PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析報(bào)告及對(duì)策

有用標(biāo)準(zhǔn)文檔有用標(biāo)準(zhǔn)文檔問(wèn)題問(wèn)題2：非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：條帶與估量的大小不全都或者非特異性擴(kuò)增帶緣由：1.引物特異性差2.模板或引物濃度過(guò)高問(wèn)題1：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正比照有條帶，而樣品則無(wú)緣由:模板:含有抑制物，含量低Buffer引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反響條件：退火溫度太高，延長(zhǎng)時(shí)間太短對(duì)策:純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量Buffer重設(shè)計(jì)引物〔避開(kāi)鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)構(gòu)造〕或者換一管引物降低退火溫度、延長(zhǎng)延長(zhǎng)時(shí)間酶量過(guò)多退火溫度偏低現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。緣由：1.模板不純2.Buffer3.退火溫度偏低4.酶量過(guò)多5.dNTP、Mg+度偏高循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)削減酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法削減循環(huán)次數(shù)問(wèn)題3：拖尾6.循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：純化模板更換Buffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶dNTP削減循環(huán)次數(shù)問(wèn)題4：假陽(yáng)性現(xiàn)象：空白比照消滅目的擴(kuò)增產(chǎn)物緣由：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交*污染對(duì)策：操作時(shí)應(yīng)留神輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，全部試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)展分裝，然后低溫貯存PCR一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)章甚致消逝。假陰性，不消滅擴(kuò)增條帶PCR④PCR模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有TaqTaq引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要留意引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，確定要有引物條帶消滅，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體全都，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2Mg2+PCRPCRPCRPCR反響體積的轉(zhuǎn)變：通常進(jìn)展PCR20ul、30ul、50ul100ul，PCR20ul后，再做大體積時(shí)，確定要模索條件，否則簡(jiǎn)潔失敗?；饻囟冗^(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延長(zhǎng)溫度，這也是PCR失敗的緣由之一。PCR假陽(yáng)性PCR引物設(shè)計(jì)不適宜：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)展PCRPCRPCRPCR消滅非特異性擴(kuò)增帶Mg2PCR(93℃變性，65℃左右退火與延長(zhǎng))。消滅片狀拖帶或涂抹帶PCRdNTPMg2+濃度。④增加模板量，削減循環(huán)次數(shù)。PCR最正確插入片段：載體比需試驗(yàn)確定。1：1〔插入片段：載體〕1：88：15ul2X50ng粒DNA,1Weiss單位的T410ul14oC2種溫度下，缺T-1小時(shí)4oCPCR比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。假設(shè)沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么比照試驗(yàn)？A〕涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，說(shuō)明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B〕轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul1:100,1ul100ulSOC1000ul100ul鋪板。培育過(guò)夜，產(chǎn)生1000/DNADNA10ngSOC1000u10ngDNA，1/101ngDNA。轉(zhuǎn)化率為：1000X10〔3〕ng/1ngDNAug=10〔6〕cfu/ug10〔8〕cfu/ug>20-40〔10〔8〕cfu/ug〕，T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA〔M1801，M1804，M1794〕T4DNApGEM-TEasypGEM-T〔10〔8〕cfu/ug〕,10060%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40比照試驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，試驗(yàn)出了什么問(wèn)題？4oC3`-TpGEM-TpGEM-TpGEM-TEasy3`-TUV過(guò)度照耀，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照耀會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重純化。D〕DNAA，pGEM-TpGEM-TEasyTaqDNAA。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料〔TM042〕。SUREPCRPCR0.2-mlPCRdNTPPCRTaqPCR沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物：MgCl20.25mmol/LMgCl2MgCl20.5mmol/LMgCl2MgCl2，PCRMg2+。檢查退火溫度和變性條件，假設(shè)有需要的話，可降低退火溫度。檢查模板和引物的用量。泳道中消滅模糊條帶：重設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物。其他值得留意的條件：建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時(shí)不能有效地使模板變性。