第四章植物細胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)演示文稿

第四章植物細胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)演示文稿當前1頁，總共57頁。優(yōu)選第四章植物細胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)當前2頁，總共57頁。

植物細胞工程的含義：通過細胞、組織、器官培養(yǎng)以及細胞融合等，達到改良品種、快速繁殖或生產(chǎn)生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。

研究內(nèi)容：

細胞工程基本技術(shù)

細胞、組織、器官培養(yǎng)

原生質(zhì)體培養(yǎng)

細胞融合及培養(yǎng)當前3頁，總共57頁。4.1植物細胞工程的基本原理

植物細胞的全能性

1934年，White首次定義為:每個植物活細胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。

70年代，擴大了以上定義范圍，為：植物活細胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。

80年代初，認為：任何植物的離體細胞在人工培養(yǎng)下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養(yǎng)細胞的藥物生物合成的能力。

當前4頁，總共57頁。

一個細胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力稱之為細胞的全能性。

細胞全能性的絕對性與相對性:

不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng);即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體；動、植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。當前5頁，總共57頁。當前6頁，總共57頁。植物細胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細胞類型不同從強到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細胞>厚壁細胞(木質(zhì)化細胞)>特化細胞(篩管、導管細胞)；根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導組織>厚壁組織。當前7頁，總共57頁。

脫分化：具有特異結(jié)構(gòu)和功能的細胞轉(zhuǎn)化成沒有特異結(jié)構(gòu)和功能的細胞的過程稱為脫分化。（如根、莖、葉）

再分化：是指離體培養(yǎng)物可以由脫分化狀態(tài)再度分化。包括細胞分化、組織分化和器官分化遞進地進行，最后再生完整植株。當前8頁，總共57頁。當前9頁，總共57頁。植物激素的調(diào)控作用

激素在細胞分化中的作用，可能是通過在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上的調(diào)節(jié)作用而影響相關(guān)基因的表達從而調(diào)控細胞分化。但應(yīng)該注意到，在植物中細胞種類的不同或同一種細胞不同的發(fā)育狀態(tài)，均會影響該種細胞對激素的反應(yīng)，即靶細胞反應(yīng)差異，所以試圖尋找不同激素在分化中作用的共同模式可能是很困難的。當前10頁，總共57頁。4.2植物細胞和組織培養(yǎng)所需的營養(yǎng)和環(huán)境條件

培養(yǎng)基的組成和配制

影響植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件當前11頁，總共57頁。培養(yǎng)基的組成和配制4.2.1.1培養(yǎng)基的基本成分（1）無機成分培養(yǎng)的植物組織、器官、細胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無機化學物質(zhì)，除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營養(yǎng)元素。當前12頁，總共57頁。

大量元素

培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培養(yǎng)基中加入量最多的是N，N一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供。微量元素

微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl

其他一些化學藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過多，多會引起生長抑制等毒害現(xiàn)象。當前13頁，總共57頁。（2）碳源

糖在培養(yǎng)基的作用：

①為細胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架

②為細胞的呼吸代謝提供底物和能量

③維持滲透壓

蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。當前14頁，總共57頁。（3）維生素類維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸吡哆醇（VB6）促進根的生長，煙酸（VB3，又稱維生素PP）促進胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc），Vc等。當前15頁，總共57頁。（4）植物生長物質(zhì)植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對植物生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機物，而植物生長調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。無機元素和有機營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動，只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導細胞分裂、脫分化和再分化。當前16頁，總共57頁。生長素類：1）吲哚類：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）

2）萘酸類：NAA（萘乙酸）

3）苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強的生長素。當前17頁，總共57頁。生長素的生理作用1、促進細胞生長和細胞分裂。

2、誘導受傷組織表面細胞恢復(fù)分裂能力。

3、形成愈傷組織，促進生根。

4、與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導。當前18頁，總共57頁。細胞分裂素是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—芐基氨基嘌呤。功能：1、促進細胞的分裂和分化2、誘導芽的分化3、促進側(cè)芽的萌發(fā)和生長4、抑制衰老當前19頁，總共57頁。控制植物細胞分化：分裂素/生長素的比例是控制芽和根形成的一個重要條件。比例高時——產(chǎn)生芽,比例低時——產(chǎn)生根。當前20頁，總共57頁。赤霉素（GA3）生理作用：

