免疫分析法的學(xué)習(xí)課件

免疫分析法的學(xué)習(xí)課件第1頁/共34頁第七章免疫分析法一免疫分析法：是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應(yīng)而建立起來的一種生物化學(xué)分析方法。高選擇性和低檢出限。分析方法：放射性免疫、熒光免疫、酶聯(lián)免疫、發(fā)光免疫、電化學(xué)免疫，克隆酶給予體免疫，免疫抗散等。第2頁/共34頁

抗原的概念抗原（antigen,Ag)：是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體和致敏淋巴細(xì)胞)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖膬煞N特性：免疫原性和抗原性（免疫反應(yīng)性）免疫原性（immunogenicity),能刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的能力。免疫反應(yīng)性能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力。凡具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)稱為完全抗原。只有抗原性而不具有免疫原性的物質(zhì)稱為半抗原。半抗原+蛋白質(zhì)——完全抗原賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)稱為載體。第3頁/共34頁1.抗原的免疫原性抗原物質(zhì)必須具備的條件：一、異物性二、一定的理化性狀三、完整性四、宿主的遺傳性第4頁/共34頁一、異物性

異物是指化學(xué)結(jié)構(gòu)與宿主的自身成分相異或機(jī)體的免疫細(xì)胞從未與它接觸過的物質(zhì)。異物性的物質(zhì)包括以下幾類：

1、異種物質(zhì)如：馬血清蛋白、各種微生物及其代謝產(chǎn)物對人體而言都是異種物質(zhì)，具有強(qiáng)的免疫原性。

2、同種異體物質(zhì)如：ABO血型抗原、人類主要組織相容性抗原。

3、自身抗原物質(zhì)如：自身組織成分結(jié)構(gòu)改變、隱蔽性自身成分暴露構(gòu)成自身抗原。第5頁/共34頁二、一定的理化性狀大分子膠體物質(zhì)凡具有免疫原性的物質(zhì)，分子量都較大，一般在10kDa以上,在一定范圍內(nèi),分子量越大免疫原性越強(qiáng)。一定的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)從化學(xué)組成來看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白質(zhì)，其免疫原性較強(qiáng)。從結(jié)構(gòu)來看，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜其免疫原性越強(qiáng)。分子構(gòu)象與易接近性分子構(gòu)象是指抗原分子中一些特殊化學(xué)基團(tuán)的三維結(jié)構(gòu)，它決定抗原分子是否能與淋巴細(xì)胞表面的抗原受體相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化學(xué)基團(tuán)與淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)的抗原受體相互接觸的難易程度。第6頁/共34頁三、完整性

具有一定理化性狀的物質(zhì)須經(jīng)非消化道途徑進(jìn)入機(jī)體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸淋巴細(xì)胞，才能成為良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破壞了其結(jié)構(gòu)，就喪失了免疫原性。自然界中天然的抗原物質(zhì)有：蛋白質(zhì)、多糖、核蛋白第7頁/共34頁四、宿主遺傳性