大多數(shù)反響中，0.75ml〔0.5~1ml〕的酶量在大多數(shù)狀況下可以得到滿足的結(jié)果。建議使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP組合的混合物。然而要得到最正確結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的?；蚪MDNAPCRDNADNADNA10kbDNADNA降低二級(jí)構(gòu)造和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)展長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長(zhǎng)度一般為24~34個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反響的退火溫度來(lái)增加反響的特異性。這點(diǎn)格外重要，長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。94℃294℃20--30GC，95℃30DNADNA12kb下進(jìn)展延長(zhǎng)操作。循環(huán)延長(zhǎng)：盡量承受循環(huán)延長(zhǎng)的條件，假設(shè)PCR儀無(wú)此功能，則必需增加延長(zhǎng)的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延長(zhǎng)時(shí)間用10分鐘替代原來(lái)的8分鐘。長(zhǎng)片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個(gè)突出的A，因此建議承受T/A克隆。假設(shè)要進(jìn)展平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)展。Sanger〔染色體〕帶型。引物設(shè)計(jì)：一般長(zhǎng)度20-30bp；避開(kāi)引物二聚體和二級(jí)構(gòu)造；也可以以下圖示提示找到解決問(wèn)題的突破口：PCR0.5ml0.2ml(μl)終濃度129.410×BufferB251×4×dNTP35200μmol/LMgCl2431.5mmol/L52.60.25μmol/L62.60.25μmol/L720.1μgTaqDNA80.41unit用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50μl礦物油。每加一管換一次Tip。振蕩每只管，然后短暫離心。94℃4194℃172℃1304℃60-80V,15-20紫外檢查電泳結(jié)果。四、爭(zhēng)論假陰性，不消滅擴(kuò)增條帶PCRPCRDNA酶失活：需更換酶，或舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不抱負(fù)、簡(jiǎn)潔彌散的常見(jiàn)緣由。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條ODPCR決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止屢次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+M2+PCRPCRPCRPCR反響體積的轉(zhuǎn)變：通常進(jìn)展PCR擴(kuò)增承受的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)展PCR擴(kuò)增，是依據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，20ul后，再做大體積時(shí)，確定要模索條件，否則簡(jiǎn)潔失敗。PCRPCR失敗的緣由之一。PCR假陽(yáng)性PCRPCRPCR簡(jiǎn)潔消滅假陽(yáng)性。需重設(shè)計(jì)引物。PCRPCR消滅非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后消滅的條帶與估量的大小不全都，或大或小，或者同時(shí)消滅特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的消滅，其緣由：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易消滅非特異(93℃變性，65℃左右退火與延長(zhǎng))。4.消滅片狀拖帶或涂抹帶，dNTP，Mg2+dNTPMg2+濃度。④增加模板量，削減循環(huán)次數(shù)。TroubleshootingforPCRandmultiplexPCRCOMPONENTVOLUMECOMPONENTVOLUMEFINALCONCENTRATION1.autoclavedultra-filteredwater(pH7.0)20.7μL-2.10xPCRBuffer*2.5μL1x3.dNTPsmix(25mMeachnucleotide)0.2μL200μM(eachnucleotide)4.primermix(25pmoles/μLeachprimer)0.4μL0.4μM(eachprimer)5.TaqDNApolymerase(nativeenzyme)0.2μL1Unit/25μL6.genomicDNAtemplate(100ng/μL)1.0μL100ng/25μL*The10xPCRbuffercontains:500mMKCl;100mMTris-HCl(pH8.3);15mMMgCl(thefinalconcentrationsoftheseingredientsinthePCRmix2are:50mMKCl;10mMTris-HCl;1.5mMMgCl2).QUESTIONS SOLUTIONSIget(many)longerunspecifiDecreaseannealingtimeproducts.WhatcanIdo? temperatureDecreaseextensiontimeDecreaseextensiontemperatureto62-68oCIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mM.IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.TakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheaboveIget(many)shorterunspecificIncreaseannealingtemperatureproducts.WhatcanIdo? IncreaseannealingtimeIncreaseextensiontimeIncreaseextensiontemperatureto74-78oCDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mMIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstantTakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheaboveReactionwasworkingbefore,MakesureallPCRingredientsaretakeninthereaction(buffer,butnowIcan”tgetanyproduct.template,Taq,etc)ChangethedNTPsolution(verysensitivetocyclesofthawingandfreezing,especiallyinmultiplexPCR)Ifyoujustboughtnewprimers,checkfortheirreliability(badprimersynthesis?)IncreaseprimeramountIncreasetemplateamountDecreaseannealingtemperatureby6-10oCandcheckifyougetanyproduct.Ifyoudon”t,checkallyourPCRingredients.Ifyoudogetproducts(includingunspecificones)reactionconditionsasdescribedabove.Combinesome/alloftheaboveMyPCRproductisweak.IsthereGraduallydecreasetheannealingtemperaturetothelowestpossible.awaytoincreasetheyield? IncreasetheamountofPCRprimerIncreasetheamountofDNAtemplateIncreasetheamountofTaqpolymeraseChangebuffer(KCl)concentration(higherifproductislowerthan1000bporlowerifproductishigherthan1000bp)Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerol.Checkprimersequencesformismatchesand/orincreasetheprimerlengthby5nucleotidesCombinesome/alloftheaboveMytwoprimershavevery AneasysolutionistoincreasethelengthoftheprimerwithlowdifferentmeltingtemperaturesTm.Ifyouneedtokeepthesizeoftheproductconstant,addafew(Tm)butIcannotchangetheirbasesatthe3”end.Ifsizeisnotaconcern,addafewbasesatlocus.WhatcanIdotoimprovePCReitherthe3”orthe5”endofthatprimer.amplification?IhaveanumberofprimerpairsVerylikely,yes.Iwouldliketousetogether.CaTryamplifyalllociseapratelyusingthesamePCRprogram.IfoneIrunamultiplexPCRwiththem?oftheprimerpairsyieldsunspecificproducts,keepthecyclingHow? conditionsconstantandchangeotherparametersasmentionedabove(#1and#2).Mixequimolaramountsofprimersandrunthemultiplexreactioneitherinthesamecyclingconditionsorbydecreasingonlytheannealingtemperatureby4oC.Ifsomeofthelociareweakornotamplified,readbelow!!HowmanylocicanIamplifyiDifficulttosay.Theauthorhasroutinelyamplifiedfrom2to14multiplexPCRatthesametime?loci.Literaturedescribesupto25lociorso.OneorafewlociinmymultiplexThefirstchoiceshouldbeincreasingtheamountofprimerforthereactionareveryweakor “weak“l(fā)ociatthesametimewithdecreasingtheamountofprimerinvisible.Howcanamplifythem?foralllocithatcanbeamplified.Thebalancebetweentheseamountsismoreimportantthantheabsolutevaluesused!!.Checkprimersequencesforprimer-primerinteractionsShortPCRproductsinmy IncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2multiplexreactionareweak.Howconcentrationat1.5-2mMcanIimprovetheiryield? DecreasedenaturingtimeDecreaseannealingtimeandtemperatureDecreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe“weak“l(fā)ociwhiledecreasingtheamountforthe“strong“l(fā)oci.Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheaboveLongerPCRproductsinmy DecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2multiplexreactionareweak.Howconcentrationat1.5-2mMcanIimprovetheiryield? IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.IncreasedenaturingtimeIncreaseannealingtimetemperatureIncreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe“weak“l(fā)ociwhiledecreasingtheamountforthe“strong“l(fā)ociAddadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheaboveAllproductsinmymultiplexDecreaseannealingtimeinsmallsteps(2oC)reactionareweak.HowcanI Decreaseextensiontemperatureto62-68oCimprovetheyield? IncreaseextensiontimeIncreasetemplateconcentrationIncreaseoverallprimerconcentrationAdjustTaqpolymeraseconcentrationChangeKCl(buffer)concentration,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mMIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheaboveUnspecificpro