植物組織培養(yǎng)室的構(gòu)建及培養(yǎng)基植物材料消毒液

植物組織培養(yǎng)室的構(gòu)建及培養(yǎng)基植物材料消毒液第一頁，共七十六頁，2022年，8月28日植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建第二頁，共七十六頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容：一、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)二、儀器和設(shè)備三、玻璃器皿和用具四、培養(yǎng)條件第三頁，共七十六頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室包括洗滌室（區(qū)）制備室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）儲(chǔ)放室（區(qū)）操作室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）第四頁，共七十六頁，2022年，8月28日１、洗滌室（區(qū)）玻璃器皿和塑料器皿１、洗包括用自來水、洗液、洗滌劑清洗２、干包括自然晾干和烘箱干燥第五頁，共七十六頁，2022年，8月28日2、藥品室存放常用的化學(xué)試劑無機(jī)鹽類、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)劑等第六頁，共七十六頁，2022年，8月28日3、制備室完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設(shè)備：藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計(jì)及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.培養(yǎng)基的配制生理生化測(cè)定第七頁，共七十六頁，2022年，8月28日4、儲(chǔ)存室（區(qū)）存放配制后的培養(yǎng)基或未用完的培養(yǎng)基第八頁，共七十六頁，2022年，8月28日5、滅菌室即消毒室，是培養(yǎng)基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒滅菌的地方第九頁，共七十六頁，2022年，8月28日6、操作室也稱接種室，是開展組織培養(yǎng)研究包括接種、繼代、細(xì)胞融合等的場(chǎng)所。主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進(jìn)行無菌操作的技術(shù)程序。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動(dòng)門，以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。

第十頁，共七十六頁，2022年，8月28日7、培養(yǎng)室培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場(chǎng)所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。第十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日培養(yǎng)室：第十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日

植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，先移到馴化室進(jìn)行煉苗，帶生根成活后，再移到田間苗圃。第十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日二、儀器和設(shè)備1、烘箱陳列于洗滌室作用：干燥洗后的器皿高溫干熱滅菌測(cè)定培養(yǎng)物的干重氣浴第十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日2、冰箱陳列于制備室中作用：低溫保存材料，存放藥品、培養(yǎng)基母液激素、酶制劑。第十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日3、滅菌鍋陳列于滅菌室中類型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋?zhàn)饔茫号囵B(yǎng)基、水和各種器皿的消毒第十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日4、超凈工作臺(tái)陳列于操作室（接種室）中類型：垂直式和水平式作用：無菌操作第十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日5、pH計(jì)陳列于制備室中作用：測(cè)定培養(yǎng)基及酶液的pH值第十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日6、顯微鏡陳列于觀察室中類型：倒置顯微鏡原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡細(xì)胞活力觀察解剖顯微鏡立體觀察第十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日7、天平陳列于制備室中作用：稱取大量元素、微量元素、酶制劑第二十頁，共七十六頁，2022年，8月28日三、玻璃器皿及用具1、玻璃器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等顯微鏡下觀察用的：細(xì)胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等。第二十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日2、微孔過濾器（細(xì)胞過濾器）滅菌用：如激素一般用石棉濾膜第二十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日3、細(xì)胞計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)細(xì)胞的用具4、接種用具如鑷子、剪刀、解剖刀、接種針等第二十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日思考題1、一個(gè)正規(guī)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備哪些房間？2、組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有哪些？各有何用途？3、組織培養(yǎng)的環(huán)境條件有哪些？第二十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日第二十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日

培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的選擇

第二十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日

培養(yǎng)基的制備是組培的核心工作，外植體之所以能沿著不同的組培途徑生長、分化、成苗都取決于選用不同成分的培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)控制的。第二十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基的成分無機(jī)營養(yǎng)成分+有機(jī)營養(yǎng)成分=基本培養(yǎng)基其它添加物固化劑植物生長調(diào)節(jié)劑有機(jī)營養(yǎng)成分無機(jī)營養(yǎng)成分培養(yǎng)基組成第二十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日1.無機(jī)營養(yǎng)成分：第二十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日1)大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素。（C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca）氮：由硝酸鹽和銨鹽提供銨鹽過高會(huì)引發(fā)玻璃化苗2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。（Fe，Cu，Zn，B，Mo，Mn等）微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。Fe由螯合物的形式提供:Na2.EDTA無機(jī)鹽供應(yīng)不足時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)缺素癥狀。

1、無機(jī)營養(yǎng)成分第三十頁，共七十六頁，2022年，8月28日＊當(dāng)某些營養(yǎng)元素的供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織所表現(xiàn)出來的癥狀如下：氮：某些組織表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色；不能形成導(dǎo)管；氮，鉀或磷：細(xì)胞過度生長，形成層組織減退；硫：非常明顯的褪綠；鐵：細(xì)胞分裂停止；硼：細(xì)胞分裂停滯，細(xì)胞伸長；錳或鉬：影響細(xì)胞伸長。第三十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日不同營養(yǎng)條件對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響-MSSalts

GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

MSsaltsreducedto0.47g.l-1

Somerootgrowthbutreduceddevelopmentofshoots（1/10）MSMSsaltsincreasedto9.52g.l-1

Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.(2MS)第三十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日

碳源：最常用的是蔗糖，提供碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%，即配制一升培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時(shí)可用2.5%，但在胚培養(yǎng)時(shí)采用4%-15%的高濃度，因蔗糖對(duì)胚狀體的發(fā)育起重要作用。

2、有機(jī)營養(yǎng)成分第三十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日維生素：維生素(vitamin)這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長、分化等有很好的促進(jìn)作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上，還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長。

第三十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日

主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時(shí)還使用VH(生物素)、VB11(葉酸)、VB12（鈷胺素)等。一般用量為0.1—1.0mg／L。有時(shí)用量較高。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。第三十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日氨基酸(AA)：是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。

有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-000mg/L之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。第三十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日天然復(fù)合物：其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用。第三十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日?1)椰乳是椰子的液體胚乳。?2)香蕉主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。第三十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日?3)馬鈴薯(potato)

去?4)水解酪蛋白

?5)其他酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)第三十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日肌醇(myo—inosltol)又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通?？捎闪姿崞咸烟寝D(zhuǎn)化而成，還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細(xì)胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為100mg/L，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。第四十頁，共七十六頁，2022年，8月28日GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewiththecontrolmedium不同營養(yǎng)條件對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響-sucrose

第四十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日3、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是植物培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，它以很微小的量影響著再生植株的形態(tài)建成?；九囵B(yǎng)基保證培養(yǎng)物的生存和最低的生理活性植物激素定向的誘導(dǎo)外植體的生長分化第四十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日國際植物生理協(xié)會(huì)公布的植物激素包括：赤霉素（GA）細(xì)胞分裂素(CTK)生長素(AUX)乙烯（Eth）脫落酸（ABA）油菜素內(nèi)酯（BR）第四十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日

作用：頂端分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，促進(jìn)生根。用量：mg/L

（1）生長素(AUX)：第四十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)

用法：溶于95%酒精或者NaOH種類：第四十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日生長素作用強(qiáng)弱順序：IAANAAIBA2,4-D強(qiáng)弱2，4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，IBA和NAA常用于生根第四十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.Extensivecallusgeneration(1/5)NAAPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.Somecallus(10xNAA)不同營養(yǎng)條件對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響-AUX

第四十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日種類：6-BA(6-芐基腺嘌呤)Kt(kinetin激動(dòng)素)Zt(zeatin玉米素)TDZ（Thidiazuron）用法：溶于0.5MHCl和NaOH

（2）細(xì)胞分裂素(CTK):

作用：根尖分泌，促進(jìn)細(xì)胞分裂,誘導(dǎo)芽的分化，延緩組織衰落。第四十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant不同營養(yǎng)條件對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響-CTK

(1/5BAP)第四十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日GA3：作用：促進(jìn)幼胚發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞伸長，打破休眠。用法：易溶于水，一般用95%的酒精配成母液貯存。

（3）赤霉素(GA)第五十頁，共七十六頁，2022年，8月28日（4）乙烯作用：催熟，促進(jìn)植物落葉、早衰等，影響培養(yǎng)物的生長和分化。（5）脫落酸作用：促進(jìn)脫落和衰老，在組培中或許促進(jìn)，或許抑制愈傷的分化作用：作用可能與CTK類似，但是用量遠(yuǎn)小于CTK。（6）油菜素內(nèi)酯第五十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日生長素促進(jìn)DNA的復(fù)制赤霉素促進(jìn)G1-S,并縮短S期細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)的分裂第五十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日瓊脂是一種由海藻中提取的多糖類物質(zhì)，本身并不提供任何營養(yǎng)，40℃凝固。固體培養(yǎng)時(shí)最好的固化劑。用量：0.7%-1%。4固化劑-瓊脂第五十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日活性炭(activecarbon)：活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力減弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5—30g/L。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5—羥甲基糖醛及激素等。5其他成分第五十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日活性炭(activecarbon)：作用：利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響，防止褐變；利于生根。濃度：5—30g/L。5其他成分第五十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出現(xiàn)濃度：1-10mg/L抗生素：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。作用：可防止外植體內(nèi)生菌污染。濃度：5—20mg/L。第五十六頁，共七十六頁，2022年，8月28日6、水作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是雙蒸水,以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。第五十七頁，共七十六頁，2022年，8月28日1、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:

①保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性②配制時(shí)的快速移取③便于低溫保藏。3.2培養(yǎng)基的配制第五十八頁，共七十六頁，2022年，8月28日化學(xué)藥品及試劑漢語名分子式生產(chǎn)公司分子量純度硝酸銨NH4NO3

上海通亞精細(xì)化工廠80.04分析純磷酸二氫鉀KH2PO4

中國江蘇南京中山集團(tuán)公司化工廠136.09

硝酸鉀KNO3

上海鑫達(dá)精細(xì)化工有限公司101.10

硫酸鎂MgSO4.7H2O山東省化工研究院246.47

氯化鈣CaCl2.2H2O(上海)四聯(lián)化工廠147.03

硫酸錳MnSO4.4H2O上海試劑工廠169.02

硫酸鋅ZnSO4.7H2O山東濰坊市試劑廠287.54

硼酸H3BO3

濟(jì)南化學(xué)試劑廠61.83

碘化鉀KI上海化學(xué)采購站166.064

鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O北京五十六0一化工廠241.95分析純氯化鈣CaCl2.6H2O濟(jì)南試劑總廠237.93

五水硫酸銅CuSO4.5H2O濟(jì)南化學(xué)試劑廠249.68

第五十九頁，共七十六頁，2022年，8月28日

漢語名分子式生產(chǎn)公司分子量純度乙二胺四乙酸鈉Na2-EDTA.2H2O濟(jì)南試劑總廠372.24分析純硫酸亞鐵FeSO4.7H2O山東博山化學(xué)試劑廠278.01分析純

甘氨酸C2H5NO2

中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所75.07分析純鹽酸吡哆醇B6C8H11O3N.HCl中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑站205.64

鹽酸硫胺素B1C12H17ClH4OS.HCl中國新興化工試劑研究所337.27

煙酸B3C6H5NO2

北京芳草醫(yī)藥化工研制公司123.11化學(xué)純肌醇C6H12O6

中國政翔化學(xué)試劑研究所180.16

3-吲哚乙酸IAA（b-Indoleaceticacid）天津天泰精細(xì)化工品有限公司125.1分析純萘乙酸NAAC12H10O2

中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司186.21化學(xué)純?nèi)~酸C19H19O6N7

上?；瘜W(xué)試劑廠441.422,4-D（2,4-dichlorophenoxyaceticacid）上海雪滿生物科技有限公司

6-BA（N6-benzylaminopurine）上海伯奧生物科技有限公司225.25

蔗糖sucrose天津市廣成化學(xué)試劑有限公司342.29分析純瓊脂Agar國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司B.R第六十頁，共七十六頁，2022年，8月28日單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。

母液的配制方法：第六十一頁，共七十六頁，2022年，8月28日MS培養(yǎng)基配制表母液化合物含量（終濃度）mg/L母液稱量（mg）配制量（ml）吸取量（ml/L）1號(hào)NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500（擴(kuò)大20倍）502號(hào)CaCl24404400同上503號(hào)ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500（擴(kuò)大100倍）104號(hào)Na2－EDTAFeSO4.7H2O37.327.8746556100（擴(kuò)大200倍）55號(hào)VB1VB6甘氨酸煙酸0.40.520.5202510025500（擴(kuò)大100倍）106號(hào)肌醇1001000100107蔗糖3％30g8瓊脂0.6％－1.2％6－12g第六十二頁，共七十六頁，2022年，8月28日MS母液配制：MSI 大量元素20X MSII 微量元素200X MSIII 鐵鹽 200X MSIV 有機(jī)物 200X MSV 肌醇 200X

激素 0.1mg/ml第六十三頁，共七十六頁，2022年，8月28日植物激素母液的配制⑴生長素類：IAA、NAA、2，4-D、IBA配制：先按要求稱好100mg藥品，置于小燒杯中，用0.1NNaOH溶解，再用蒸餾水定容到1000mL，再于試劑瓶保存。則實(shí)驗(yàn)室NAA濃度為0.1mg/ml第六十四頁，共七十六頁，2022年，8月28日⑵細(xì)胞分裂素類：

BA、KT、ZT配制：先用0.5N鹽酸溶解100mg藥品，再用蒸餾水定容至1000mL，然后保存。則實(shí)驗(yàn)室BA濃度為0.1mg/ml第六十五頁，共七十六頁，2022年，8月28日3.滅菌：