抗原的免疫原性也與機(jī)體的應(yīng)答能力有關(guān)，同種動(dòng)物不同個(gè)體對同一種抗原的免疫應(yīng)答存在明顯的差異，這種差異受遺傳因素控制，控制免疫應(yīng)答的基因稱為免疫應(yīng)答基因（immuneresponse,Ir)第8頁/共34頁2.抗原的特異性抗原決定簇（基）載體決定簇和半抗原決定簇共同抗原和交叉反應(yīng)第9頁/共34頁一、抗原決定簇1、概念抗原決定簇（antigenicdeterminant,AD)是指抗原中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱為表位（epitope)。表位的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)象決定著抗原的特異性。抗原通過AD與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。2、種類和數(shù)量一個(gè)抗原分子可以有一種或多種不同的AD，一種AD決定著一種特異性，多種AD決定著多種特異性3、部位位于抗原表面的AD能直接被相應(yīng)淋巴細(xì)胞所識別，稱功能性決定簇，存在抗原分子內(nèi)部的AD無激發(fā)免疫應(yīng)答的功能，稱隱蔽決定簇。只有經(jīng)理化因素處理后，使之暴露可能成為新的功能決定簇。第10頁/共34頁4、大小抗原決定簇的大小與相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位相當(dāng)。一個(gè)蛋白質(zhì)抗原決定簇含5-7個(gè)氨基酸殘基一個(gè)多糖抗原決定簇含5-7個(gè)單糖一個(gè)核酸半抗原決定簇含6-8個(gè)核苷酸5、抗原結(jié)合價(jià)（antigenicvalence)是指能和抗體分子結(jié)合的抗原決定簇的總數(shù)。半抗原為一價(jià)天然抗原的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子表面有多個(gè)決定簇為多價(jià)第11頁/共34頁構(gòu)象決定簇：序列上不相連而依賴于蛋白質(zhì)或多糖的空間構(gòu)象形成的決定簇，多暴露于抗原分子表面。順序決定簇：一段相連的氨基酸序列所形成的決定簇，多位于抗原分子內(nèi)部。功能性AD：分子表面，易被識別隱蔽性AD.分子內(nèi)部B細(xì)胞決定簇：分子表面T細(xì)胞決定簇：分子內(nèi)部AD的分類：第12頁/共34頁三、共同抗原和交叉反應(yīng)兩種來源不同的抗原，除各有其主要的特異性抗原決定簇外，相互之間也存在部分相同的抗原決定簇，這種共有的抗原決定簇稱為共同抗原。親緣關(guān)系很近的生物之間存在的共同抗原稱為類屬抗原。無種屬關(guān)系的生物之間存在的共同抗原稱為異嗜性抗原。一種共同抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，可與其他含有共同抗原的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)。第13頁/共34頁3.抗原的分類根據(jù)抗原的性質(zhì)分類：完全抗原半抗原根據(jù)抗原與機(jī)體的親緣關(guān)系分類：異種抗原同種異體抗原自身抗原異嗜性抗原根據(jù)抗原刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體是否需要T細(xì)胞的輔助分類：胸腺依賴性抗原胸腺非依賴性抗原超抗原第14頁/共34頁根據(jù)抗原顆粒大小和溶解性分類：顆粒性抗原和可溶性抗原。根據(jù)抗原的來源：外源性抗原（天然抗原和人工抗原），內(nèi)源性抗原。第15頁/共34頁胸腺依賴性抗原（thymus-dependentantigen,TD-Ag):這類抗原須在抗原提呈細(xì)胞及TH細(xì)胞的參與下才能激活B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原屬于TD-Ag。胸腺非依賴性抗原（thymus-independentantigen,TI-Ag):這類抗原刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體時(shí)不須T細(xì)胞輔助。少數(shù)的多糖抗原屬于TI-Ag。

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表3TD-Ag和TI-Ag的比較

特性TD-AgTI-Ag

化學(xué)特性蛋白質(zhì)多糖

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜具有多種不同決定簇，既有半抗原決定簇又有載體決定簇結(jié)構(gòu)簡單具有重復(fù)出現(xiàn)的同一種抗原決定簇，無載體決定簇

巨噬細(xì)胞參與需要多數(shù)不需要T細(xì)胞依賴性是否

應(yīng)答類型體液免疫和細(xì)胞免疫體液免疫

誘導(dǎo)的Ig類型各類IgIgM

免疫記憶形成不形成

常見的抗原種類牛血清蛋白、卵白蛋白、類毒素肺炎球菌莢膜多糖、脂多糖、聚合鞭毛素第17頁/共34頁超抗原（Superantigen,SAg)：概念：超抗原由White等于1989年提出的，是一類由細(xì)菌外毒素和逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白構(gòu)成的，能與多數(shù)T細(xì)胞結(jié)合并使其活化，極低濃度就能誘發(fā)最大的應(yīng)答效應(yīng)，類似絲裂原的作用。由于這類物質(zhì)具有強(qiáng)大的刺激T細(xì)胞活化的能力，故稱為超抗原。超抗原的種類：外源性超抗原（某些細(xì)菌的外毒素）金葡菌腸毒素A、B、C、D、E（staphylocccusenterotoxin,SE)葡萄球菌毒素休克綜合征毒素1，TSST-1

鏈球菌致熱外毒素A~C和M蛋白關(guān)節(jié)炎支原體絲裂原（MAM)內(nèi)源性超抗原（逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白）小鼠內(nèi)源性超抗原：小鼠乳腺腫瘤病毒蛋白，又叫小鼠次要淋巴細(xì)胞刺激抗原人內(nèi)源性超抗原：人類免疫缺陷病毒蛋白

