響應面優(yōu)化香草醛

響應面優(yōu)化香草醛-冰醋酸-高氯酸法測定金花茶葉中總皂甙含量唐昭領1，莫建光2，黃艷2【摘要】摘要：在單因素試驗的基礎上，采用響應面試驗，優(yōu)化了分光光度法測定金花茶總皂甙的顯色反應條件。得到的最佳反應條件為：5%香草醛-冰醋酸溶液0.35mL,高氯酸1.0mL,反應溫度80工，反應時間25min，測定波長540nm。在此條件下，人參皂甙Rg1在0~114.2pg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系，r=0.9991。該方法的相對標準偏差為1.36%，穩(wěn)定性相對標準偏差為2.08%，平均回收率為98.22%。期刊名稱】廣東農(nóng)業(yè)科學年(卷),期】2014(041)013總頁數(shù)】5關鍵詞】金花茶；總皂甙；分光光度法；響應面法金花茶〔Camelliachrysanth(Hu)Tuyama〕系山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)金花茶組(sect.Chrysantha)植物，是中國特產(chǎn)的傳統(tǒng)名茶，也是世界性的名貴觀賞植物。金花茶以其花瓣是黃色而著名于世，被列為國家一級重點保護植物之首［1］。目前世界上已報道的金花茶有40個種和5個變種，主要分布在我國和越南，其中越南10個，我國四川、云南、貴州各有1個，其余分布在廣西西南部北回歸線以南的北熱帶綠季雨林中［2］。金花茶化學成分較為復雜，目前國內(nèi)外集中于研究金花茶的活性成分的提取、分離純化及各種生理活性評價，金花茶中的活性物質主要有皂甙、黃酮、茶多酚、茶多糖等［3-5］，并證實了金花茶中物質具有良好的抗氧化［6］、抗過敏［7］、降血脂［8］、抗癌［9］等活性。金花茶中含有豐富的皂甙類物質，目前，常用的測定方法主要有分光光度法［10］、氣相色譜法［11］、高效液相色譜法［12］、薄層掃描色譜法［13］、重量法［14］等。分光光度法雖屬經(jīng)典、成熟的方法，但準確性不高。色譜法是目前測定皂甙含量廣泛采用的方法，具有分析速度快、分析精度高等優(yōu)點，但儀器昂貴，操作要求高。重量法雖然對儀器設備要求較低，但所需樣品量大，操作不方便、誤差也大。本文利用香草醛-高氯酸試劑與三萜皂甙反應顯色特性，對顯色體系進行較為系統(tǒng)的研究，同時采用響應面法進一步優(yōu)化顯色體系，并以相對標準偏差、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及加樣回收率為指標進行方法學驗證，取得了可靠的試驗結果。材料與方法試驗材料金花茶葉采自廣西防城港市十萬大山，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為顯脈金花茶，曬干粉碎后過孔徑0.178mm的篩備用。乙醇、甲醇、乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、高氯酸、香草醛、冰醋酸、硫酸均為國產(chǎn)分析純；人參皂甙Rg1（編號GR0507，色譜純＞98%）購于南京廣潤生物制品有限公司。儀器與設備XS-205型電子天平（瑞士梅特勒公司）；超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-2-3型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；R501型旋轉蒸發(fā)儀（上海橫平儀器儀表廠）；CR22G型高速冷凍離心機（日本日立）；LGJ-18B型冷凍干燥機（北京四環(huán)科學儀器廠）；UV-2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。試驗方法1.3.1金花茶葉總皂甙提取及分離液的制備精確稱量50g金花茶葉粉末置于超聲提取器中，加入蒸餾水，固液比為1：20,于80°C下以25KHz浸提2h,反復提取兩次，合并提取液，過濾濃縮后得金花浸出液100mL。