病原生物與免疫學(xué)實驗教材 實驗六教學(xué)課件

實驗六

白喉桿菌、厭氧菌、分枝桿菌

病毒及其它微生物實驗內(nèi)容操作白喉棒狀桿菌（呂氏血清斜面）：Albert染色法病毒血凝試驗示教破傷風(fēng)梭菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)特性結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)特性病原性真菌形態(tài)、培養(yǎng)特性血凝抑制試驗示教片：觀察結(jié)核分枝桿菌、鉤端螺旋體、新型隱球菌和病毒包涵體的形態(tài)目的要求熟悉白喉棒狀桿菌的形態(tài)熟悉結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)和培養(yǎng)特性熟悉破傷風(fēng)梭菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)特性了解病原性真菌形態(tài)和培養(yǎng)特性掌握鉤端螺旋體、病毒包涵體的基本形態(tài)了解恙蟲病立克次體的基本形態(tài)了解病毒血凝試驗、血凝抑制試驗的方法，掌握基本原理Albert染色法制片同革蘭染色，甲液染5分鐘→水洗→再以乙液（碘液）染1分鐘→水洗→印干→油鏡檢

白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)Albert染色：見異染顆粒，菌體藍綠色，異染顆粒藍黑色（用于鑒定）病毒的血凝試驗血凝素（hemagglutininHA）：由病毒基因編碼的糖蛋白刺突。與病毒吸附和傳入宿主細胞有關(guān)。HA能與人或其它動物多種紅細胞表面N－乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細胞凝集。滴定病毒的血凝效價，采用一定的病毒量，通常采用4個血凝單位?？滋?23456789生理鹽水（ml）病毒液（ml）0.9+0.10.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.50.5棄掉病毒稀釋度1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶1280對照雞紅血球細胞懸液（ml）各0.5ml血凝試驗（血凝效價的滴定)將有機玻璃板孔從1~9進行編號，從第1孔起至第9孔，按下表加。將病毒液按下表進行稀釋。自第9孔開始反方向向前每孔加入0.5%雞紅血球0.5ml，搖勻后放置室溫45分鐘血凝試驗結(jié)果判定結(jié)果判定：薄層（凝集）圓點（不凝集）凝集特別顯著：“＋＋＋＋”凝集現(xiàn)象次之：“＋＋＋”凝集清楚可見：“＋＋”稍顯凝集者：“＋”血凝單位：呈“＋＋”凝集時的最高稀釋度。此時的稀釋度即為1個血凝單位。血平板庖肉培養(yǎng)基牛奶培養(yǎng)基破傷風(fēng)梭菌37℃48h，薄膜狀爬行生長物，邊緣不齊，伴輕度β溶血肉湯混濁，肉渣部分被消化，呈灰白色產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落平整，光滑，邊緣齊。有雙層溶血環(huán)：內(nèi)層完全溶血(θ毒素引起)，外層不完全溶血(α毒素引起)分解肉渣中糖類而產(chǎn)生大量氣體。分解乳糖產(chǎn)酸，指示劑變黃，培養(yǎng)基凝固,產(chǎn)生大量氣體,呈蜂窩狀,將液面凡士林上推,甚至沖走管口棉篩?！皼坝堪l(fā)酵”示教：破傷風(fēng)梭菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)特性的培養(yǎng)特性示教：結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)特性專性需氧，最適37℃，營養(yǎng)要求高，生長緩慢，18h分裂一代。羅氏(Lowenstein-Jensen)培養(yǎng)基含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽、孔雀綠，2~6周可見菌落生長菌落特點：菜花、顆?；蚪Y(jié)節(jié)狀菌落，乳白色或黃色，不透明。黃曲霉示教：真菌的培養(yǎng)特性多細胞真菌：觀察氣生菌絲，營養(yǎng)菌絲，表面隆起，淺溝及菌落基底顏色。單細胞真菌：酵母型菌落新型隱球菌：菌落圓形，較大，濕潤呈蠟狀，乳白色類酵母型菌落白假絲酵母菌：：菌落圓形，較大，白色菌落底層有假菌絲原理病毒引起的血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)的抗血凝素抗體所抑制，稱血凝抑制。利用血凝素特異性抗體與病毒表面相應(yīng)的HA相互作用，使病毒血凝現(xiàn)象抑制的試驗稱血凝抑制試驗。4個血凝單位的病毒液血凝抑制試驗血凝抑制試驗結(jié)果判定測定孔：圓點（不凝集）薄層（凝集）血清對照孔：圓點（不凝集）病毒對照孔：薄層（凝集）RBC對照孔：圓點（不凝集）血凝抑制試驗效價：呈完全血凝抑制的最高血清稀釋度。

抗酸染色法(acid-faststain)：以5％石炭酸復(fù)紅染色，再用3％鹽酸酒精脫色，然后用美藍復(fù)染，則分枝桿菌呈紅色(+)，其他細菌和背景物質(zhì)為藍色(-)。實驗過程：取痰液→涂片（略厚）→干燥→固定→石炭酸復(fù)紅染色8~10分鐘后→用3%的鹽酸酒精脫色約1~2分鐘，脫色時輕搖玻片，直到涂片顏色脫去為止→水洗后，用堿性美藍復(fù)染1分鐘→水洗，印干→鏡檢結(jié)核分枝桿菌抗酸染