植物體細(xì)胞無性系變異及突變體篩選

關(guān)于植物體細(xì)胞無性系變異及突變體篩選第1頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四

將植物外植體在組織培養(yǎng)過程中，由于受到非生物因子的誘導(dǎo)發(fā)生變異，進(jìn)而導(dǎo)致再生植株發(fā)生遺傳變異的現(xiàn)象稱為體細(xì)胞無性系變異（somaclonalvariation）。植物體細(xì)胞無性系變異現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象。并可產(chǎn)生有益變異性狀，對品種改良具有重要意義，已成為植物種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種選育的有效途徑。第2頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四一、體細(xì)胞無性系變異的廣泛性體細(xì)胞無性系變異主要表現(xiàn)：

(1)植株外部形態(tài)變異，如株高、葉形、葉色等；

(2)育性上的變異；

(3)生長勢上的變異；

(4)抗性變異；

(5)某些酶及同工酶變化；

(6)次生代謝物的差異。第3頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四第4頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四二、植物體細(xì)胞無性系變異的來源源于外植體預(yù)先存在的變異

所用外植體體內(nèi)存在變異細(xì)胞，由變異細(xì)胞再生的植株可能為變異植株。2.離體培養(yǎng)誘導(dǎo)的變異：

植物組織培養(yǎng)本身對植物細(xì)胞產(chǎn)生一種脅迫作用，從而誘發(fā)植物細(xì)胞發(fā)生可遺傳變異和表觀遺傳變異（epigeneticvariation）。表觀遺傳變異是指不是由DNA序列改變而引起的植株表型變異。第6頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（1）培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件：

植物激素和生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)體細(xì)胞無性系變異的重要原因之一，培養(yǎng)基中含有多種激素時，其誘變率大于單一激素。生長素既能促進(jìn)多倍體細(xì)胞分裂，又能誘導(dǎo)多倍體，尤其是2，4-D具有更強(qiáng)的誘變作用。此外，高溫、低溫等培養(yǎng)條件也能促進(jìn)染色體變異。部分植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)比固體培養(yǎng)易變異。（2）植株再生途徑：

體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑遺傳穩(wěn)定性優(yōu)于器官發(fā)生途徑，尤其是經(jīng)歷脫分化形成愈傷組織的間接器官發(fā)生途徑變異頻率較高。

第7頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（3）培養(yǎng)時間和繼代頻率：

繼代培養(yǎng)時間越長，變異率越高。如香蕉莖尖繁殖經(jīng)過5、7、9、11次繼代培養(yǎng)，體細(xì)胞無性系變異率分別為1.3%、1.3%、2.9%、3.8%。（4）母本植株的遺傳狀態(tài)：

不同物種再生植株變異率存在差異，同意物種不同品種無性系變異率也有差別，同一物種多倍體變異率高于二倍體。同一植株不同外植體變異率也存在差異。第8頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四三、體細(xì)胞突變體的特征和類型：特征：突變發(fā)生的頻率較低；(2)突變隨機(jī)發(fā)生具有偶然性；(3)突變的表型在沒有選擇壓力的條件下仍然穩(wěn)定；(4)表現(xiàn)型應(yīng)能通過有性傳遞保持其特性。第9頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四2.體細(xì)胞突變體的類型：（1）營養(yǎng)缺陷型：

EMS(甲基磺酸乙酯)處理煙草懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)突變，通過加入BUdR（5-溴脫氧尿苷）進(jìn)行篩選。已選擇出需要生物素、次黃嘌呤、對氨基苯甲酸、賴氨酸、精氨酸及脯氨酸的六種營養(yǎng)缺陷型。第10頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（2）抗性突變體：

A.抗氨基酸及類似物的突變體選擇相應(yīng)的氨基酸生產(chǎn)過量的抗性突變體，原理是關(guān)鍵酶對反饋抑制不敏感，超越常量的合成對應(yīng)氨基酸，或能減少或拒絕攝入氨基酸或類似物，或能分解和轉(zhuǎn)化而解毒。第11頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四B.抗抗菌素藥物突變體：抗鏈霉素、卡那霉素和氯霉素等突變體，多為細(xì)胞質(zhì)遺傳。煙草細(xì)胞抗鏈霉素細(xì)胞系在（250-500ug/ml）的鏈霉素培養(yǎng)基上再生植株表現(xiàn)綠色。

第12頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四C.抗除草劑突變體：培養(yǎng)在添加除草劑Picloram（4-氨基-3，5，6三氯吡啶羧酸）培養(yǎng)基上的煙草中，分離出抗除草劑突變體。這類抗性屬于單個顯性或半顯性突變遺傳。第13頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四D.抗病突變體：煙草單倍體細(xì)胞經(jīng)EMS處理后，培養(yǎng)在添加蛋氨酸磺基圬（病毒素類似物）的培養(yǎng)基上，由存活的細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織并分化成植株，對病原體感染不敏感。第14頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四E.其他突變體：抗核酸堿基類似物的突變體體；碳源利用突變體；激素自養(yǎng)型突變體；溫度敏感突變體；耐鹽、耐早等環(huán)境脅迫的突變體等。第15頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四四、體細(xì)胞無性系變異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)：

體細(xì)胞無性系變異具有其遺傳基礎(chǔ)，表現(xiàn)在染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變異、基因突變、擴(kuò)增、丟失、重排和轉(zhuǎn)座子激活等。染色體數(shù)目變異體細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的染色體數(shù)目變異主要源自有絲分裂過程中紡錘體的異常。在細(xì)胞分裂的后期，不同程度的紡錘體缺失導(dǎo)致染色體不分離、移向多級、滯后或不聚集，最終產(chǎn)生變異。第16頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（1）整倍體變異

染色體自然加倍現(xiàn)象稱為體細(xì)胞內(nèi)多倍化，可能是在有絲分裂過程中紡錘體合成受阻引起，也可能是細(xì)胞質(zhì)不分裂而形成多核細(xì)胞。（2）非整倍體變異非正倍體的出現(xiàn)多是由于多級紡錘體出現(xiàn)、染色體不分離或滯后以及核碎裂等導(dǎo)致。2.染色體結(jié)構(gòu)變異

包括染色體斷裂后經(jīng)過修復(fù)和重新連接形成的易位、倒位、缺失和重復(fù)等結(jié)構(gòu)變異。第17頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（3）基因突變包括核基因突變和細(xì)胞質(zhì)基因突變?；蛲蛔兎譃殡[形單基因或多基因突變和顯性單基因或多基因突變。（4）轉(zhuǎn)座因子活化轉(zhuǎn)座因子是指能在基因組中移動和修飾基因表達(dá)的DNA序列。轉(zhuǎn)座因子插入到新的基因位點(diǎn)引起鄰近基因轉(zhuǎn)錄特性不穩(wěn)定地抑制或修飾，轉(zhuǎn)座作用可可以造成染色體斷裂、染色體缺失、重復(fù)、倒位和易位，而引起性狀變異。轉(zhuǎn)座子激活也是體細(xì)胞無性系變異的主要原因之一。

(5)DNA甲基化甲基化是指DNA復(fù)制后，在DNA甲基化酶的催化下，將S-腺苷酰甲硫氨酸（SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到DNA分子的胞嘧啶堿基上的DNA修飾過程。當(dāng)一些基因的某些位置甲基化后，其基因表現(xiàn)為不活躍的非表達(dá)基因；去甲基化后，則活躍表達(dá)。組織培養(yǎng)誘發(fā)的突變直接或間接與DNA甲基化狀態(tài)改變有關(guān)。第18頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四五、體細(xì)胞突變體的誘發(fā)和篩選：1、材料的選擇：

