植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一葉綠體色素提取分離與理化性質(zhì)及含量測定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x綠色植物的光合作用是在葉綠體中的葉綠體色素中進(jìn)行的，了解葉綠體色素的組成、性質(zhì)及測定對(duì)于理解光合作用的本質(zhì)很有幫助。因此，測定葉綠素含量便成為研究光合作用與氮代謝必不可少的手段，在作物育種、科學(xué)施肥、看葉診斷中有著廣泛的應(yīng)用二、 實(shí)驗(yàn)原理植物葉綠體色素是吸收太陽光能，進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)。它一般由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。這些色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。色素分離的方法有多種，紙層析是最簡便的一種。當(dāng)溶劑（有機(jī)推動(dòng)劑）不斷從紙上流過時(shí)，由于混合物（葉綠素提取液）中各種成分在固定相（濾紙纖維素所吸附的水分）和流動(dòng)相（有機(jī)推動(dòng)劑）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動(dòng)速度不同，經(jīng)過一定時(shí)間后，可將各種色素分開。葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光光度計(jì)精確測定。葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被氫離子所取代而成褐色的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標(biāo)本。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個(gè)特定波長下的吸光度D，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。Ca=12.7D663-2.69D645(3)Cb=22.9D645-4.68D663(4)Ck=4.7D440-0.27Ca+b三、 實(shí)驗(yàn)材料和器材1、 實(shí)驗(yàn)材料菠菜或白菜葉片2、 器材：722型分光光度計(jì)、電子天平、量筒、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、移液管(1mL)、試管及試管架、洗耳球、酒精燈、電筒等。試劑：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%鹽酸、碳酸鈣、石英砂等四、 實(shí)驗(yàn)步驟葉綠體色素的提取取植物新鮮葉片1克，洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放人研缽中。2-3mL95%(2)研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，2-3mL95%乙醇，研磨至糊狀，再加乙醇，過濾，即得色素提取液。葉綠體色素的分離點(diǎn)樣：取前端剪成三角形的濾紙條，用毛細(xì)管取葉綠素提取液點(diǎn)樣，注意每次所點(diǎn)溶液不可過多，點(diǎn)樣后晾干，再重復(fù)操作數(shù)次。分離：在大試管中加入推動(dòng)劑，然后將濾紙固定于膠塞的小鉤上，插入試管中，使尖端浸入溶劑內(nèi)(色點(diǎn)要高于液面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁)，蓋緊膠塞，直立于陰暗處層析。當(dāng)推動(dòng)劑前沿接近濾紙邊緣時(shí)，取出濾紙，風(fēng)干，觀察色帶的分布。葉綠素a為藍(lán)綠色，葉綠素b為黃綠色，葉黃素為黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱。將上一個(gè)實(shí)驗(yàn)中提取的葉綠體色素溶液適當(dāng)稀釋后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：熒光現(xiàn)象的觀察。取l支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同，可觀察到反射出暗紅色的熒光。氫和銅對(duì)葉綠素分子中鎂的取代作用方法一；取兩支試管。第一支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對(duì)照。