諾禾致源原核轉錄組生物信息分析結題報告2013年8月

一、建庫流TotalRNA上機差 差 文 列一、建庫流從RNA樣品到最終數(shù)據(jù)獲得，樣品檢測、建庫、每一個環(huán)節(jié)都會對數(shù)據(jù)質量和數(shù)量產(chǎn)生影響，而數(shù)據(jù)質量又會直接影響后續(xù)信息分析的結果。因此，獲得高質量數(shù)據(jù)是保證生物信息分析正確、全面、可信的前提。為了從上保證數(shù)據(jù)的準確性、可靠性，諾禾致源對樣品檢測、建庫、每一個生產(chǎn)步驟都嚴格把控，從根本上確保了高質量數(shù)據(jù)的產(chǎn)出。流程圖如下：TotalRNA諾禾致源對RNA樣品的檢測主要包括4種方法瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污Nanodrop檢測RNA的純度（OD260/280比值Qubit對RNA濃度進行精確定Agilent2100精確檢測RNA的完fragmentationbuffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（randomhexamers）合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs（dTTP換為dUTP）和DNApolymeraseI合成二鏈cDNA，隨后利用AMPureXPbeads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接接頭，然后用AMPureXPbeads進行片段大小選擇，最后消化二鏈后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。構建文庫構建完成后，先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1ng/ul，隨后使用Agilent2100對文庫的insertsize進行檢測，insertsize符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞2nM），以保證文庫質量。上機庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行 二、生物信息分析流程獲得原始序列(SequencedReads)后，在有相關物種參考序列或參 組的情況下，通過 程進行生物信息分析三、項目結果說明1高通量(如illuminaHieqM200MiSq等平臺)得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別(Baseallng)分析轉化為原始序列(Sequenedeas)，我們稱之為RawDta或RawRes，結果以FASTQ(簡稱為fq)文件格式，其中包含序列(d)的序列信息以及其對應的質量信息。FASTQ格式文件中每個read由四行描述，如下@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:1973931:Y:18:ATCACG其中第一行以“@”開頭，隨后為illumina標識符(SequeneIdetiies)和描述文字(選擇性部分)；第二行是堿基序列；第三行以“+”開頭，隨后為illumia標識符(選擇性部分)；第四行是對應序列的質量(Cockta.)。illumina標識符詳細信息如下UniqueinstrumentRunFlowcell2FlowcellTilenumberwithintheflowcell'x'-coordinateoftheclusterwithinthe'y'-coordinateoftheclusterwithinthe1Memberofapair,1or2(paired-endormate-pairreadsYYifthereadfailsfilter(readisbad),N0whennoneofthecontrolbitsareon,otherwiseitisanevenIndex公式一：Qphred=-10log10(e)illuminaCasava1.8版本 錯誤率質量值對應字符.5?I2數(shù)據(jù)質量評 錯誤率分布檢每個堿基錯誤率是通過Phred數(shù)值(Phredscore,Qphred)通過公式1轉化得到，而Phred數(shù)值是在堿基識別(BaseilluminaCasava1.8版本堿基識別與Phred分值之間的簡明對應關Phred分不正確的堿基識別堿基正確識別率Q-9999錯誤率與堿基質量有關，受儀本身、試劑、樣品等多個因素共同影響。對于RNA-seq技術，錯誤率分布具有兩個特點：(1)錯誤率會隨著序列(SequencedReds)長度的增加而升高，這是由于過程中化學試劑的消耗而導致的，并且為illumina高通量平臺都具有的特征。(2)前6個堿基的位置也會發(fā)生較高的錯誤率，而這個長度也正好等于在RNA-seq庫程中反轉錄所需要的隨機引物的長度。所以推測前6個堿基錯誤率較高的原因為隨機引物和RNA模版的不完全結合(Jiangetal.。圖2.1錯誤率分布橫坐標為reads的堿基位置，縱坐標為單堿GCGC含量分布檢查用于檢測有無AT、GC分離現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象可能是或者建庫所帶來的，并且會影響后續(xù)的定量分析在illumna平臺的轉錄組中，反轉錄成cDNA時所用的6bp的隨機引物會引起前幾個位置的核苷酸組成存在一定的偏好性。而這種偏與的物種和環(huán)境無關，但會影響轉錄組的均一化程度(Hansenetl.)。除此之外，理論上G和C堿基及A和T堿基含量每個循環(huán)應分別相等，且整個過程穩(wěn)不變，呈水平線。對于DE來說，由于隨機引物擴增偏差等原因，常常會導致在得到的每個ed67個堿基有較大的波，這種波動屬于正常情況。對于鏈特異性文庫，由于只保留鏈，G和C堿基AT堿基含量不等。對于鏈特異性文庫，由建庫過程中只保留一鏈，G和C基及AT堿基含量不等。圖2.2GC含量分布橫坐標為reads的堿基位置，縱坐標為單堿基所占的比例；不同顏色代表不 數(shù)據(jù)過得到的原始序列，里面含有帶接頭的、低質量的reads，為了保證信息分析質量，必須對rawreads進行過濾，得到cleanreads，后續(xù)分析都基于cleanreads。數(shù)據(jù)處理的步驟如下去除帶接頭(adapter)的去除N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于10%的去除低質量readsRNA-seq的接頭(Adapter,OligonucleotidesequencesforTruSeqTMRNAandDNASamplePrepKits)信息：RNA5’Adapter(RA5),part# 5’-AATGGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-RNA3’Adapter(RA3),part 5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(6位index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-圖2.3原始數(shù)據(jù)過濾結數(shù)據(jù)質量情況匯

表2.4數(shù)據(jù)產(chǎn)出質量情況一覽SampleRawCleanErrorGCGG數(shù)據(jù)質量情Rawreads：統(tǒng)計原始序列數(shù)據(jù)，以四行為一個單位，統(tǒng)計每個文件的序列的個數(shù)Cleanreads：計算方法同RawReads，只是統(tǒng)計的文件為過濾后的數(shù)據(jù)。后續(xù)的生物信息分析都是基于CleanreadsCleanbases：序列的個數(shù)乘以序列的長度，并轉化為以G為單位Errorrate：通過公式1Q20、Q30：分別計算Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基的百分GCcontent：計算堿基G和C的數(shù)量總和占總的堿基數(shù)針對細菌等密度較高的生物，我們用Bowtie2將過濾后的序列進行組定位分析。如果參考組選擇合適，而且相關實驗不存在污染，實驗所產(chǎn)生的序列的定位的百分比正常情況下會高于70%(TotalMappedReadsorFragents)，其中具有多個定位的序列(MultipleMapedRadsrFraments)占總體的百分比通常不會超過10%。Reads與參考組比對情況統(tǒng)表3.1Reads與參考組比對情況一覽SampleTotalTotal(95MultiplniquelyRead-Read-(47ReadsmaptoReadsmapto'-Readsmappedinproper191477147063比對結果統(tǒng)Totalreads：序列經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后的數(shù)量統(tǒng)計(Cleandata)Totalmppd：能定位到組上的序列的數(shù)量的統(tǒng)計；一般情況下，如果不存在污染并且參考組選擇合適的情況下，這部分數(shù)據(jù)的百分比大于70%。Multiplemapped：在參考序列上有多個比對位置的序列的數(shù)量統(tǒng)計；這部分數(shù)據(jù)的百分比一般會小于10%Uniquelymapped：在參考序列上有唯一比對位置的序列的數(shù)量統(tǒng)計Readsmapto'+'，Readsmapto'- 序列比對 組上正鏈和負鏈的統(tǒng)計Reads在參考組不同區(qū)域的分布情根據(jù)組的注釋信息，對Totalmappedreads比對到組上的各個部分的情況進行統(tǒng)計。正常情況下，區(qū)的reads定圖3.2Reads在參考組不同域的分布情Reads在上的密度分布情對Totalmapedreds的比對到組（分正負鏈）的密度進行統(tǒng)計，下圖是隨機抽取部分reads，展示其在上的map圖3.3Reads在上的密度分布最外圈是組；中間的灰色背景區(qū)是實際的抽取的reads的分布情況，紅色map到正鏈，藍色到負鏈；最里面的圓圈，橘黃色為正鏈coverage分布，綠色為負鏈coverage分布，超過所有coverage集均值+2倍標準差的奇異點被舍棄Reads我們提供RNA-seqReads在組上比對結果的bam格式文件，部分物種還提供相應的參考組和注釋文件，并推薦使用IGV(IntegraiveGnomicsViewr)瀏覽器對bam文件進行可視化瀏覽。IGV瀏覽器具有以下特點：(1)能在不同尺度下顯示單個或多個讀段在組上的位置，包括讀段在各個上的分布情況和在注釋的外顯子、內含子、剪接接合區(qū)、間區(qū)的分布情況等；(2)能在不同尺度下顯示不同區(qū)域的讀段豐度，以反映不同區(qū)域的轉錄水平；(3)能顯示及其剪接異構體的注釋信息；(4)能顯示其他注釋信息；(5)既可以從服務器端各種注釋信息，又可以從本地加載注釋信息。IGV瀏覽器使用方法可參考我們提供的使用說明文檔(IGVQuickStart.pd)。圖3.4IGV瀏覽器4表達水平分一個表達水平的直接體現(xiàn)就是其轉錄本的豐度情況，轉錄本豐度程度越高，則表達水平越高。在RNA-seq分析中，我們可以通過定位到組區(qū)域或編碼區(qū)的序列(reads)的計數(shù)來估計的表達水平。Reads計數(shù)除了與的真實表達水平成正比外，還與的長度和深度成正相關。為了使不同、不同實驗間估計的表達水平具有可比性，人們引入了RPKM的概念，RPKM(RadsPerKioassprillonreds)是每百萬reads中來自某一每千堿基長度的reads數(shù)目。RPKM同時考慮了測序深度和長度對reads計數(shù)的影響，是目前最為常用的表達水平估算方法(Mortaavietal,008)。結果文件分別統(tǒng)計了不同表達水平下的數(shù)量以及單個的表達水平。一般情況下，RPKM數(shù)值0.1或者1作為判斷是否表達的閾值，不同的文獻所采用的閾值不同。表4.1不同表達水平區(qū)間的數(shù)量統(tǒng)計RPKM0-1-3-15-2666(60表4.2表達水平統(tǒng)計76305RNA-seq表達水平的飽和曲線檢定量飽和曲線檢查反映了表達水平定量對數(shù)據(jù)量的要求。表達量越高的，就越容易被準確定量；反之，表達量低的基因，需要較大的數(shù)據(jù)量才能被準確定量。表達水平的飽和曲線的體算法描述如下：分別對10%、20%、30%……90%的總體數(shù)據(jù)單獨進行定量分析，并把所有數(shù)據(jù)條件下得到的的表達水平作為最終的數(shù)值。用每個百分比條件下求出的單個的RPKM數(shù)值和最終對應的表達水平數(shù)值進行比較，如果差異小于15%，則認為這個在這個條件下定量是準確的。圖5.1定量飽和曲線檢查分布橫坐標代表定位 組上的reads數(shù)占總reads數(shù)的百分比，縱坐標代表定量誤差在15%以內的的比RNA-Seq生物學重復是任何生物學實驗所必須的，高通量技術也不例外(Hansenetl.)。生物學重復主要有兩個用途：一個是證明所涉及的生物學實驗操作是可以重復的且變異不大，另一個為后續(xù)的差異分析所需要的。樣品間表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理性的重要指標。相關系數(shù)越接近1，表明樣品之間表達模式的相似度越高。Encode計劃建議生物學重復皮爾遜相關系數(shù)的平方(R2)大于0.92(理想的取樣和實驗條件下)。具體的項目操作中，我們要求R2至少要大于0.8，否則需要對樣品做出合適的解釋，或者重新進行實驗。