取該浸出液100mL慢慢加入3倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌，溶液中不斷生成絮狀沉淀，置于4C冰箱內(nèi)靜置24h后，以4000r/min離心分離，取上清液進行旋轉蒸發(fā)使乙醇幾乎揮發(fā)完全后，加入等體積的無水乙醚進行萃取，棄去上層乙醚層，反復3次，直至上層幾乎無色，下層溶液再濃縮，得到金花茶總皂甙分離液100mL;準確吸取1.0mL分離液，用甲醇溶液定溶到100mL備用。1.3.2主要試劑的配制準確稱取人參皂甙Rg1標準品5.71mg，用甲醇超聲溶解后定容至25mL容量瓶中，得濃度為0.2284mg/mL的標準溶液，置于冰箱中保存?zhèn)溆?；準確稱取無水香草醛0.5g于50mL燒杯中，加入5mL冰醋酸溶解后，轉移至10mL容量瓶中，定容至刻度，即為5%香草醛-冰醋酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。1.3.3測定方法準確吸取人參皂甙Rg1標準溶液0.1mL加入具塞比色管中，水浴揮干甲醇，加入適量新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液，1min后，再加入適量高氯酸，搖勻，于一定溫度的水浴中加熱，準確計時，一定時間后取出，用冰水浴冷卻10min，冷卻后加入5.0mL冰醋酸，搖勻，靜置15min后于540nm處測定吸光值，同時作空白對照。1.3.4顯色條件單因素試驗香草醛-冰醋酸-高氯酸法測定皂甙的主要影響因素有香草醛-冰醋酸溶液用量、高氯酸用量、反應溫度和反應時間等，本研究采用單因素試驗，分別考察該4個因素對金花茶皂甙測定的影響。1.3.5響應面試驗設計在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，進一步選取5%香草醛-冰醋酸溶液用量、高氯酸用量、反應溫度和反應時間為自變量進行4因素3水平的響應面分析試驗[15]。利用Design-Expert7.0軟件對試驗進行回歸分析，以吸光度為指標獲得測定金花茶葉總皂甙的最佳顯色條件。響應面試驗因素水平見表1。精密度試驗為了驗證試驗的可靠性，準確吸取標準溶液5份，采用1.3.5得到的最優(yōu)顯色條件進行顯色試驗，在540nm處測定其吸光度，比較測定吸光度值與理論值，并計算RSD值。穩(wěn)定性試驗針對上述響應面優(yōu)化后的最優(yōu)顯色條件進行穩(wěn)定性試驗。精密吸取1.3.1制備的樣品稀釋液進行顯色試驗，測吸光度，每隔20min測1次，測定7次，計算其測定結果的RSD值。標準曲線的建立從0.2284mg/mL人參皂甙Rg1標準溶液中精密吸取0.0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL對照品，分別加入10mL的具塞試管中，水浴揮盡溶劑，按響應面優(yōu)化后得到的最優(yōu)條件進行顯色，測定吸光值，以吸光值為縱坐標，以標準品人參皂甙Rg1含量為橫坐標進行繪制回歸方程。樣品測定及加標回收試驗精密吸取1.3.1制備的備用液8份，每份0.10mL，前3份不加標準溶液，后5份分別加入0.10mL人參皂甙Rg1,即22.84pg人參皂甙Rg1。按1.3.5得到的最優(yōu)顯色條件進行顯色測定，并計算其回收率。結果與分析單因素試驗結果5%香草醛-冰醋酸溶液用量對吸光度的影響準確吸取0.1mL對照品人參皂甙Rgl6份，分別置于6個小試管中，揮干甲醇后，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0mL高氯酸，于70C恒溫水浴鍋中加熱20min后取出，立即以冰水浴冷卻。冷卻后再相應地加入4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4mL冰醋酸，使之總體積為6mL，搖勻，靜置15min后，在540nm波長處測定吸光值，結果見圖1。當5%香草醛-冰醋酸溶液用量為0.3mL時，吸光值最大。因此，在比色法中，5%香草醛-冰醋酸溶液最佳用量為0.3mL。2.1.2高氯酸用量對吸光度的影響準確吸取0.1mL對照品人參皂甙Rgl6份，分別置于6個小試管中，揮干甲醇后，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL的高氯酸溶液和0.3mL的5%香草醛-冰醋酸溶液，于70C恒溫水浴鍋中加熱20min后取出，立即以冰水浴冷卻。冷卻后再相應地加入5.5、5.35.1、4.9、4.7、4.5mL冰醋酸，使之總體積為6mL，搖勻，靜置15min后,在540nm波長處測定吸光值，結果見圖2。當高氯酸用量在0.2一1.0mL時,吸光值不斷上升，高氯酸用量在1.0—1.2mL時，吸光值變化不大。因此選擇0.8、1.0、1.2mL為響應面試驗的條件。2.1.3反應溫度對吸光度的影響準確吸取0.1mL對照品人參皂甙Rg16份，分別置于6個小試管中，揮干甲醇后，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL和高氯酸溶液1.0mL，再分別置于30、40、50、60、70、80C水浴鍋中加熱20min后取出，立即以冰水浴冷卻。冷卻后加入4.7mL冰醋酸，使之總體積為6mL，搖勻，靜置15min后，在540nm波長處測定吸光值，結果見圖3。由圖3可知，溶液的吸光度隨溫度的升高而增大，但超過70C，溫度對吸光度影響不大，且溫度過高，容易出現(xiàn)部分碳化現(xiàn)象，故選擇60、70.80C為響應面試驗的條件。2.1.4反應時間對吸光度的影響準確吸取0.1mL對照品人參皂甙Rg16份，分別置于6個小試管中，揮干甲醇后，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL和高氯酸溶液1.0mL,于70工恒溫水浴鍋中分別加熱5、10、15、20、25、30min，加熱后立即以冰水浴冷卻。冷卻后加入4.7mL冰醋酸，使之總體積為6mL,搖勻，靜置15min后，在540nm波長處測定吸光值，結果見圖4。由圖4可知，當加熱時間超過20min，吸光度變化不大，趨于穩(wěn)定，即顯色反應達到平衡。故選擇加熱時間為15、20、25min為響應面試驗的條件。2.2響應面試驗結果響應面試驗設計及結果通過響應面法對5%香草醛-冰醋酸溶液用量、高氯酸用量、反應溫度和反應時間4個單因素分析得到以下試驗方案及結果見表2。運用Design-Expert7.0統(tǒng)計分析軟件對表2的數(shù)據(jù)進行分析,得到結果如表3所示。以吸光度為響應值,經(jīng)回歸擬合后各試驗因子對響應值的回歸方程表達式為：由表3可看出，模型的Pv0.0001,也就是說只有0.01%的幾率會出現(xiàn)測定結果不符合二次方程,表明模型方程極顯著,不同處理間的差異極顯著；失擬項P=0.1180>0.05,表明失擬項相對于絕對誤差是不顯著的；模型系數(shù)R2=0.9873表明模型充分擬合試驗數(shù)據(jù)［16］,該方程擬合程度較好。離散系數(shù)(coeflcientofvariation,CV)表示試驗的精確度。其值越低，試驗穩(wěn)定性越好［1刀。本試驗CV=1.04%，具有較好的穩(wěn)定性，說明試驗操作可信，可以用回歸方程代替試驗真實點對金花茶皂甙測定結果進行分析和預測。此外從表3中的P值可知，方程中A、B、C、D、AB、BD、A2、B2及C2對Y值的影響極顯著，CD和D2對Y值的影響顯著。綜上所述，該回歸方程為香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色體系條件提供了一個良好的模型，可以利用該回歸方程確定測定金花茶葉中總皂甙的顯色條件。在所選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對結果的影響排序為反應溫度＞5%香草醛-冰醋酸用量〉反應時間〉高氯酸用量。驗證試驗及精密度試驗結果根據(jù)所得的回歸模型，由Design-Expert7.0軟件對實驗參數(shù)進一步優(yōu)化，可得出最優(yōu)條件為：5%香草醛-冰醋酸用量0.34mL，高氯酸用量0.99mL，反應溫度80.0°C,反應時間為25.0min，在此條件下，金花茶皂甙吸光值理論上可達0.616。考慮到實際操作的可行性，將得出的最優(yōu)條件理論值修正為：5%香草醛-冰醋酸用量為0.35mL，高氯酸用量為1.0mL，反應溫度為80.0C,反應時間為25.0min。在該條件下進行5次平行試驗。5次所測得的吸光值為0.621、0.604、0.599、0.607、0.611、0.608，平均值為0.608，RSD為1.36%。由此可知實際測得吸光均值0.608與理論值0.616相差不大，說明該實驗方法的重現(xiàn)性、精密度較好，同時說明該響應面法得到的顯色參數(shù)可靠，可以對金花茶皂甙測定的顯色條件進行模擬。2.2.3穩(wěn)定性試驗結果在120min內(nèi)從0min開始測定，每隔20min測定1次吸光值，共測定7次。7次所測得的吸光值為0.628、0.619、0.607、0.5980.597、0.595、0.600，平均值為0.606，RSD為2.08%。表明對照品顯色后的吸光值在120min內(nèi)基本穩(wěn)定，可滿足日常分析要求。2.2.4標準曲線的繪制當標準溶液含量在0-114.2pg范圍內(nèi)吸光度（A）隨著含量（pg）的增加顯線性變化，線性方程為y=0.007x+0.0042，線性相關系數(shù)為0.9991，線性關系良好。2.2.5樣品測定及加標回收率試驗結果由表4可見，加標回收率范圍為95.10%~101.36%，加標回收率均值為98.22%，相對標準偏差為2.43%。結果表明加標回收率較高，該方法可行、可靠，準確度較高。結論金花茶總皂甙與香草醛-冰醋酸、高氯酸的反應非常靈敏，顯色劑過多或過少，會導致反應的不完全，在測定過程中不穩(wěn)定，或不在適宜的范圍內(nèi)，誤差較大。本試驗較全面的研究了顯色反應體系，在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗，得到分光光度法測定金花茶總皂甙時顯色反應的最優(yōu)條件：5%香草醛-冰醋酸用量0.35mL，高氯酸用量1.0mL，反應溫度80.0工，反應時間25.0min，此條件下測定金花茶總皂甙的準確度高，平均回收率達到98.22%，相對標準偏差為2.43%。該方法簡單、快速，成本較低，適用于不具備液相、氣相薄層掃描色譜實驗室的總皂甙的測定。參考文獻：中國科學院植物研究所?中國高等植物科屬檢索表[M].北京:科學出版社,1979:25.韋霄，蔣運生,韋記青，等?珍稀瀕危植物金花茶地理分布與生境調查研究J].生態(tài)環(huán)境,2007,16(3):895-899.蘇琳，莫建光,韋英亮，等?金花茶葉皂苷類成分研究J].中草藥,2012,43⑸:877-879.彭曉，于大永，馮寶民，等?金花茶花化學成分的研究J]?廣西植物,2011,31(4):550-553.覃小玲，史艷財，韋霄，等.FTIR比較分析與鑒定3種金花茶葉片中的化學成分[J].光譜實驗室,2012,29(3):1303-1307.⑹韋霄，黃興賢,蔣運生，等.3種金花茶組植物提取物的抗氧化活性比較[J].中國中藥雜志,2011(5):640.王永奇，彭曉，唐前，等?金花茶組植物抗IgE介導I型過敏反應的活性篩選[J]?中南藥學,2009,7(10):721-724.韋璐，秦小明，林華娟，等?金花茶多糖的降血脂功能研究[J].食品科技,2008,20(7):147-149.唐小嵐,段小嫻,蘇建家,等.金花茶和銀杏葉對2-乙基亞硝胺致大鼠肝癌前病變抑制作用的初步研究[J].實用癌癥雜志,2007,22(3):224-227.黎海彬，張敏，王邕，等?羅漢果中三萜皂苷的含量測定[J].食品科學,2006,27(6):171-173.[11]都述虎,劉文英?穿龍薯蕷總皂苷中薯蕷皂苷元含量的毛細管氣相色譜法研究[J].藥物分析