第二支試管加葉綠體色素提取液2mL，再加入稀鹽酸1滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。當(dāng)溶液變竭后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記錄溶液顏色變化情況，并與對(duì)照試管相比較。解釋其顏色變化原因。皂化作用(綠色素與黃色素的分離)取葉綠體色素提取液2mL于大試管中，加入4mL乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加人3?6mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉(zhuǎn)入上層乙醚中。用滴管吸取上層綠色層溶液，放入另一試管中，再用蒸餾水沖洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30%KOH一甲醇溶液1mL(??)，充分搖勻，再加入蒸餾水約3mL，搖勻靜置。可以看到溶液逐漸分為兩層，下層是水溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b，上層是乙醚溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。將上下層放入兩試管中，可供觀察吸收光譜用。葉綠體色素吸收光譜曲線將上述葉綠體色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，于400-700nm之間，每間隔10nm讀取光密度值。根據(jù)測定結(jié)果，以波長為橫坐標(biāo)繪制曲線，此即葉綠體色素的吸收光譜曲線。用同樣的方法測定皂化作用中分離出綠色素與黃色素的吸收光譜曲線，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。葉綠體色素含量測定取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，剪碎，混勻。稱取剪碎的新鮮樣品0.5g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2?3mL80%丙酮，研成勻漿，再加80%丙酮5mL，繼續(xù)研磨至組織變白。轉(zhuǎn)移到25mL棕色容量瓶中，用少量80%丙酮沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肴萘科恐小Ｗ詈笥?0%丙酮定容至25mL，搖勻。離心或過濾。將上述色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以80%丙酮為空白，在波長663nm、645nm、652nm和440nm下測定光密度。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算將測得的光密度值代入公式，分別計(jì)算葉綠素a、b、a+b和類胡蘿卜素的濃度(mg/L)。Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6)葉綠素總量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7)Ck=4.7D440-0.27Ca+b并按下式計(jì)算組織中單位鮮重或干重的各色素的含量:色素濃度(mg/L)某提取液總體積某稀釋倍數(shù)色素在葉片中的含量(％)二某100%樣品重量(mg)某1000稀釋倍數(shù)：若提取液未經(jīng)稀釋，則取1試述葉綠體色素的吸收光譜特點(diǎn)及生理意義。2.在皂化反應(yīng)中加入乙醚有什么作用？實(shí)驗(yàn)二改良半葉法測光合作用強(qiáng)度改良半葉法是將植物對(duì)稱葉片的一部分遮光或取下置于暗處，另一部分則留在光下進(jìn)行光合作用，過一定時(shí)間后，在這兩部分葉片的對(duì)應(yīng)部位取同等面積,分別烘干稱重。因?yàn)閷?duì)稱葉片的兩對(duì)應(yīng)部位的等面積的干重，開始時(shí)被視為相等，照光后葉片重量超過暗中的葉重，超過部分即為光合作用產(chǎn)物的產(chǎn)量,并通過一定的計(jì)算可得到光合作用強(qiáng)度。2.實(shí)驗(yàn)試劑三氯乙酸實(shí)驗(yàn)材料田間有代表性的植物葉片實(shí)驗(yàn)三種子生命力的快速測定I.TTC法一、 原理TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）的氧化態(tài)是無色的，可被氫還原成不溶性的紅色三苯甲月替（TTF）。