圖5.2RNA-Seq重復相關性檢R2：pearson6差異表達分 表達水平對通過所有的RPKM的分布圖以及盒形圖對不同實驗條件下的表達水平進行比較。對于同一實驗條件下的重復樣品，最終RPKM為所有重復數(shù)據(jù)的平均值圖6.1不同實驗條件下表達水平比對RPKM分布圖(圖一)的橫坐標為log10(RPKM),縱坐標為的密度。RPKM盒形圖(圖二)的橫坐標為樣品名稱，縱坐標為log10(RPKM)，每個區(qū)域的盒形圖對差異表達列etal,2010）進行分析：該分析方法基于的模型是負二項分布，第i個在第j個樣本中的readcount值為Kij，則Kij～對于無生物學重復的樣品，先采用TMM對readcount數(shù)據(jù)進行標準化處理，之后用DEGseq進行差異分析。差異表達列表如下表6.2差異列3105.1372e-3.9323e-301.6497e-2.3834e-20344e-6.0811e-48119478e-1.2765e-差異列表主要包括的內容Gene_id:編readcount_Sample1：校正后樣品1的readcountreadcount_Sample2：校正后樣品2的readcountlog2FoldChange:pvalue(pval):統(tǒng)計學差異顯著性qvalue(padj):校正后的pvalue。qvalue越小，表 表達差異越顯差異表達篩用火山圖可以推斷差異的整體分布情況，對于無生物學重復的實驗，為消除生物學變異，我們從差異倍數(shù)和顯著水平兩個水平進行評估，對差異進行篩選，閾值設定一般為:|log2(FodChange)|>1且qvalue<0.005。對于有生物學重復的實驗，由于DESeq已經(jīng)進行了生物學變異的消除，我們對差異篩選的標準一般為:padj<005。圖6.3差異火山有顯著性差異表達 用紅色點表示；橫坐標代 在不同樣本中表達倍數(shù)變化；縱坐標代 表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著差異聚類分聚類分析用于判斷差異在不同實驗條件下的表達模式；通過將表達模式相同或相近的成類，從而識別未知的功能或已知的未知功能；因為這些同類的可能具有相似的功能，或是共同參與同一代謝過程或細胞通路。以不同實驗條件下的差異的RPKM值為表達水平，做層次聚類(hierarchicallusering)分析，不同的顏色的區(qū)域代表不同的聚類分組信息，同組內的表達模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程。除了差異表達量rpkm層次聚類分析，我們對還分別用H-cluster、K-means和SOM等三種方法對差異的相對表達水平值log2(ratios)進行聚類。不同的聚類算法分別將差異分為若干cluster，同一cluster中的在不同的處理條件下具有相似的表達水平變化趨勢。圖6.4差異聚類圖一為整體rpkm層次聚類圖，以log10RPKM值進行聚類，紅色表示高表達，藍色表示低表達。顏色從紅到藍，表示log10(RPKM)從大到??；圖二為log2(ratios)折線圖，每個子圖中的灰色線條表示一個cluster中的在不同實驗條件下相對表達量的折線圖，藍色線條表示這個cluster中的所有在不同實驗條件下相對表達量的平均值的折線圖，x軸表示實驗條件，y軸表示相對表達量差異GO富集分GeneOnology（簡稱GO,）是功能國際標準分類體系。根據(jù)實驗目的篩選差異后，研究差異在GeneOntology中的分布狀況將闡明實驗中樣本差異在功能上的體現(xiàn)。GO富集分析方法為GOseq（Youngetal,2010）,此方法基于Walleniusnon-entralhype-geomtricistributon。相對于普通的超幾何分布(Hyper-geomericdistribuion)，此分布的特點是從某個類別中抽取的概率與從某個類別之外抽取一個的概率是不同的，這種概率的不同是通過對長度的偏進行估計得到的，從而能更為準確地計算出GOterm被差異富集的概率。差異GO富集列表7.1差異GO富集列cell1.2529e-1.7778e-localizationof1.2529e-1.7778e-ciliaryorflagellar4.2065e-39794e-cellularcomponent1.717e-12182e-結果表格詳細內容如下GO_accession：GeneOntology數(shù)據(jù)庫中唯一的Description：GeneOntology功能的描述Term_type：該GO的類別( onent：細胞組分；biological_prcess：生物學過程；molecular_funtion：功能)Over_represented_pValue：富集分析統(tǒng)計學顯Corrected_pValue：矯正后的P-Value，一般情況下，P-value<0.05該功能為富集DEG_item：與該GO相關的差異的數(shù)DEG_list：GO注釋的差 數(shù)差異GO富集DAG有向無環(huán)圖(DirectdAycicGrah，DAG)為差異GO富集分析結果的圖形化展示方式，分支代表包含關系，從上至下所定義的功能范圍越來越小，一般選取GO富集分析的結果前10位作為有向無環(huán)圖的主節(jié)點，并通過包含關系，將相關聯(lián)的GOTerm一起展示，顏色的深淺代表富集程度。我們的項目中分別繪制生物過程(bioogiclroess)、分子功能(moleclarfucton)和細胞組分(celulrompnet)的DAG圖。圖7.2GO富集有向無每個節(jié)點代表一個GO術語，方框代表的是富集程度為TOP10的GO，顏色的深淺代表富集程度，顏色越深就表示富集程度越高，每個節(jié)點上展示了該TERM及富集分析的p-value差異GO富集柱狀差異GO富集柱狀圖，直觀的反映出在生物過程(biologicalprocess)、細胞組分(cellularcomponent)和分子功能(molecularfunction)富集的GOterm上差異的個數(shù)分布情況。我們挑選了富集最顯著的30個GOterm在圖中展示，如果不足30圖7.3GO富集柱狀圖一：縱坐標為富集的GOterm，橫坐標為該term中差異個數(shù)。不同顏色用來區(qū)分生物過程細胞組分和分子功能，帶“*”為富集的GOterm圖二：對圖一中的GO，按生物過程細胞組分和分子功能三大類別及差異 差異KEGG富集分在生物體內，不同相協(xié)調行使其生物學功能，通過Pathway顯著性富集能確定差異表達參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。KEGG（KyotoEncyclopediafGenesndGenos）是有關Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(Kanehisa,2008）。Pathwa性富集分析以KEGGPathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個組背景相比，在差異表達中顯著性富集的Pathway。差異KEGG富集列表8.1差異KEGG富集列SampleP-CorrectedP-FlagellarKEGGponentKEGG553887613552e-252018864166e-HistidineKEGG221572423431e-6.72103017741e-BacterialKEGG0結果表格詳細內容如下#Term：KEGG通路的描述信息Id：KEGG數(shù)據(jù)庫中通路唯一Samplenumber：該通路下差異的個數(shù)Backgroundnumber：該通路下的個數(shù)P-value：富集分析統(tǒng)計學顯著CorrectedP-value：矯正后的統(tǒng)計學顯著水平，一般情況下，P-value0.05該功能為富集差異KEGG富集散點散點圖是KEGG富集分析結果的圖形化展示方式。在此圖中，KEGG富集程度通過Richfactr、Qvlue和富集到此通的個數(shù)來衡量。其中Richfactr指差異表達的中位于該pathway條目的數(shù)目與所有有注釋中位于該pathway條目的總數(shù)的比值。Richfacor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做過多重假設檢驗校正之后的Pvalue，Qalue的取值范圍為[0,1]，越接近于零，表示富集越顯著。我們挑選了富集最顯著的0條typwy0圖8.2差異KEGG富集散點縱軸表示pathway名稱，橫軸表示 factor，點的大小表示此pathway中差異表達個數(shù)多少，而點的顏色對應于不同的Qvalue范富集KEGG通路將差異富集出的通路圖展示出來，通路圖中，包含上調的KO節(jié)點標紅色，包含下調的KO節(jié)點標綠色，包含上下調的標黃色。鼠標懸停于標記的KO節(jié)點，彈出差異細節(jié)框，標色同上，括號中數(shù)字為log2(Foldchang)。以上步驟可脫機實現(xiàn)，如連接互聯(lián)網(wǎng)，點擊各個節(jié)點，可以連接到KEGG數(shù)據(jù)庫中各個KO的具體信息頁。圖8.3著富集的KEGGpathway代謝通路SNP和InDelSNP全稱SingleNucleoidePlymorhisms，是指在組上由單個核苷酸變異形成的遺傳標記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。從理論上來看每一個SNP位點都可以有4種不同的變異形式，但實際上發(fā)生的只有兩種，即轉換和顛換，二者之比為1:2。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉換為T，原因是CG中的C常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。InDel(insertio-deleion)是指相對于參考組，樣本中發(fā)生的小片段的插入缺失，該插入缺失可能含一個或多個堿基。我們通過samtools和picard-tools等工具對比對結果進行坐標排序、去掉重復的reads等處理，最后通過變異檢測軟件GATK(McKennaetal2010)分別進行SNPCalling和InDelCalling，并對原始結果進行過濾，得到如下表形式的分析結果。其中表9SNP分析結TCTGAGAG#CHROM：SNP位點所在othercoloums：每 該位點 型(0與REF一致；1與ALT一致；.缺少數(shù)據(jù)支持用Rockhopper軟件(R.McClur,etal,213)將結果根據(jù)參照參考組進行組裝，并與已注釋的模型進行比較，發(fā)現(xiàn)新的未知轉錄本區(qū)域。通過Blastx與nr庫作比對，對新預測的轉錄本區(qū)域進行注釋，將能注釋上的轉錄本區(qū)域作為具有編碼潛能的新轉錄本區(qū)域。表10新轉錄本注釋結- -- +轉錄本編轉錄起始位轉錄終止位鏈方NR_GI:比對到NR庫的的GenbankNR_ID:比對到NR庫 的序列 結構分原核生物功能上關的幾個往往串聯(lián)排列在一起，構子(Operon)結構作為的表達單元，受上游共同的調控區(qū)和下游轉錄終止信號的調控。錄時，幾個轉錄在一條mRNA鏈上，再分別翻譯成各自不同的蛋白質。原核生物結構和調控模式如下圖所示：我們通過Rockhopper軟件，根據(jù)reads在組上的分布情況，對子、轉錄起始位點(TranscriptionStartSite,TSS)和轉錄終止位點(TranscriptionTerminationSite,TTS)進行預測。然后提取轉錄起始位點上游700bp序列，通過軟件Virtual

表11.1子預測結Numberof+4-3pdxJ,XAC0013,+2XAC0015,+2XAC0021,Start：第一個的起始坐Stop：最后一個的終止坐Strand：鏈方NumberofGenes：個Genes：名TSS和TTS預表11.2TSS和TTS預測結++++TSS：轉錄起始位點TTS：轉錄終止位點Strand：鏈方Genes：名表11.3啟動子預Sequence(species)StartAbrB|Bacillussubtilis(strain+7AlgU(-10)|Pseudomonasaeruginosa(strainATCC15692/+5AlgU(-10)|Pseudomonasaeruginosa(strainATCC15692/+5AlgU(-10)|Pseudomonasaeruginosa(strainATCC15692/+5SequenceID入的序列(species)：位置矩陣StartPosition：啟動子EndPosition動子終止位點坐Strand方Score:精準Sequence序UTRUTR我們根據(jù)轉錄起始位點(轉錄終止位點)和翻譯起始位點(翻譯終止位點)信息，提取5'UTR(3'UTR)序列，并對其長度分布情況進行統(tǒng)計。針對5’UTR，用RBSfinder軟件對SD序列進行預測；針對3’UTR，用TransTermHP軟件對不依賴σ因子的終止子進行預測。圖12.1UTR長度分布橫軸表示UTR長度區(qū)間，縱軸是不同區(qū)間UTR密度的統(tǒng)計，紅色虛線代表UTR5’UTRSD序列預表12.2SD序列預測結++-+gene_id：編Start：起始坐Stop：終止坐Strand：鏈方Pattern：SD序列信Position：SD序列起始坐3’UTR不依賴σ因子的終止子預表12.3終止子預----GCGCGC-gene_id：編Term_start：終止子起始坐Term_end：終止子終止坐strand：鏈方5'_tail：莖環(huán)結構5'5'_stem：莖環(huán)結構5'loop：莖環(huán)結構環(huán)序3'_stem：莖環(huán)結構3'3'_tail：莖環(huán)結構3'Cis-natualanisensetrancript(cis-ATs)反義轉錄本是由源DNA鏈相同區(qū)域轉錄的內生RNA分子，與正義轉錄本存在部分收斂或分散方向的重復。