實驗五微生物的大小

實驗五微生物的大小第一頁，共二十四頁，2022年，8月28日了解光電比濁計數(shù)法的原理。學習、掌握光電比濁計數(shù)的操作方法。通過細菌數(shù)量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長曲線。

實驗(一)大腸桿菌生長曲線的測定一、實驗目的第二頁，共二十四頁，2022年，8月28日生長曲線

將少量純種單細胞微生物接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細胞數(shù)量，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以菌數(shù)為縱坐標作圖，得到一條反映單細胞微生物在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。二、實驗原理一個典型的生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個時期第三頁，共二十四頁，2022年，8月28日稀釋平板計數(shù)法對樣品稀釋培養(yǎng)，據(jù)形成的菌落數(shù)計數(shù)。優(yōu)點：活菌計數(shù)方法，對設備要求不高。缺點：操作復雜。顯微鏡直接計數(shù)法使用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。優(yōu)點：操作簡便，計數(shù)直觀。缺點：計數(shù)結果為活細菌和死菌體的總和。第四頁，共二十四頁，2022年，8月28日光電比濁法光電比濁法是利用在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比的原理。當細菌細胞在溶液中數(shù)量越多，濁度越大，在光電比色計中測定時所吸收的光線越多。優(yōu)點：簡便快速，適合于自動控制。

缺點：測定結果受培養(yǎng)液成分影響；某些樣品樣品不適合用此法。

第五頁，共二十四頁，2022年，8月28日菌種培養(yǎng)不同時段的大腸桿菌。儀器或其他用具分光光度計，比色皿等。三、實驗器材第六頁，共二十四頁，2022年，8月28日開電源，儀器預熱20min，將波長調至600nm處。打開樣品室，將擋光體插入比色皿架，將其推或拉入光路。蓋好樣品室蓋，在TMODE下，按0%T鍵調零透射比。取出擋光體，按100%T/OA鍵調100%透射比。四、實驗步驟1.樣品測試前的調試第七頁，共二十四頁，2022年，8月28日2.樣品測定將參比溶液（未接種的LB液體培養(yǎng)基）以及被測溶液倒入比色皿中。打開樣品室蓋，將參比溶液放在樣品架的第一個槽位中，將被測溶液依次放入其它槽位。將參比溶液推入光路，按100%T/OA鍵調滿度。按MODE，將測試方式調至吸光度方式（A）。此時,顯示器顯示“0.000”。將被測溶液推入光路，顯示器顯示為被測樣品的吸光值。第八頁，共二十四頁，2022年，8月28日

在600nm波長下，用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對照，分別對培養(yǎng)了0、4、8、12、16和20h的大腸桿菌培養(yǎng)液，進行光電比濁測定。比色皿經(jīng)蒸餾水清洗后，必須經(jīng)待測樣品潤洗。比色皿的毛面用吸水紙擦干，而光面只能用吸水紙吸干，以免光面被劃破。比色皿之間吸光度進行比較。第九頁，共二十四頁，2022年，8月28日四、實驗結果記錄不同大腸桿菌培養(yǎng)液的OD600值，并繪制大腸桿菌的生長曲線。

培養(yǎng)時間（h）48121620

光密度值OD600五、思考題光電比濁計數(shù)的原理是什么？這種計數(shù)法有何優(yōu)缺點？第十頁，共二十四頁，2022年，8月28日學習使用鏡臺測微尺和目鏡測微尺在顯微鏡下測定微生物大小的方法。實驗(二)微生物大小的測定一、目的要求第十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日對于病毒、細菌、放線菌、真菌和原生動物等不同類型的微生物來說，它們的大小存在很大的差異。在同一類型中不同種類的微生物，或同一種類中不同時期的微生物個體，它們的大小也存在很大的差異。二、實驗原理第十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日

鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將lmm等分為100格，每格長0.01mm(即10um)，用于校正目鏡測微尺每格的相對長度。目鏡測微尺是一塊中央有精確的等分刻度的圓形小玻片，置于接目鏡中的隔板上。目鏡測微尺每小格所代表的實際長度不一樣，測量前，必須先用鏡臺測微尺進行校正。第十三頁，共二十四頁，2022年，8月28日目鏡測微尺鏡臺測微尺利用鏡臺測微尺測定目鏡測微尺的每格絕對值目鏡測微尺測定微生物大小第十四頁，共二十四頁，2022年，8月28日三、實驗器材1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2、器材：顯微鏡、鏡臺測微尺、目鏡測微尺第十五頁，共二十四頁，2022年，8月28日三、實驗步驟1、目鏡測微尺的校正鏡臺測微尺有刻度的一面朝上，置顯微鏡載物臺上，先在低倍鏡下，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央。轉動目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內兩線完全重合，分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺微尺和目鏡微尺所占的格數(shù)。計算40x下目鏡測微尺的校正值。目鏡測微尺每格長度（um）＝兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10/兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)2、細胞大小的測量酵母菌懸液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，置顯微鏡載物臺上。用目鏡測微尺測量細胞寬和長。第十六頁，共二十四頁，2022年，8月28日三、實驗結果計算出目鏡測微尺校正結果以及酵母菌大小測定結果四、思考題1、為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正？第十七頁，共二十四頁，2022年，8月28日1、明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理。2、掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。

實驗(三)微生物數(shù)量的測定一、目的要求第十八頁，共二十四頁，2022年，8月28日二、實驗原理顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種方法。顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點是直觀、快速。缺點是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結合活菌染色，微室培養(yǎng)等方法來達到只計數(shù)活菌體的目的。

第十九頁，共二十四頁，2022年，8月28日血細胞計數(shù)板由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室是由一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；共計400個小方格。每一個大方格的面積為1mm2，蓋玻片與計數(shù)區(qū)之間的高度為0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1mm3。計數(shù)時，通常在40×下數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，以及大方格中的總菌數(shù)，再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。(1ml=?mm3)第二十頁，共二十四頁，2022年，8月28日１個計數(shù)室＝１×１mm包含５×５個中方格１個中方格＝４×４個小方格第二十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日三、實驗器材

1、菌種：釀酒酵母2、器材：顯微鏡、血球計數(shù)板第二十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日三、實驗步驟

1、在10×和40×下找到計數(shù)室。2、蓋上蓋玻片將搖勻的釀酒酵母菌（或大腸桿菌）懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室。如滴入過多，溢出并流入兩側槽內，使蓋玻片浮起，體積改變，會影響計數(shù)結果，需用濾紙把多余的溶液吸出，以槽內沒有溶液為宜。如滴入溶液過少，經(jīng)多次充液，易產(chǎn)生氣泡，應洗凈計數(shù)室，干燥后重做。3、靜置，先用低倍鏡將計數(shù)室移至視野中央。4、在高倍下計數(shù)：每個計數(shù)室選5個中格(4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數(shù)。對于分布在刻線上的細菌，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進