應(yīng)用TTC的水溶液浸泡種子，使之滲入種胚的細(xì)胞內(nèi)，如果種胚具有生命力，其中的脫氫酶就可以將TTC作為受氫體使之還原成為三苯甲月替而呈紅色，如果種胚死亡便不能染色，種胚生命力衰退或部分喪失生活力則染色較淺或局部被染色，因此，可以根據(jù)種胚染色的部位或染色的深淺程度來鑒定種子的生命力。二、 材料、儀器設(shè)備及試劑（一） 材料：水稻、小麥、玉米、棉花、油菜等待測種子。（二） 儀器設(shè)備：1）小燒杯；2）刀片；3）鑷子；4）溫箱。（三） 試劑：0.12%?0.5%TTC溶液（TTC可直接溶于水，溶于水后，呈中性，pH7±0.5，不宜久藏，應(yīng)隨用隨配）。三、 實(shí)驗(yàn)步驟1） 將種子用溫水（約30°C）浸泡2?6h，使種子充分吸脹。2） 隨機(jī)取種子100粒，水稻種子要去殼，豆類種子要去皮，然后沿種胚中央準(zhǔn)確切開，取其一半備用。3） 將準(zhǔn)備好的種子浸于TTC試劑中，于恒溫箱（30?35C）中保溫30min。4）染色結(jié)束后要立即進(jìn)行鑒定，因放久會(huì)褪色。倒出TTC溶液，再用清水將種子沖洗1?2次，觀察種胚被染色的情況，凡種胚全部或大部分被染成紅色的即為具有生命力的種子。種胚不被染色的為死種子，如果種胚中非關(guān)鍵性部位（如子葉的一部分）被染色，而胚根或胚芽的尖端不染色都屬于不能正常發(fā)芽的種子。染料染色法一、 原理有生命力種子胚細(xì)胞的原生質(zhì)膜具有半透性，有選擇吸收外界物質(zhì)的能力，一般染料不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，胚部不染色。而喪失生命力的種子，其胚部細(xì)胞原生質(zhì)膜喪失了選擇吸收能力，染料可自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使胚部染色。所以可根據(jù)種子胚部是否被染色來判斷種子的生命力。二、 材料、設(shè)備及試劑（一） 材料：水稻、玉米、大豆、棉花、小麥及一些樹木種子。（二） 設(shè)備：1）小燒杯；2）刀片；3）鑷子；（三） 試劑：0.02%?0.2%靛紅溶液或5%紅墨水（酸性大紅G）。三、 實(shí)驗(yàn)步驟同TTC法。III、 熒光法、原理植物種子中常含有一些能夠在紫外線照射下產(chǎn)生熒光的物質(zhì)如某些黃酮類、香豆素類、酚類物質(zhì)等，在種子衰老過程中，這些熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分往往發(fā)生變化，因而熒光的顏色也相應(yīng)地有所改變；而且這些種子在衰老死亡時(shí)，內(nèi)含熒光物質(zhì)雖然沒有改變，但由于生命力衰退或已經(jīng)死亡的細(xì)胞原生質(zhì)之透性增加，當(dāng)浸泡種子時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光物質(zhì)很容易外滲。因此，可以根據(jù)前一種情況直接觀察種胚熒光的方法來鑒定種子的生命力，或根據(jù)后一種情況通過觀察熒光物質(zhì)滲出的多少來鑒定種子的生命力。二、 材料及設(shè)備1）待測的植物種子；2）紫外光燈；3）白紙（不產(chǎn)生熒光的）；4）刀子；5）鑷子；6）培養(yǎng)皿；7）燒杯。三、 實(shí)驗(yàn)步驟1）直接觀察法：這種方法適用于禾谷類、松柏類及某些薔薇科果樹的種子生命力的鑒定，但種間的差異較大。用刀片沿種子的中心線將種子切為兩半，使其切面向上放在無熒光的白紙上，置于紫外光燈下照射并進(jìn)行觀察、記載。有生命力的種子在紫外光的照射下將產(chǎn)生明亮的藍(lán)色、藍(lán)紫色或藍(lán)綠色的熒光；喪失生命力的死種子在紫外光照射下多呈黃色、褐色以至暗淡無光，并帶有多種斑點(diǎn)。隨機(jī)選取20粒待測種子按上述方法進(jìn)行觀察并記載有生命力及喪失生命力的種子的數(shù)目，然后計(jì)算有生命力種子所占百分?jǐn)?shù)。與此同時(shí)也作一平行的常規(guī)發(fā)芽試驗(yàn)，計(jì)算其發(fā)芽率作為對(duì)照。2）紙上熒光：隨機(jī)選取50粒完整無損的種子置燒杯內(nèi)加蒸餾水浸泡10~15min令種子吸脹，然后將種子瀝干，再按0.5cm的距離擺放在濕濾紙上（濾紙上水分不宜過多，防止熒光物質(zhì)流散）以培養(yǎng)皿覆蓋靜置數(shù)h后將濾紙（或連同上面擺放的種子）風(fēng)干（或用電吹風(fēng)吹干）。置紫外光燈下照射，可以看到擺過死種子的周圍有一圈明亮的熒光團(tuán)，而具有生命力的種子周圍則無此現(xiàn)象。根據(jù)濾紙上顯現(xiàn)的熒光團(tuán)的數(shù)目就可以測出喪失生命力的種子的數(shù)量，并由此計(jì)算出有生命力種子所占的百分率。此外，可與此同時(shí)作一平行的常規(guī)種子萌發(fā)試驗(yàn)計(jì)算其發(fā)芽率作為對(duì)照。這個(gè)方法應(yīng)用于白菜、蘿卜等十字花科植物種子生命力的鑒定上效果很好。但對(duì)于一些在衰老、死亡后減弱或失去熒光的種子便不適用此法，因此，對(duì)它們只宜采用直接察法。實(shí)驗(yàn)四植物抗逆性的鑒定（電導(dǎo)儀法）一、原理植物細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常的代謝起著重要的作用。在正常情況下，細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)具有選擇透性能力。當(dāng)植物受到逆境影響時(shí)，如高溫或低溫，干旱、鹽漬、病原菌侵染后，細(xì)胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，以致植物細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率增大。膜透性增大的程度與逆境脅迫強(qiáng)度有關(guān)，也與植物抗逆性的強(qiáng)弱有關(guān)。這樣，比較不同作物或同一作物不同品種在相同脅迫溫度下膜透性的增大程度，即可比較作物間或品種間的抗逆性強(qiáng)弱，因此，電導(dǎo)法目前已成為作物抗性栽培、育種上鑒定植物抗逆性強(qiáng)弱的一個(gè)精確而實(shí)用的方法。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一） 材料：小麥、女貞葉片；（二） 儀器設(shè)備：1）電導(dǎo)儀；2）天平；3）溫箱；4）真空干燥器；5）抽氣機(jī)；6）恒溫水浴鍋；7）注射器。（三） 試劑：NaCl溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：如需定量測定透性變化，可用純NaCl配成0、10、20、40、60、80.100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，在20?25°C恒溫下用電導(dǎo)儀測定，可讀出電導(dǎo)度。2） 選取小麥或其他植物在一定部位上生長葉齡相似的葉子若干，剪下后，先用紗布拭凈，稱取二份，各重2g。3） 一份插入小杯中放在40C恒溫箱內(nèi)萎蔫0.5?1h，另一份插入水杯中放在室溫下做對(duì)照。處理后分別用蒸餾水沖洗二次，并用潔凈濾紙吸干。然后剪成長約1cm小段放入小玻杯中（大小以夠容電極為度），并用玻棒或干凈尼龍網(wǎng)壓住，在杯中準(zhǔn)確加入蒸餾水20ml，浸沒葉片。4） 放入真空干燥器，用抽氣機(jī)抽氣7?8min以抽出細(xì)胞間隙中的空氣；重新緩緩放入空氣，水即被壓入組織中而使葉下沉。5） 將抽過氣的小玻杯取出，放在實(shí)驗(yàn)桌上靜置20min，然后用玻棒輕輕攪動(dòng)葉片，在20?25C恒溫下，用電導(dǎo)儀測定溶液電導(dǎo)率。6）測過電導(dǎo)率的之后，再，放入100°C沸水浴中15min，以殺死植物組織，取出放入自來水冷卻10min，在20?25C恒溫下測其煮沸電導(dǎo)率。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析比較不同處理（萎蔫處理與對(duì)照）的葉片細(xì)胞透性的變化情況，記錄結(jié)果，并加解釋。實(shí)驗(yàn)五植物激素及生長調(diào)節(jié)劑的生理效應(yīng)觀察（選做實(shí)驗(yàn)）II生長調(diào)節(jié)對(duì)果實(shí)發(fā)育的影響［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模萘私獬嗝顾貙?duì)莖伸長作用。了解乙烯對(duì)果實(shí)的催熟作用。植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)植物插條不定根發(fā)生的影響［實(shí)驗(yàn)原理］赤霉素對(duì)種子萌發(fā)及莖伸長有促進(jìn)作用；適當(dāng)濃度的乙烯利能促進(jìn)果實(shí)成熟。用植物生長調(diào)節(jié)劑（生長素類、生長延緩劑等）處理插條，可以促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，誘導(dǎo)根原基發(fā)生，促進(jìn)不定根的生長；容易生根的植物經(jīng)處理后，發(fā)根提早，成活率提高；對(duì)木本植物進(jìn)行插條處理，提高生根率。移栽的幼苗被生長調(diào)節(jié)劑處理后，移栽后的成活率提高，根深苗壯。本實(shí)驗(yàn)通過測定植物生長的重要生理指標(biāo)一一根的活力和過氧化物酶活性，以