不同標(biāo)準(zhǔn)中單增李斯特氏菌的檢測方法

不同標(biāo)準(zhǔn)中單增李斯

特氏菌的檢測方法

蔡向榮

青島高科園海博生物技術(shù)有限公司

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。

它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。死亡率高達(dá)30%。最常見的后果為導(dǎo)致胎兒或新生兒的腦膜炎或流產(chǎn)。

它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在2-30℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，而且對熱的耐受性較強(qiáng)，常規(guī)的巴氏消毒法不能殺滅，加工中心溫度７０攝氏度以上２分鐘才可被殺滅。是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。

以下比較不同標(biāo)準(zhǔn)中單增李氏菌的檢測方法：一、FDA的檢測方法

通用檢測方法樣品制備、前增菌、選擇性增菌培養(yǎng)

選擇性分離培養(yǎng)

確證試驗(yàn)1、樣品制備樣品混合液的制備:無菌操作從10個樣品中各取50ml或50g,每五種樣品混合成一份250ml或250g,共分兩份(注意取樣要均勻).兩份混合液都加入250ml的BLEB,振蕩混勻.每份樣品勻液各取50ml(固體取25ml)分別放入200mlBLEB中,同時再各取50ml(固體取25ml)置于5℃冰箱中保存,以備計(jì)數(shù).非混合液的制備:

若不需要樣品混合物,則只需取25g樣品放入225ml的BLEB中,混勻,增菌培養(yǎng).同時貯存25g樣品以備計(jì)數(shù).非冷凍樣品,應(yīng)置于5℃下保存;冷凍樣品置于保鮮冰箱中保存,不能冷凍.2、前增菌培養(yǎng)和增菌培養(yǎng)

在BLEB增菌液中30℃培養(yǎng)4h后，加入選擇性試劑,繼續(xù)30℃培養(yǎng)48h.若沒有放線菌酮,也可用25mg/L的匹馬菌素代替,且比放線菌酮更安全.巴氏消毒乳、乳制品、酸乳酪、冷凍水產(chǎn)品等,含有較少的酵母菌和較少霉菌,因此不需加入抗菌劑.但生乳、干的海產(chǎn)品或新鮮產(chǎn)品則需加入抗菌劑.

在增菌培養(yǎng)中，所使用的培養(yǎng)基為緩沖李斯特氏菌增菌液(BLEB)。是否能檢測出單增李斯特氏菌，培養(yǎng)基的質(zhì)量至關(guān)重要。好的增菌液接種10個單增李斯特氏菌，通過增菌培養(yǎng)24-48小時，可增菌到1-10億個菌/ml；不好的增菌液僅能增菌到1萬個菌/ml，若有雜菌干擾便不能分離出目標(biāo)菌。本公司對比了不同廠家的李氏菌增菌液，足可說明此問題。通過下表說明，我公司的EB增菌液可增菌到10-8，國內(nèi)廠家僅增菌到10-4、10-5，國外增菌到10-8。AOAC實(shí)驗(yàn)表明,增菌液菌濃度10000cfu/ml,平板培養(yǎng)大約100cfu/ml.因此,若增菌液中菌濃度太低,試驗(yàn)結(jié)果可能會給出錯誤的陰性結(jié)果.

不同廠家李氏菌增菌液的對比試驗(yàn)

菌濃度生產(chǎn)廠家10-110-210-310-410-510-610-710-8青島海博++++++++++++++++++++++國內(nèi)廠家1+++++++++++---國內(nèi)廠家2+++++++++----MERCK+++++++++++++++++++++3、選擇性分離培養(yǎng)

在24和48h時,挑取BLEB上的菌落劃線接種于任何一種含七葉苷的選擇分離培養(yǎng)基上：OXA、PALCAM、MOX或加入七葉苷和三價鐵的LPM。以上含七葉苷的培養(yǎng)基根據(jù)具體要求而選用。OXA、PALCAM、MOX平板接菌后放置于35℃培養(yǎng)24-48小時，含七葉苷和三價鐵的LPM平板接菌后放置于30℃培養(yǎng)24-48小時。特別推薦以下單增李斯特氏菌與綿羊李斯特氏菌所用的選擇性顯色培養(yǎng)基，例如BCM、ALOA等培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(也可培養(yǎng)24小時)，這樣可以減少綿羊李斯特氏菌掩蓋單增李斯特氏菌。在含七葉苷的培養(yǎng)基上，李氏菌呈黒色，菌落周圍具有黒色的環(huán)。一些其它的細(xì)菌在兩天以后或更長的時間，能夠形成淡棕黒色的菌落。

從OXA、PALCAM、改良LPM培養(yǎng)基或MOX培養(yǎng)基上，挑取5個典型菌落劃線接種到TSAye培養(yǎng)基上，分離純化單菌落。同樣也可劃線接種到BCM培養(yǎng)基，單增李斯特氏菌呈藍(lán)色，而綿羊李斯特氏菌在食品中不常見。單增李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌在ALOA培養(yǎng)基下都呈藍(lán)色且在菌落周圍有酯酶環(huán)。在傳統(tǒng)的檢測方法中，利用TSAye培養(yǎng)基進(jìn)行菌落純化是必須的，因?yàn)檫x擇性培養(yǎng)基上分離出的菌落仍有可能包涵有其它細(xì)菌。至少挑取5個菌落，由于在同一樣品中可能含有幾種李斯特氏菌。BCM和ALOA培養(yǎng)基可以減少挑取的菌落數(shù)。運(yùn)用商業(yè)的Confirmatory培養(yǎng)基，或傳統(tǒng)的木糖/鼠李糖發(fā)酵肉湯或瓊脂，可以區(qū)別單增李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌。TSAye平板需在30℃培養(yǎng)24-48小時，若不需觀察運(yùn)動，也可在35℃培養(yǎng)。

從上面FDA的方法中，可知所采用的選擇性分離平板為OXA或PALCAM或MOX或改良LPM培養(yǎng)基，從中選取一種即可，同時FDA特別重點(diǎn)推薦采用李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基。李氏菌在OXA上李氏菌在PALCAM上單增李斯特氏菌在ALOA顯色培養(yǎng)基上單增李斯特氏菌在ALOA顯色培養(yǎng)基上4、確證試驗(yàn)檢測TSAye平板上的典型菌落形態(tài)，用斜射光觀察是非常有幫助，但不是必須的。從30℃或低于30℃培養(yǎng)的平板上挑取生長良好的典型菌落，涂于潔凈載玻片上，用0.85%生理鹽水制成懸浮液，壓上蓋玻片于相差顯微鏡的油鏡下觀察。李斯特氏菌為短桿狀，有輕微的旋轉(zhuǎn)和翻滾運(yùn)動。而大的桿狀，或快速運(yùn)動的桿狀細(xì)菌則不是李斯特氏菌。應(yīng)用陽性的李斯特氏菌做對照。過氧化氫酶試驗(yàn)：李斯特氏菌陽性反應(yīng)。革蘭氏染色試驗(yàn)：將培養(yǎng)16-24小時的培養(yǎng)物進(jìn)行染色。李斯特氏菌呈短桿狀陽性菌。但若培養(yǎng)時間過長，染色會發(fā)生變化。細(xì)胞呈現(xiàn)Coccoidal菌現(xiàn)象。著色輕的部位呈現(xiàn)柵欄狀，被當(dāng)作類白喉菌排除掉。挑取典型菌落接種到TSBye培養(yǎng)基(進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn))和其它檢測培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)24小時，這些培養(yǎng)物可置于4℃冰箱中保存數(shù)天，以重復(fù)利用。商業(yè)化的試劑盒也可于分離鑒定(見E-11)。溶血試驗(yàn)：將7%羊血瓊脂平板底面劃分為20-25個小格，從TSAye上挑取菌落刺種到血平板上，每格刺種一個菌落，并刺種陽性對照菌(單增李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌)，于35℃培養(yǎng)24-48小時，穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂。于明亮處觀察潔凈的血瓊脂平板，單增李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌無溶血環(huán)，綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生大的透明溶血環(huán)。注意：不要據(jù)此來區(qū)別李斯特氏各種菌，僅僅是一種溶血現(xiàn)象。用CAMP試驗(yàn)來確證李斯特氏各種菌。(注意：當(dāng)血平板的厚度比通常的5mm更薄時，非常容易觀察到溶血環(huán)，另外這可以通過覆蓋一層血瓊脂1-2mm來實(shí)現(xiàn))。硝酸鹽還原試驗(yàn)：這個試驗(yàn)是非必需的。只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸鹽，從而區(qū)別開格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用

TSBye肉湯培養(yǎng)物接種到硝酸鹽肉湯中，35℃培養(yǎng)5天，加入0.2ml

試劑A，再加入0.2ml試劑B，混勻，如出現(xiàn)紫紅色，則表明降解了硝酸鹽，存在亞硝酸鹽。如無顏色變化，則加入少量鋅粉，放置1

小時，如出現(xiàn)紅色，表明仍有硝酸鹽存在，未被細(xì)菌降解。也可按以下過程進(jìn)行檢測:加入0.2ml試劑A，再加入0.2ml試劑C，混勻，如出現(xiàn)桔紅色，則表明降解了硝酸鹽，存在亞硝酸鹽。如無顏色變化，則加入少量鋅粉，放置1小時，如出現(xiàn)桔紅色，表明仍有硝酸鹽存在，未被細(xì)菌降解。動力試驗(yàn)：由TSBye肉湯培養(yǎng)物接種到SIM培養(yǎng)基或MTM培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)7天，逐日觀察，李斯特氏菌有動力，呈傘狀生長。從

MTM培養(yǎng)基上形狀尤為突出，可以明顯觀察到傘形。另外，通過相差顯微鏡，可以觀察30℃TSBye培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物的翻滾運(yùn)動。糖發(fā)酵試驗(yàn)：將TSBye上培養(yǎng)物接種于含以下0.5%糖的紫色肉湯中(可加入小倒管)：葡萄糖、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培養(yǎng)7天。陽性反應(yīng)是產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不同菌種的生化反應(yīng)見表1。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖都是陽性反應(yīng)。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外的李斯特氏菌對甘露醇呈陰性反應(yīng)。若OXA、PALCAM、MOX或LPM(加七葉苷和三價鐵)的純化物著色是確定的，則七葉苷發(fā)酵實(shí)驗(yàn)可省略CAMP試驗(yàn)：當(dāng)溶血試驗(yàn)結(jié)果不確定時，可用CAMP實(shí)驗(yàn)來區(qū)別李斯特氏菌的各個種。在羊血瓊脂平板上劃兩條平行線，兩條線上分別接種β型溶血金黃色葡萄球菌與馬紅球菌培養(yǎng)物。在該兩線之間，垂直劃線，接種待測培養(yǎng)物，與兩線相近但不相交，于35℃培養(yǎng)24-48小時后，觀察溶血情況。單增李斯特氏菌與西爾李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌接種點(diǎn)附近的溶血增強(qiáng)，其它李斯特氏菌不溶血。單增李斯特氏菌在24小時溶血現(xiàn)象比在48小時更明顯。為使馬紅球菌能長出一條很好的劃線，需要將斜面培養(yǎng)物培養(yǎng)48小時，而不是24小時。同時，羊血瓊脂平板需新鮮配制。李斯特氏菌血清學(xué)試驗(yàn)小鼠毒力實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋

計(jì)數(shù)（要求）：若樣品經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定含有單增李斯特氏菌，那就要用保存的那部分進(jìn)行計(jì)數(shù)二、USDA-FSIS檢測方法1、樣品制備(略)2、增菌培養(yǎng)第一步增菌培養(yǎng)：用UVM肉湯，30±2℃培養(yǎng)22±2h第二步增菌培養(yǎng)：用Fraser肉湯，從UVM增菌肉湯中取0.1±0.02ml培養(yǎng)液加入10±0.5mlFraser肉湯中，35±2℃

培養(yǎng)24-48小時。3、選擇性分離培養(yǎng)

取0.1ml30±2℃培養(yǎng)22±2hUVM肉湯培養(yǎng)物，劃線接種到MOX平板上，35±2℃培養(yǎng)24-48小時，檢查有無黑色菌落，并菌落外圍有黑色環(huán)。Fraser肉湯培養(yǎng)26±2小時，出現(xiàn)明顯黑色，取0.1±0.02ml培養(yǎng)物接種到MOX平板上35±2℃至少培養(yǎng)24小時，若Fraser肉湯培養(yǎng)26±2小時，沒有出現(xiàn)明顯黑色，繼續(xù)培養(yǎng)至48±2小時，出現(xiàn)明顯黑色，取0.1±0.02ml培養(yǎng)物接種到MOX平板上35±2℃至少培養(yǎng)24小時。若培養(yǎng)48小時，仍沒有出現(xiàn)明顯黑色，并在XOA上沒有可疑菌落，則此樣品為單增李斯特氏菌陰性。從XOA平板上挑取至少20個可疑菌落，接種到HL瓊脂平板上，35±2℃培養(yǎng)18-26小時，在暗光線下檢查是否有小的β溶血環(huán)。如果有，挑取單菌落進(jìn)行確證試驗(yàn)。如果沒有，此樣品為單增李斯特氏菌陰性。4、確證試驗(yàn)(略)李氏菌在Half-FRASER和

FRASER培養(yǎng)基上李氏菌在血瓊脂平板上三、ISO檢測方法1、樣品制備(略)2、增菌培養(yǎng)第一步增菌培養(yǎng)：用Half-Fraser肉湯，30℃培養(yǎng)24h第二步增菌培養(yǎng)：用Fraser肉湯，從Half-Fraser肉湯中取0.1ml培養(yǎng)液加入10mlFraser肉湯中,35℃培養(yǎng)24-48小時。3、選擇性分離培養(yǎng)

取0.1ml30±2℃培養(yǎng)24hHalf-Fraser肉湯培養(yǎng)物，劃線接種到PALCAM平板上，35℃培養(yǎng)24-48小時，檢查有無黑色菌落，并菌落外圍有黑色環(huán)。Fraser肉湯培養(yǎng)24小時，出現(xiàn)明顯黑色，取0.1±0.02ml培養(yǎng)物接種到MOX平板上35℃至少培養(yǎng)24小時，若Fraser肉湯培養(yǎng)24小時，沒有出現(xiàn)明顯黑色，繼續(xù)培養(yǎng)至48小時，出現(xiàn)明顯黑色，取0.1ml培養(yǎng)物接種到PALCAM平板上35℃至少培養(yǎng)24小時。若培養(yǎng)48小時，仍沒有出現(xiàn)明顯黑色，并在PALCAM上沒有可疑菌落，則此樣品為單增李斯特氏菌陰性。4、確證試驗(yàn)(略)5、結(jié)論：

ISO方法中，增菌培養(yǎng)采用二步增菌培養(yǎng)法，并可通過增菌液的顏色變化來判斷有無李斯特氏菌，所采用的增菌培養(yǎng)基為Half-Fraser肉湯和Fraser肉湯。所用的分離平板為PALCAM培養(yǎng)基。本方法幾乎可用于所有食品中李斯特氏菌的檢測。四、SN檢測方法1、樣品制備(略)2、前增菌和增菌培養(yǎng)前增菌：巴氏消毒乳，乳制品、冷凍水產(chǎn)品、凍肉及其他加工食品均應(yīng)進(jìn)行前增菌。無菌操作稱取25g樣品，加入裝有225ml的改良緩沖蛋白胨水的均質(zhì)杯內(nèi)，高速均質(zhì)1-2min，制成1：10樣品均液，轉(zhuǎn)入500ml廣口瓶內(nèi)；液體食品可用吸管吸取同上，30℃培養(yǎng)24h、48h，稱取1ml，轉(zhuǎn)種于100ml增菌培養(yǎng)液（EB增菌液）內(nèi)，于30℃培養(yǎng)24h、48h，分別進(jìn)行分離。直接增菌：生乳、鮮肉及未經(jīng)加工處理過的樣品，不必經(jīng)過前增菌。檢驗(yàn)時，以無菌操作稱取25g（ml）樣品，按前法所述，用225mlEB增菌培養(yǎng)液代替改良緩沖蛋白胨水制成1：10樣品均液，于30℃培養(yǎng)24h和48h，分別進(jìn)行分離。3、選擇性分離培養(yǎng)取增菌液一環(huán)，劃線接種于選擇性培養(yǎng)基，（MMA或OXA）平板上，35℃培養(yǎng)24-48h。斜射光檢驗(yàn)：將解剖鏡、斜射燈、平面鏡，使光源以45度角照射到平面鏡上，再反射為解剖光源。將MMA平板放在解剖鏡載物臺上，通過目鏡垂直向下觀察，李斯特氏菌在此平板上，呈藍(lán)色或藍(lán)灰色，扁平圓潤，稍有突起，邊緣整齊，菌落較小，均為0.5mm左右，使用解剖鏡觀察，并挑取5個可疑菌落，劃線接種于胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（YSA-YE）平板，于35℃培養(yǎng)18-24h，純培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。黑色菌落觀察，李斯特氏菌在OXA平板上，生長24h后菌落呈黑色，直徑1mm在其周圍形成一個黑色環(huán)。培養(yǎng)48h，菌落仍呈黑色，直徑2-3mm，除在菌落周圍有一環(huán)外，在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。挑取5個可疑菌落，接種于胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（YSA-YE）平板，純培養(yǎng)后鑒定。4、確證試驗(yàn)(略)5、結(jié)論：

SN方法中，前增菌采用改良緩沖蛋白胨水，增菌培養(yǎng)采用EB增菌液。所用的分離平板為MMA培養(yǎng)基或OXA瓊脂。五、GB檢測方法

檢樣EB增菌液25mlLB1增菌液225mlLB2增菌液225ml選擇性培養(yǎng)基（MMASIM動力培養(yǎng)基TSI瓊脂TSA-YE培養(yǎng)基

革蘭氏染色顯微鏡下觀察運(yùn)動MR-VP試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)甘露醇試驗(yàn)?zāi)咎窃囼?yàn)鼠李糖試驗(yàn)七葉苷試驗(yàn)溶血試驗(yàn)協(xié)同溶血試驗(yàn)小鼠致病性試驗(yàn)1、樣品制備(略)2、增菌培養(yǎng)

a、EB增菌液放30±1℃培養(yǎng)48h～7d,b、LB1增菌液30±1℃，培養(yǎng)2