物質和毒素第七頁，共四十三頁，2022年，8月28日菌種的制備原理和方法菌株獲得的主要方法：向菌種保藏機構索?。粡谋２貦C構獲取菌種進行分離篩選有兩個好處：經(jīng)濟性指導性

從自然界分離篩選；從某些發(fā)酵制品中分離；第八頁，共四十三頁，2022年，8月28日從自然界篩選目標菌株的方法與步驟含微生物樣品的采集（含微生物樣品的富集培養(yǎng)）微生物的分離野生型目的菌株的篩選鑒定第九頁，共四十三頁，2022年，8月28日微生物的分離

稀釋涂布法劃線法；第十頁，共四十三頁，2022年，8月28日生化反應法；

高溫下培養(yǎng)：分離嗜熱細菌；培養(yǎng)基中不含N：分離固氮菌；培養(yǎng)基加抗生素：分離抗性菌；第十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日組織分離法

第十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日合理的篩選策略是關鍵！第十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日氨基酸產生菌的篩選

樣品

分離

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應到copy前相應

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養(yǎng)，對產物進行定量測定篩選產物含量高的菌株第十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日對產物進行菌種篩選時，有兩條經(jīng)驗：進化上向上兼容；次生代謝在進化上后移，芽孢菌以上更有篩選意義/jpkc第十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日分離篩選工作在實際中應用的幾個方面從被污染的生產及科研用菌中分離目的菌；

生產中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產品的產生菌；尋找老產品的新的優(yōu)良菌株。/jpkc第十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.1.5適應性進化（菌株馴化）Adaptiveevolution通過人工措施使微生物逐步適應某一條件，而定向選育微生物的方法；（檸檬酸）第十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.1.6菌種的保藏保藏、退化、復壯第十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日菌種的退化和防止菌種退化：菌株由于移接傳代或保藏之后，群體中某些生理特征或形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為生長速度變慢和目標產物生產能力的下降；第十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日防止退化的方法：盡量減少傳代；經(jīng)常進行純化；創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件；單核細胞的移植傳代；采用有效的保藏方法；第二十頁，共四十三頁，2022年，8月28日菌種的復壯

在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定生產性能等方法，從衰退的群體中找到尚未衰退的個體，以達到恢復該菌種原有性狀的措施；方法：純種分離（單細胞分離）；

淘汰法；

寄生體內復壯法；第二十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日工業(yè)微生物菌種的保藏不死、不變、不亂；第二十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日斜面保藏法4℃；非長期保存；1-3個月需傳代，可傳3-4代；第二十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日液體石蠟油保藏法；尤其適用于絲狀擔子菌；一般存活期為5～7年，有的可以達到10年以上，但以2～3年轉管第二十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日冷凍干燥保藏法；5-10年，不適合絲狀真菌；第二十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日液氮超低溫保藏法；-196℃；第二十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日甘油低溫保存：15%甘油，-80℃；第二十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.2微生物誘變育種2.2.1誘變育種目的提高目的物產量；改善菌種特性、提高產物質量；簡化工藝條件；開發(fā)新品種；第二十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.2.2誘變育種基本步驟①出發(fā)菌株originalstrain的選擇:具備一定生產能力或某種有利性狀；純種；已發(fā)生過其他突變；對誘變劑敏感的增變變異株；第二十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日②出發(fā)菌株的純化③單細胞懸液的制備；④誘變劑及誘變劑量的選擇⑤誘變處理方式（單因子、復合因子）⑥誘變菌株的篩選第三十頁，共四十三頁，2022年，8月28日高通量篩選技術：第三十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.3微生物原生質體育種

和基因組改組育種2.3.1原生質體的特征對外界變化更敏感；對誘變劑更敏感；對某些噬菌體失去敏感；第三十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.3.2微生物原生質體再生育種①出發(fā)菌株的選擇②菌體的活化③原生質體的制備④原生質體再生⑤菌株的分離⑥篩選第三十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日原生質體的制備：酶解法預處理：

細菌（青霉素）；放線菌（甘氨酸）；

霉菌（脂肪酶）；酵母菌（EDTA或巰基乙醇）置于穩(wěn)定劑中；酶的選擇：放線菌、細菌（溶菌酶）霉菌（蝸牛酶或纖維素酶）酵母（蝸牛酶或葡聚糖酶）第三十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日原生質體再生（細胞壁）雙層平板上，半固體培養(yǎng)基中；第三十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.3.3微生物原生質體誘變育種原生質體技術＋誘變育種技術出發(fā)菌株的選擇菌體的活化原生質體的制備誘變育種原生質體再生菌株的分離篩選第三十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.3.4微生物原生質體轉化技術整條染色體DNA、片段DNA或者質粒DNA轉化原生質體獲得轉化子的育種技術；出發(fā)菌株的選擇菌體的活化原生質體的制備轉化原生質體再生菌株的分離篩選第三十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.3.5微生物原生質體融合技術用物理、化學或生物學的方法處理兩親株原生質體，促使其融合，經(jīng)染色體交換、重組而達到雜交的目的，通過篩選而得到集二者優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子；第三十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日出發(fā)菌株的選擇（具有較大遺傳差異的近親菌株）菌體的活化原生質體的制備原生質體融合原生質體再生菌株的分離篩選第三十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日原生質體融合

兩親株原生質體混合于高滲透壓的穩(wěn)定劑中，在促融劑的誘導作用下，接觸融合成異核體，經(jīng)核融合成雜合二倍體，再經(jīng)染色體交換產生重組體，稱融合子；物理方法：電融合、激光融合化學方法：PEG（1000-6000分子量）第四十頁，共四十三頁，2022年，8月28日2.3.6基因組該組育種在微生物全基因組改造中快速進行特定群體的基因交換重組，從而增加群體遺傳多樣性，改良群體中個體性能等的連續(xù)遺傳改變及表型選擇過程；人工誘變+原生質體融合第四十