毛細管電泳原理及分析策略()

毛細管電泳原理及分析策略()第一頁，共八十頁，2022年，8月28日貝克曼高效毛細管電泳儀第二頁，共八十頁，2022年，8月28日毛細管電泳是帶電粒子在電場力的驅(qū)動下，在毛細管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細管電泳(CapillaryElectrophoresis,CE)。

第三頁，共八十頁，2022年，8月28日

毛細管電泳的原理

1裝置

毛細管數(shù)據(jù)處理電極檢測器電極試樣緩沖液高壓電源

（可高至30KV）

第四頁，共八十頁，2022年，8月28日

2電泳和電滲

電泳是指在電場作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動的現(xiàn)象。電滲是指在電場作用下，毛細管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。第五頁，共八十頁，2022年，8月28日

2電泳和電滲

電泳行為與特性使用淌度描述

即單位場強(E)下離子的平均電泳速度υ

μep=υ/E實驗中，只發(fā)生電泳時有效淌度

μef=υef﹒

(L/V)=(

l/tm)﹒(L/V)

毛細管有效長度遷移時間毛細管總長度電壓第六頁，共八十頁，2022年，8月28日

2電泳和電滲

電滲與固液界面的雙電層有著密切的關(guān)系在毛細管壁雙電層的擴散層中的陽離子，相對于毛細管壁的負電荷表面，形成一個圓筒形的陽離子鞘，在電場作用下，溶劑化了的陽離子，沿滑動面與緊密層作相對運動，攜帶著溶劑一起向陰極遷移，便形成了電滲流（electroosmoticflow,EOF）。第七頁，共八十頁，2022年，8月28日固液兩相間的總電勢-熱力學(xué)電勢-φ0Zeta電勢-ζ

第八頁，共八十頁，2022年，8月28日

2電泳和電滲

電滲流的流型特點電滲流HPLC塞流層流

第九頁，共八十頁，2022年，8月28日

2電泳和電滲

電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)電滲流速度毛細管有效長度

電滲流流出時間

電場強度第十頁，共八十頁，2022年，8月28日第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的意義電泳過程中，伴隨著電滲現(xiàn)象電滲流的速度比電泳速度快5－7倍利用電滲流可將正、負離子或中性分子一起向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時完成正、負離子的分離分析電滲流是毛細管電泳分離的重要參數(shù)控制電滲流的大小和方向，可提高毛細管電泳分離的效率、重現(xiàn)性、分離度。

分情況而論第十一頁，共八十頁，2022年，8月28日

2電泳和電滲

改變電滲流的方法改變外加徑向電場改變緩沖液成分和濃度Zeta電勢改變緩沖液pH加入添加劑改變溫度

粘度

鹽-離子強度表面活性劑μeo正比于Zeta電勢和介質(zhì)的介電常數(shù)反比于介質(zhì)的黏度Zeta電勢正比于雙電層厚度和界面有效電荷密度反比于介質(zhì)的介電常數(shù)第十二頁，共八十頁，2022年，8月28日表觀電泳淌度μap

μap=υap/E

υap為離子的表觀遷移速度

υap=υef+υeo

μap=μef+μeo

2電泳和電滲

第十三頁，共八十頁，2022年，8月28日

3分離效率和分離度

分離效率柱效可以用理論塔板數(shù)n表示

n=(μep+μeo)Vl/(2DL)

毛細管電泳分離的柱效方程

理論塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W?)2實驗上可按上式求出理論塔板數(shù)χ為電泳圖上從起點至電泳峰最大值之間的距離

W?為電泳峰的半高峰寬

第十四頁，共八十頁，2022年，8月28日

3分離效率和分離度

分離度電泳中兩峰的分離度（Rs），也稱為分辨率，它表示了淌度相近的組分分開的能力，可表達為

Rs=（n

1/2/4）×（Δυ/υ平）Δυ相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差υ平為兩者的平均速度Δυ/υ平表示分離選擇性n為柱效第十五頁，共八十頁，2022年，8月28日分離度計算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分別為兩個組份的遷移時間W

