體內藥物分析薄層色譜法

體內藥物分析薄層色譜法第1頁/共32頁2色譜法

色譜法是一種物理或物理化學的分離分析方法，其分離原理主要是利用物質在流動相和固定相中的分配系數(shù)、或吸附能力等的差異而得到分離。

隨著臨床藥學的迅速發(fā)展，色譜法在體內藥物分析中的應用更為廣泛，具有不可取代的重要地位，已成為體內藥物分離檢測最重要的方法第2頁/共32頁3

液相色譜法是應用最廣的分離分析方法，特別是對于復雜樣品的分析尤為重要。液相色譜法的分支很多，廣義的液相色譜法包括：高效液相色譜法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法、毛細管電泳法等類別，而它們又各自包括多種方法。

色譜法包括紙色譜、薄層色譜、凝膠色譜、氣相色譜和液相色譜第3頁/共32頁4

第一節(jié)薄層色譜法（TLC）

是指將固定相均勻地涂布在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬膜等表面上形成薄層，將被分離物質點在薄層板的一端，置展開室中，展開劑借毛細管作用從薄層點樣的一端展開到另一端，在此過程中不同物質可以進行色譜分離。

根據(jù)不同的分離機制，薄層色譜法可以分為吸附薄層色譜、分配薄層色譜、離子交換薄層色譜和凝膠薄層色譜。第4頁/共32頁5薄層色譜的特點：可以同時平行分離多個樣品；分析成本低；對樣品預處理要求低；薄層板一次性使用，對樣品要求不高；對固定相、展開劑的選擇自由度大。傳統(tǒng)的TLC法缺點：展開時間長、展開劑體積需求大和分離結果差等。其色譜結果易受鋪板質量、點樣技術、展開劑配制、層析環(huán)境中展開劑的飽和度、環(huán)境溫、濕度等因素的影響，有時難于重復；顯色易受均勻性、靈敏度、穩(wěn)定性等影響，這均使測定結果偏差較大。第5頁/共32頁6

是近年來迅速發(fā)展的一種高效、快速、操作簡便、結果準確、靈敏度高和重現(xiàn)性好的薄層色譜新技術，它采用更細、更均勻的改性硅膠和纖維素等為固定相，對吸附劑進行疏水和親水改性，可以實現(xiàn)正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性，已廣泛用于各個領域。高效薄層色譜法highperformancethin-layerchromatography(HPTLC)

與傳統(tǒng)TLC相比，高效薄層色譜法在薄層制備、展開方式、分析鑒定手段以及相配套的儀器設備等方面進行了許多改革，其中最根本的是固定相的改進。第6頁/共32頁7第7頁/共32頁8

而在TLC、HPTLC和UPTLC三種規(guī)格的預制硅膠薄層板中，又以HPTLC最能體現(xiàn)出薄層色譜分析效率高且經(jīng)濟實用的特點。其應用在目前的科研和日常分析中越來越得到普及。無定形HPTLC硅膠的平均粒徑和粒徑分布范圍相對TLC有較大改善，以較短的展開距離和時間就可以獲得較高的理論塔板數(shù)和分離度。由于成分斑點更為集中，因此所需的有效涂層厚度也大為減少，檢測靈敏度也因而較TLC有一個數(shù)量級的提高。第8頁/共32頁9C18：弱極性Diol:二醇醚改性CN：丙基腈改性NH2：丙氨基改性第9頁/共32頁10第10頁/共32頁11第11頁/共32頁12第12頁/共32頁13兩個基本要求：第一，點樣位置需精確；第二，尤其對于定量分析，點樣體積需要精確和準確。點樣

為了提高分離效率，原點在展開方向應該盡可能小，對于HPTLC，應小于1.5mm，點狀點樣：體積受到嚴格限制。在HPTLC板上點狀點樣體積通常為0.1-1μL。溶劑在板上擴散會“環(huán)形色譜”。非接觸噴霧式條帶狀點樣：均勻，可提高解析度和檢測限。由于HPTLC擴散小，10*10cm板可點16個樣品第13頁/共32頁14第14頁/共32頁15薄層色譜有別于其他色譜技術，除了都有固定相和流動相外，還存在氣相。氣相會對分離結果產(chǎn)生顯著影響。展開室預先用展開劑飽和展開距離由于TLC中流動相的速度不是固定的，而是隨展開時間和展開距離增加而降低，所以展開距離有一定限制。通常在HPTLC板上5cm展距分辨率較高

展開第15頁/共32頁161、顯色劑顯色法：噴霧顯色，借助噴霧器噴細霧至板面濕潤。2、紫外線照射法：如AFTB1在WL365nm觀察；3、對本身是有色的斑點則不需顯色。

顯色第16頁/共32頁171、定性：斑點顯色后量出高度，求得Rf值2、定量方法目視直接比較法洗脫測定法薄層掃描法定性定量第17頁/共32頁18薄層掃描法一般由薄層掃描儀完成。該儀器一般由下列部分組成計算機、光源、單色光器、監(jiān)測器、打印機、記錄儀。按測定方法分可分為透射法、反射法。按其掃描方式可分為線性掃描法、鋸齒掃描法、飛點掃描法或稱之為微光點快速掃描法。瑞士和日本島津類型儀器所采用的是鋸齒掃描或飛點掃描法。目前是以鋸齒掃描和飛點掃描法為佳。第18頁/共32頁19第19頁/共32頁20第20頁/共32頁21第21頁/共32頁22

瑞士卡瑪CAMAG公司的儀器全自動、半自動、手動點樣儀

條帶狀噴霧式樣品點樣第22頁/共32頁23CAMAG全自動展開儀（ADC2）

薄層板切割器:第23頁/共32頁24西洋參在UV366下的色譜圖（指紋圖譜）Visualizer數(shù)碼成像系統(tǒng)

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薄層色譜掃描儀、工作站可進行薄層色譜光密度分析一整套儀器要30多萬人民幣第25頁/共32頁26例子：高效薄層色譜法測定人血清中鹽酸胺碘酮

鹽酸胺碘酮為臨床上常用的抗心律失常藥物，其治療指數(shù)低．安全范圍窄，且個體差異大，為了解治療效果與血藥濃度的關系，我們建立高效薄層色譜法(HPTLC)。本法操作簡便易行，不失為臨床鹽酸胺碘酮監(jiān)測的有效方法。第26頁/共32頁27供試品溶液的制備

精密量取血清1.0mL置磨口試管中，加入l.0mLpH3鹽酸溶液，再加人3.0mL的氯仿，振蕩，移出氯仿層。提取兩次。將兩次氯仿液合并，于55°水浴上蒸干，點樣前用約0.1mL氯仿溶解。第27頁/共32頁28

薄層色譜條件

樣品與標準品分別點于同一含羧甲基纖維素鈉(為粘合劑)的硅膠60GF254薄層板上，以無水乙醇一氨水(50：1)為展開劑水平展開，取出晾干，置紫外燈(254nm)下確定斑點位置。斑點顏色為黑褐色第28頁/共32頁29

采用雙波長反射法鋸齒掃描：測定波長242nm，參比波長370rim；背景補償；線性參數(shù)Sx：3；掃描步距Y=0．04；狹縫寬度0.4mm×0.4mm。薄層掃描圖見圖2。薄層掃描條件第29頁/共32頁30血清標準曲線的制備

分別精密吸取對照品溶液(濃度為1.0μg／mL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0μL加人磨口試管中，再加人血清l.0mL，按供試品溶液的制備