實(shí)驗(yàn)微絲染色及形態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)微絲染色及形態(tài)觀察第一頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日[目的要求]1.掌握微絲的染色方法。2.了解光鏡下微絲的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。第二頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日[實(shí)驗(yàn)原理]

真核細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)稱為細(xì)胞骨架(cellskeleton)，在維持細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng)方面具有重要作用。根據(jù)組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同，可將細(xì)胞骨架分為微管(microtubule,MT)、微絲(microfilament,MF)和中間纖維(intermediatefilament,IF)。微絲普遍存在于多種細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的形狀和運(yùn)動(dòng)有一定作用。第三頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日

當(dāng)細(xì)胞用TritonX-100溶液處理，能夠溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，而細(xì)胞骨架中的蛋白質(zhì)卻不被破壞，經(jīng)固定和考馬斯亮藍(lán)（非特異性蛋白質(zhì)染料）染色后，胞質(zhì)背景著色弱，微管等蛋白結(jié)構(gòu)在光鏡下無(wú)法分辨，在光鏡下觀察到主要是由微絲組成的應(yīng)力纖維。應(yīng)力纖維由平行排列的微絲組成，體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞應(yīng)力纖維尤為發(fā)達(dá)，形態(tài)長(zhǎng)而直，常與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行并貫穿細(xì)胞全長(zhǎng)。第四頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日第五頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日

微絲在細(xì)胞內(nèi)的分布特征第六頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日[實(shí)驗(yàn)用品]器具：CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺(tái)、低速離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡、移液器、恒溫箱、鑷子、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、吸水紙。材料：蓋玻片培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞試劑：6mmol/LPBS（pH6.5）、1％TritonX-100溶液、M-緩沖液、3％戊二醛固定液、0.2％考馬斯亮藍(lán)染液、DMEM培養(yǎng)液。

第七頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日[實(shí)驗(yàn)步驟]1.培養(yǎng)在成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，將已消毒的蓋玻片涂上多聚賴氨酸，放入培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2的溫箱中生長(zhǎng)24h～48h。2.染色處理（1）取材取出鋪有細(xì)胞的蓋玻片，放入小培養(yǎng)皿中（正面向上）,用PBS洗3次（從蓋玻片一角輕輕滴加34滴），洗去表面的培養(yǎng)液。（2）抽提吸棄PBS，加入1%TritonX-100液4-5滴（剛好覆蓋蓋玻片表面），室溫處理15min第八頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日（3）穩(wěn)定吸棄TritonX-100，立即用M-緩沖液輕輕地洗滌3次。

（4）固定略晾干，在3%戊二醛液中固定10min，再以PBS液洗3次，洗去固定液。

（5）染色滴加3-5滴0.2%考馬斯亮蘭染液染色10min，然后小心的用自來(lái)水漂洗。（6）觀察留取少量水分封片于載玻片，吸水紙吸去多余的水。光鏡下觀察臨時(shí)裝片。第九頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]光鏡觀察，微絲聚集成的應(yīng)力纖維束被染成藍(lán)色，成纖維細(xì)胞多數(shù)有突起，微絲沿突起規(guī)則排列。第十頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日光學(xué)顯微鏡下微絲分布圖第十一頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日

[注意事項(xiàng)]1.洗片時(shí)要輕柔，以免把細(xì)胞從載玻片上洗去。2．操作中應(yīng)注意區(qū)分細(xì)胞蓋玻片的正反面。3．染色后應(yīng)沖洗蓋玻片背面，避免損傷細(xì)胞。4．TritonX-100抽提蛋白時(shí)，注意避免抽提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。第十二頁(yè)，共十三頁(yè)，2022年，8月28日[作業(yè)與思