為峰底的寬度

3分離效率和分離度

第十六頁，共八十頁，2022年，8月28日

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度展寬因素

焦耳熱進樣電泳擴散毛細管壁對組分的吸附

第十七頁，共八十頁，2022年，8月28日焦耳熱

細內(nèi)徑（<100μm），粗外徑的毛細管柱

溫度輪廓----黏度輪廓----速度輪廓

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

第十八頁，共八十頁，2022年，8月28日進樣

試樣導(dǎo)入毛細管柱時，總有一定的試樣區(qū)帶長度。細內(nèi)徑的毛細管柱時，進樣操作的要求更為嚴格。一般進樣區(qū)帶控制在柱長的1%電泳擴散

試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細管其它地方的濃度或電阻率不相等時，因兩個區(qū)域電場強度的差異，而引起區(qū)帶電分散。

μs---μb

峰前展或拖尾？

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

第十九頁，共八十頁，2022年，8月28日毛細管壁對組分的吸附

電泳峰拖尾或變形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用極端pH條件●加入中性鹽或兩性離子化合物●對毛細管內(nèi)壁進行涂層處理

需要注意：方法也會抑制或改變電滲流

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

第二十頁，共八十頁，2022年，8月28日CE分離原理-與模式有關(guān)毛細管區(qū)帶電泳（CZE）毛細管膠束電動色譜（MECC/MCKC）毛細管凝膠電泳（CGE）毛細管等電聚焦（cIEF）親和毛細管電泳（ACE）毛細管電色譜（CEC）第二十一頁，共八十頁，2022年，8月28日第一章毛細管區(qū)帶電泳樣品在電解液中泳動,根據(jù)物質(zhì)的荷/質(zhì)比差異來進行分離，比值愈大,跑得愈快第二十二頁，共八十頁，2022年，8月28日進樣方式壓力進樣電動進樣濃縮進樣第二十三頁，共八十頁，2022年，8月28日毛細管種類非涂層毛細管（裸管）內(nèi)壁涂層毛細管（涂層管）第二十四頁，共八十頁，2022年，8月28日非涂層毛細管-電滲流的概念第二十五頁，共八十頁，2022年，8月28日-H+高pH低pH第二十六頁，共八十頁，2022年，8月28日電滲流的特點EOF第二十七頁，共八十頁，2022年，8月28日-+純電泳狀態(tài)第二十八頁，共八十頁，2022年，8月28日-+EOF電泳+電滲流0tm(min)第二十九頁，共八十頁，2022年，8月28日電滲流的作用第三十頁，共八十頁，2022年，8月28日電滲流的活塞流特點HydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone第三十一頁，共八十頁，2022年，8月28日HydrodynamicflowParabolicResistancetoflowatsurfaceMorediffusion/broaderdetectionzoneEOFgivesplugflowMinimizesbandbroadeningNarrowsdetectionzone電滲流的活塞流特點第三十二頁，共八十頁，2022年，8月28日電滲流是CE中最大的驅(qū)動力來源之一第三十三頁，共八十頁，2022年，8月28日電滲流的正面及負面作用正面作用增加分離速度使得正、負電荷物質(zhì)同時分離負面作用減少分離時間和分離有效距離電滲流的波動極大的影響了遷移時間的重復(fù)性第三十四頁，共八十頁，2022年，8月28日影響電滲流的因素pH值

pH越高，電滲流越大離子強度離子強度越高，電滲流越小緩沖溶液添加劑離子型表面活性劑、有機溶劑、環(huán)糊精第三十五頁，共八十頁，2022年，8月28日電滲流隨pH的變化情況第三十六頁，共八十頁，2022年，8月28日控制電滲流的三個重要手段采用涂層毛細管，消除電滲流的影響改變pH，從而調(diào)整電滲流的大小。pH<3時電滲流很低；當pH>10以后，電滲流基本不增加添加劑：有機溶劑可以降低電滲流的大小，從而增加分離的有效距離；表面活性劑可以徹底改變電滲流的方向和大小，主要是在陰離子分析時使用第三十七頁，共八十頁，2022年，8月28日緩沖溶液的影響和選擇在CE中應(yīng)該根據(jù)以下性質(zhì)來選擇緩沖溶液：在所選的pH范圍內(nèi)有較強緩沖能力；在檢測波長處有低的紫外吸收；小的淌度（即大體積、低電荷離子）以降低所產(chǎn)生的電流。那些被稱為生物“優(yōu)良緩沖液”的，如Tris,borate,CAPS等特別有用，因為這些緩沖溶液中的離子一般較大，能夠在較高濃度下使用而不會產(chǎn)生大的電流，但一個潛在的缺點是這些大的緩沖離子有強的紫外吸收。第三十八頁，共八十頁，2022年，8月28日常用的CE緩沖體系磷酸鈉體系寬緩沖范圍硼酸鈉體系高pH范圍Tris-HCl體系低pH范圍醋酸-醋酸銨體系CE/MS常用體系第三十九頁，共八十頁，2022年，8月28日CZE分離條件的選擇毛細管類型--涂層還是非涂層？毛細管長度--長毛細管還是短毛細管？緩沖液體系--種類和pH值添加劑類型--甲醇|環(huán)糊精|乙腈檢測器選擇--紫外|二極管陣列|激光誘導(dǎo)熒光第四十頁，共八十頁，2022年，8月28日緩沖溶液的選擇

可先用磷酸緩沖體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（最佳）pH范圍后，再進一步細選出更好pH和緩沖試劑。磷酸鹽是毛細管電泳中最常用的緩沖體系之一，它的紫外吸收低，pH緩沖范圍比較寬（pH=1.5～13），但電導(dǎo)也比較大。第四十一頁，共八十頁，2022年，8月28日緩沖溶液及pH值的選擇

研究經(jīng)驗表明：對于蛋白質(zhì)、肽和氨基酸等兩性樣品，采用酸性（pH2）或堿性（pH＞9）分離條件，比較容易得到好的分離結(jié)果；糖類樣品通常在pH=9～11之間能獲得最佳分離；羧酸或其他樣品多在pH=5～9之間選擇分離條件。第四十二頁，共八十頁，2022年，8月28日緩沖溶液及pH值的選擇pH的選擇也和所用的毛細管種類有關(guān)，許多涂層毛細管只能在一定的pH范圍內(nèi)工作，例如聚丙烯酰胺涂層毛細管，在3＜pH＜8的范圍以外工作，其涂層容易水解失效。第四十三頁，共八十頁，2022年，8月28日緩沖溶液及pH值的選擇在相同的pH下，不同緩沖體系的分離效果不盡相同，有的可能相差甚遠。一般的經(jīng)驗是，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑，有可能就是最好的試劑。一個典型的例子是，在分離糖類和DNA等分子時優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因為硼酸根能與糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負電荷和分離度。硼酸緩沖試劑也適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分離。第四十四頁，共八十頁，2022年，8月28日緩沖溶液及pH值的選擇

緩沖試劑及pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需要優(yōu)化。緩沖試劑的濃度一般控制在10～200mmol/L之間。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼砂等，其濃度多控制在20mmol/L附近，而電導(dǎo)小的試劑如硼酸及HEPES等，其濃度可在100mmol/L以上。有時為了抑制蛋白質(zhì)吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的試劑濃度，此時要注意減少分離電壓，分析速度自然也將隨之降低。第四十五頁，共八十頁，2022年，8月28日添加劑的選擇目的：改善分離抑制分析物在毛細管上的吸附第四十六頁，共八十頁，2022年，8月28日添加劑的選擇甲醇|乙腈（5-50%）降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果增加非極性物質(zhì)的水溶性環(huán)糊精|SDS等表面活性劑增加分離選擇性，提高分析效果降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果非極性高分子聚合物掩蔽毛細管內(nèi)壁電荷，抑制分子吸附降低電滲流形成一定的分子篩，提高分子大小選擇性第四十七頁，共八十頁，2022年，8月28日第二章毛細管膠束電動色譜電解質(zhì)中加入表面活性劑(surfactant，例如SDS)，使之形成膠束（Micelle），樣品根據(jù)其疏水性(Hydrophobicity)強弱的差異，在膠束與電解質(zhì)的分配系數(shù)有所不同來進行分離

，樣品疏水性愈強，則進入膠束的機會愈大。通常物質(zhì)進入膠束后，泳動的速度會變慢，因此疏水性愈強的物質(zhì)則愈慢出來。第四十八頁，共八十頁，2022年，8月28日毛細管膠束電動色譜原理第四十九頁，共八十頁，2022年，8月28日SDS第五十頁，共八十頁，2022年，8月28日-+EOFMicellarElectrokineticChromatography(MEKC)第五十一頁，共八十頁，2022年，8月28日七種青霉素的分離CZE:20mM

Pi-Borate,pH8.5(B)MEKC:0.1MSDSin(A)soln.第五十二頁，共八十頁，2022年，8月28日膠束電動色譜的特點優(yōu)點增加對弱極性物質(zhì)分離的分離度在中藥分析、天然產(chǎn)物分析、農(nóng)藥分析中經(jīng)常使用缺點穩(wěn)定性不佳，達到好的重復(fù)性比較困難第五十三頁，共八十頁，2022年，8月28日第三章毛細管凝膠電泳毛細管內(nèi)先填充凝膠(例如polyacrylamide或cellulose)，此時凝膠會在毛細管內(nèi)形成分子篩，樣品依分子量的大小在毛細管內(nèi)移動速度不同而進行分離。主要用于核酸片斷及蛋白分子量分析第五十四頁，共八十頁，2022年，8月28日毛細管凝膠電泳第五十五頁，共八十頁，2022年，8月28日CE雙鏈及單鏈核酸分析45-寡核苷酸質(zhì)控1.02.03.0123456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS2110.015.0RelativeFluorescenceIntensitydsDNA片段(72bp-12Kbp)第五十六頁，共八十頁，2022年，8月28日CE-SDS蛋白分子量分析第五十七頁，共八十頁，2022年，8月28日第四章毛細管等電聚焦第五十八頁，共八十頁，2022年，8月28日第五章親和毛細管電泳

-分離條件基于CZE當在CZE樣品或緩沖液中引入抗原或抗體時，便可以用于研究和分析抗體或抗原，也可以利用這種方法對電泳峰進行特異性定性。顯然除抗原與抗體的選擇需要應(yīng)用生化知識外，其他方面的選擇與CZE等相同。用于研究分子間相互作用測定，分子構(gòu)型變化特定物質(zhì)檢測活性物質(zhì)篩選第五十九頁，共八十頁，2022年，8月28日ACE測定分子間結(jié)合常數(shù)與解離速率JAK2與SH2-B之間的相互作用研究第六十頁，共八十頁，2022年，8月28日CE藥物篩選第六十一頁，共八十頁，2022年，8月28日ACE用于相互作用篩選適體Aptamer類似于抗體，但可以體外合成，結(jié)合常數(shù)比抗體更高，有廣泛的藥物篩選和臨床診斷應(yīng)用潛力目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法篩選得到的IgEHIVtype1reversetranscriptaseThrombinAnti-thrombinIIITaqDNApolymerase第六十二頁，共八十頁，2022年，8月28日ACE用于相互作用篩選傳統(tǒng)篩選方法如親和色譜或者CEC篩選一個Aptamer需要4-6周而CE只需要幾天就可以了，大大提高了篩選速度--MicroScaleBioseparations2006第六十三頁，共八十頁，2022年，8月28日第六章檢測器選擇小分子檢測大分子檢測第六十四頁，共八十頁，2022年，8月28日CE檢測器種類及性能第六十五頁，共八十頁，2022年，8月28日小分子檢測有紫外吸收首先選擇二極管陣列檢測器或紫外檢測器無紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外檢測器檢測，如氨基酸、還原性糖等不可以衍生化的，可采用間接紫外法用紫外檢測器檢測，也可以嘗試電化學(xué)檢測器有熒光或需要高靈敏度檢測的可采用LIF檢測器需要測定結(jié)構(gòu)或者難以用光學(xué)檢測器檢測的，可以考慮質(zhì)譜檢測第六十六頁，共八十頁，2022年，8月28日大分子檢測蛋白、核酸可以首先選擇紫外檢測器如果需要高靈敏度檢測可以采用柱前或者柱上衍生的方法標記熒光，然后用LIF檢測如果需要特異性檢測，可使用特異性熒光探針，標記后再LIF檢測需要測定分子量或氨基酸序列，可采用質(zhì)譜檢測多糖含量較高的多糖可以采用末端吸收法以紫外檢測器檢測含量較低的還原性多糖可用衍生試劑標記后以LIF、UV的方式檢測第六十七頁，共八十頁，2022年，8月28日第七章分離條件選擇流程

分離條件的選擇是毛細管電泳中最重要但也是最難之處。不同的專業(yè)研究工作者可能會有各自不同的選擇策略和流程，我們提出如下九步選擇流程，僅供參考：第一步，盡可能多地了解分離樣品的類型、來源、組成及其性質(zhì)；第二步，根據(jù)樣品的可能性質(zhì)和來源，選擇分離模式，若無樣品信息可先選CZE；第六十八頁，共八十頁，2022年，8月28日條件選擇流程

第三步，根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測方法，一般先選直接紫外吸收；第四步，確定樣品處理方式，包括衍生方案以及離心過濾除蛋白等；第五步，根據(jù)樣品解離常數(shù)計算最佳pH，或利用75μmID毛細管和磷酸緩沖體系確定pH范圍;第六十九頁，共八十頁，2022年，8月28日條件選擇流程

第六步，根據(jù)所需pH構(gòu)建緩沖體系，包括進一步優(yōu)化pH、緩沖試劑濃度等；第七步，優(yōu)化其他操作參數(shù)，如毛細管尺寸、分離電壓和溫度等；第八步，確定是否需要使用添加劑和使用非水溶劑；第九步，確定是否需要換用其他分離模式。第七十頁，共八十頁，2022年，8月28日條件選擇流程

在毛細管電泳條件選擇中，還應(yīng)充分注意下列操作事項：①最好對樣品和緩沖液進行過濾或離心處理。②毛細管的洗滌或平衡，與緩沖體系、pH以及柱子有關(guān)。磷酸根與石英和玻璃之間存在慢相互作用，需要延長平衡或沖洗時間，處理的時間應(yīng)由分離重現(xiàn)性決定。第七十一頁，共八十頁，2022年，8月28日條件選擇流程

③欲降低緩沖液的電導(dǎo)，應(yīng)盡量使用所謂的“生物緩沖試劑”；欲降低檢測背景，則應(yīng)盡量使用無機緩沖試劑。④欲保持分離重現(xiàn)，要盡量采用相同的條件，包括毛細管、緩沖液、溫度、電壓、洗滌等。第七十二頁，共八十頁，2022年，8月28日第八章各類物質(zhì)的分離要點陰離子及有機酸此類物質(zhì)沒有紫外吸收，要采用間接檢測法間接紫外法一般以鉻酸鈉等物質(zhì)作為背景吸收物CTAB通常用作