選擇原則：避免采用不能再生或難以再生的材料；要選用染色體穩(wěn)定的細(xì)胞系進(jìn)行起始誘導(dǎo)。要選擇生長速度快的細(xì)胞。第19頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四2、細(xì)胞的來源：愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體。（1）愈傷組織：優(yōu)點(diǎn)：取材方便缺點(diǎn)：生長較懸浮細(xì)胞慢；接觸選擇劑不均勻；聚集體較大，抗性細(xì)胞不易正常生長；物理或化學(xué)誘變作用不均一。第20頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（2）懸浮細(xì)胞：廣泛采用的材料；缺點(diǎn)是存在細(xì)胞聚集的現(xiàn)象影響誘變效果。（3）原生質(zhì)體：是比較理想的誘變細(xì)胞來源。缺點(diǎn)是植株再生困難。第21頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四3、突變的誘發(fā)：（1）誘變因素：

可以采用物理或化學(xué)的方法進(jìn)行誘變處理。如，如EMS，NG(亞硝基胍)，和r射線等。但誘變劑并非必需，許多突變體的獲得不需添加誘變劑，如抗菌素突變體的獲得無需加入誘變劑，直接利用選擇劑進(jìn)行篩選。第22頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四第23頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四物理誘變劑：優(yōu)點(diǎn)不需洗滌誘變劑，缺點(diǎn)是需要特定的設(shè)備。UV是常用的誘變因子；Γ射線等進(jìn)行輻射處理誘變。第24頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)誘變劑：誘變處理后需要去除。

依據(jù)對DNA作用方式可分為三類：

A.與核酸堿基反應(yīng)而且留在原位，從而引起DNA復(fù)制時堿基配對的改變。如亞硝酸，硫酸二乙酯，EMS，乙烯亞胺，亞硝基胍等；

B.天然堿基類似物，在核酸復(fù)制時，它們可摻入到新合成的DNA分子中。如BUdR，8-氨基鳥嘌呤，2-氨基嘌呤等；

C.移碼突變，如丫啶類物質(zhì)等。第25頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（2）誘變因子劑量與誘變方法選擇：誘變時期、誘變劑量、劑量率影響誘變效果。誘變方法：較低劑量的誘變劑處理，或不同劑量率的誘變劑處理，或采用復(fù)合誘變，兩種誘變劑同時使用；一種誘變劑多次使用；兩種誘變劑交替使用。第26頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四

當(dāng)誘變處理時，可在培養(yǎng)基中加入誘變劑。誘變處理后用大量稀釋法或用解毒劑終止誘變劑的作用。誘變處理的另一種方法是，先在植株水平上進(jìn)行誘變處理，再在組織培養(yǎng)中篩選．如抗除草劑突變體的獲得。第27頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四第28頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四4、突變體的選擇：（1）正選擇法：直接選擇法，突變細(xì)胞能夠在有毒或有害培養(yǎng)基上生長?？剐酝蛔凅w，激素自養(yǎng)型突變體等。第29頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（2）負(fù)選擇法：采用某一非允許條件的培養(yǎng)基，使突變體不能生長，而野生型能夠生長，然后添加一負(fù)選擇劑，殺死生長細(xì)胞，而不能殺死不生長的突變細(xì)胞，而保留下來受到選擇。第30頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四（3）突變體鑒定：細(xì)胞從選擇性培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到非選揮性培養(yǎng)基上快速生長，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)達(dá)到足夠大時再轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，然后再轉(zhuǎn)移到植株分化培養(yǎng)基上(非選擇性培養(yǎng)基)，可在植株水平上檢測突變的表達(dá)。第31頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四六、突變體的利用：理論研究和品種改良方面應(yīng)用。

1.生化代謝途徑的研究；營養(yǎng)缺陷型突變體研究，如煙草硝酸還原酶突變體研究。第32頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四第33頁，共37頁，2023年，2月20日，星期四2、植物細(xì)胞遺傳操作中的選擇標(biāo)記體細(xì)胞雜交中作為選擇標(biāo)記，硝酸還原酶細(xì)胞突變體及激素自養(yǎng)型突變體的利用。第34頁，