細胞實驗二計數(shù)

培養(yǎng)細胞傳代與計數(shù)細胞培養(yǎng)的基本概念

傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。

原代培養(yǎng)取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

接觸抑制（Contactinhibition）細胞相互接觸時，將停止增長；細胞停留在細胞周期的G0期；轉化的細胞卻可以繼續(xù)生長導致細胞重疊堆積生長。體外培養(yǎng)的細胞增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限”。傳代次數(shù)與物種壽命有關：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。傳代次數(shù)與個體年齡成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。

細胞傳代次數(shù)（PassageNumber）

原代培養(yǎng)

（primary

culture）從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內）停止生長。

克?。╟lone）亦稱無性繁殖系或無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。

細胞系（cell

line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉化的細胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖

細胞株（cell

strain）從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。原代培養(yǎng)與細胞系

TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA細胞系資源有限細胞系，無限細胞系

細胞系

細胞株

培養(yǎng)細胞的特性

培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞

每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。10分鐘——4小時貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）潛伏期此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。細胞周期研究：細胞周期同步化停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細胞的計數(shù)的意義在細胞生物學及分子生物學實驗中，往往要進行細胞的計數(shù)、調整細胞的密度，才可進行后續(xù)的實驗操作（如：細胞增殖、轉染、流式細胞術等），因此是必不可少的一種基本技能。血球計數(shù)板細胞計數(shù)圖示細胞計數(shù)①將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上；②將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片與計數(shù)板之間；③靜置3分鐘；④鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計算左側和上方的。然后按如下公式計算：

細胞數(shù)/mL=（4大格細胞總數(shù)/4）×10000（/4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)；×104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3

而1ml＝1000mm3

）細胞計數(shù)圖示實驗注意事項與要點1.進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；

2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。3.取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準確；4.數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。5.操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。

實驗步驟①取一瓶傳代的細胞，待長成單層后以被使用。用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。②取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上.③吸取10μL細胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