據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)，反義轉錄本是重要的生物機理，主要通過表觀遺傳學上的改變，對進行調控。反義轉錄本分為三種類型：enclosed（全部包含）、convergent(3'3')和divergent(5'-5')。對于鏈特異性建庫的RNA-seq數(shù)據(jù)，可以鑒定其反義轉錄本在組上的位置、種類以及數(shù)量等。表13反義轉錄本預測結(ISxac3(ISxac3(ISxac3(ISxac3plus_transcript_id：正鏈轉錄本編plus_start：正鏈轉錄本起始位plus_end：正鏈轉錄本終止plus_length：正鏈轉錄本長(11)types：反義轉錄本類型(包括：enclosed、convergent和divergent) sRNA細菌中，長度在50～500nt的非編碼RNA通常定義為小RNA(smallNA,sRN)。用Rockhopper軟件發(fā)現(xiàn)新的間區(qū)轉錄本，通過Blastx與nr庫作比對，對新預測的轉本區(qū)域進行注釋，將注釋不上的轉錄本作為候選的非編碼sRNA。通過RNAfold軟件和IntaRNA對候選的sRNA分別進行二級結構預測和靶預測。sRNA圖14.1sRNA長度分布橫軸表示sRNA長度區(qū)間，縱軸是不同區(qū)間sRNA密度的統(tǒng)計，紅色虛線代表sRNA長度的均sRNA圖14.2sRNA二級結sRNA 預

表14.3sRNA靶預測結11--382--1--416--1--234--93--196--sRNA_id：sRNA編mRNA_id：靶編energy(kcal/mol)：自由sRNA_position：sRNA互補位mRNA_position： 互補位四、參考文獻Anders,S.(2010).HTSeq:ysinghigh-throughputsequencingdatawithAnders,S.,andHuber,W.(2010).Differentialexpressionysisforsequencecountdata.GenomeBiol.(DESeq)Anders,S.andHuber,W.(2012).DifferentialexpressionofRNA-Seqdataatthegenelevel-theDESeqpackage.(DEseq)Busch,A.,A.S.Richter,etal.(2008).IntaRNA:efficientpredictionofbacterialsRNAtargetsincorporatingtargetsiteaccessbilityandseedregions.Hofacker,I.L.andP.F.Stadler(2006).MemoryefficientfoldingalgorithmsforcircularRNAsecondarystructures.Bioinformatics.(RNAfold)Kanehisa,M.,M.Araki,etal.(2008).KEGGforlinkinggenomestolifeandtheenvironment.Nucleicacidsresearch.(KEGG)Kingsford,C.L.,K.Ayanbule,etal.(2007).Rapid,accurate,computationaldiscoveryofRho-independenttranscriptionterminatorsilluminatestheirrelationshiptoDNAuptake.Genomebiology.(TransTermHP)Langmead,B.,Trapnell,C.,Pop,M.&Salzberg,S.L.(2009).Ultrafastandmemory-efficientalignmentofshortDNAsequencestothehumangenome.GenomeBiol.(Bowtie)Langmead,B.andS.L.Salzberg(2012).Fastgapped-readalignmentwithBowtie2.Naturemethods.(BowtieMao,X.,Cai,T.,Olyarchuk,J.G.,Wei,L.(1995).AutomatedgenomeannotationandpathwayidentificationusingtheKEGGOrthology(KO)asaco