第18頁/共34頁超抗原的特征：強(qiáng)大的刺激能力，較低濃度的超抗原（10-12克分子）就能使大量的T細(xì)胞活化，占T細(xì)胞庫中的5%-20%。不須抗原提呈細(xì)胞的處理，超抗原的一端和APC表面的MHC-Ⅱ分子結(jié)合，另一端可直接與TCR鏈V區(qū)結(jié)合兩端均為抗原結(jié)合溝槽的外側(cè)，從而產(chǎn)生激活信號，使T細(xì)胞活化。以完整的蛋白質(zhì)分子遞給T細(xì)胞。與T細(xì)胞相互作用無MHC限制性，超抗原需要通過MHC-Ⅱ類分子呈遞給T細(xì)胞，但T細(xì)胞的識別不受MHC限制性。選擇性結(jié)合TCR鏈V區(qū)第19頁/共34頁抗體（antibody，Ab）：是由抗原進(jìn)入機(jī)體刺激B細(xì)胞分化增殖為漿細(xì)胞而合成并分泌的一類能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合并產(chǎn)生免疫效應(yīng)的含有糖基的球蛋白?？贵w分布于體液（血液、淋巴液、組織液及粘膜的外分泌液）中，主要存在于血清內(nèi)。

第20頁/共34頁1.抗體（antibody,Ab）功能性概念

是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白。抗體主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。

2.免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）結(jié)構(gòu)性概念

具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。所有抗體都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗體。第21頁/共34頁二、抗體的生物學(xué)活性

（一）特異性結(jié)合抗原超變區(qū)－表位靜電力、氫鍵、范德華力可逆影響因素：PH、溫度、電解質(zhì)中和效應(yīng)—

中和毒素和病毒與Ag結(jié)合—

促吞噬細(xì)胞吞噬1.結(jié)合基礎(chǔ)2.實(shí)際意義第22頁/共34頁（二）激活補(bǔ)體系統(tǒng)

Ab（IgM、IgG）+Ag→

C1q

→

補(bǔ)體經(jīng)典途徑

IgG4、IgA和IgE的凝聚物→

補(bǔ)體旁路途徑

（三）結(jié)合Fc受體

(1)

介導(dǎo)超敏反應(yīng)：Ⅰ型超敏反應(yīng)；

(2)

調(diào)理作用（opsonization）：IgG+抗原(顆粒性)

→FcγR（單核、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞）→促吞噬細(xì)胞吞噬；

(3)

ADCC：IgG+抗原(靶細(xì)胞)→

FcγR（NK

細(xì)胞）→

殺傷靶細(xì)胞。

（四）通過胎盤和粘膜第23頁/共34頁第24頁/共34頁2.生物學(xué)活性(1)通過胎盤（新生兒抗感染）；(2)激活補(bǔ)體（裂解細(xì)胞）；(3)調(diào)理作用（促進(jìn)吞噬）；(4)介導(dǎo)ADCC（細(xì)胞毒作用）。3.實(shí)際意義(1)抗感染；(2)自身抗體→自身免疫??；(3)介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)(Ⅱ、Ⅲ型)；(4)封閉抗體→腫瘤細(xì)胞逃逸；(5)親合層析法—

IgG純化；(6)免疫學(xué)檢測。

第25頁/共34頁抗體分子的基本結(jié)構(gòu)是由四肽鏈組成的。即：由二條相同的分子量較小的肽鏈(輕鏈)和二條相同的分子量較大的肽鏈(重鏈)組成。第26頁/共34頁輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成一個(gè)四肽鏈分子稱為Ig分子的單體；單體是構(gòu)成所有免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)；所有抗體的單體都是四條肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)，即：兩條糖基化重鏈(H)和兩條非糖基化輕鏈(L)；每條重鏈和輕鏈分為氨基端(N端)和羧基端(C端)。第27頁/共34頁5.單克隆抗體和基因工程抗體一、多克隆抗體（polyclonalantibody）

1.定義：抗原分子通常具有多個(gè)抗原決定簇，動(dòng)物免疫后可刺激多種具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，因而可產(chǎn)生多種針對不同抗原決定簇的抗體。這些由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體（polycolonalantibody,PcAb）。

2.實(shí)際意義（1）預(yù)防、治療感染性疾病（特異性差，可發(fā)生超敏反應(yīng)）（2）臨床診斷第28頁/共34頁二、單克隆抗體（monoclonalantibody,McA