1、誘導莖的細胞伸長，對矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效，對根無效。

2、對形成層的細胞分化有影響，往往同生長素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。

3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。

4、對生長素和細胞分裂素的活性有增效作用。

注：不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌加入。當前21頁，總共57頁。脫落酸（ABA）生理作用：

1、抑制蛋白質(zhì)的合成。

2、抵消和抑制生長素、細胞分裂素、GA的作用。

3、誘導休眠、促進衰老和脫落。當前22頁，總共57頁。以上四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只是補充，對某些植物有利、對某些植物不僅沒有利，還有害，實際工作中要具體分析。

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一般用ppm表示

1ppm=1mg/L當前23頁，總共57頁。（5）有機附加物

①肌醇（環(huán)己六醇）

肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形成磷脂，參與細胞膜的組成。利于胚和芽的形成

②天然有機物

一些天然的有機物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進作用。

③AA類物質(zhì)

絕大多數(shù)AA適量時對培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養(yǎng)中，有時也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。當前24頁，總共57頁。4.2.1.2培養(yǎng)基的種類和配制MS培養(yǎng)基它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設(shè)計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。B5培養(yǎng)基是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。當前25頁，總共57頁。White培養(yǎng)基是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MsSO4的濃度和增加了硼素。其特點是無機機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。KM—8P培養(yǎng)基它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是有機成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。當前26頁，總共57頁。（1）培養(yǎng)基的種類（根據(jù)無機鹽的濃度）：

①高無機鹽含量培養(yǎng)基

鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，比例適當，離子平衡性好，具有較強的緩沖性，養(yǎng)分數(shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。當前27頁，總共57頁。②高硝態(tài)氮培養(yǎng)基

硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的VB1。主要適合與木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。當前28頁，總共57頁。③中等無機鹽含量培養(yǎng)基

大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高，維生素種類比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。當前29頁，總共57頁。④低無機鹽含量培養(yǎng)基

大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機含量相對也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。當前30頁，總共57頁。

根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。當前31頁，總共57頁。

根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機物質(zhì)等。當前32頁，總共57頁。培養(yǎng)基的篩選：

1.無機營養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖记叭说慕?jīng)驗，例如：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)。豆科多用B5培養(yǎng)基。

2、植物生長調(diào)節(jié)劑：必須進行篩選試驗?？傮w原則-當誘導愈傷組織形成時，細胞分裂素和生長素相對平衡；誘導芽分化時，細胞分裂素水平應(yīng)高于生長素，誘導根則要低。

3、有機成分要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮，如進行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復(fù)雜有機成分，而進行細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加。當前33頁，總共57頁。（2）培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基前，為了使用方便和用量準確，常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物類和激素類分別配制成比培養(yǎng)基濃度大若干倍的母液。當配制培養(yǎng)基時，只需按預(yù)先計算好的量吸取母液稀釋即可。母液應(yīng)保存在冰箱中備用，保存時間不可過長，當母液出現(xiàn)沉淀或霉菌團時，則不能使用。

貯備液（母液）的配制：

a、方便

b、準確（有些成分量太小）當前34頁，總共57頁。培養(yǎng)基的配制步驟：1、計量

根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式：吸取量ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）×1000ml/母液濃度（mg/L）。

2、移液

取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。注意（1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。

（2）量取母液時，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。當前35頁，總共57頁。3、稱取瓊脂蔗糖備用

4、融化

用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。

大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。當前36頁，總共57頁。5、混合

將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾次。

6、調(diào)pH

用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(5.4～7.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達到要求為止(在調(diào)制時要比目標pH值偏高0.2～0.5個單位，因為培養(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會下降0.2～0.5個單位左右)。當前37頁，總共57頁。7、分裝

溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝20～30瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號。

9、培養(yǎng)基的滅菌當前38頁，總共57頁。4.2.2影響植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件

培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學環(huán)境條件都會影響組織。當前39頁，總共57頁。4.2.2.1溫度培養(yǎng)都是在23～27℃之間進行，一般采用25±2℃。喜溫性植物：茄科、禾本科、蘭科等。培養(yǎng)溫度一般控制在26-28℃。冷涼性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培養(yǎng)溫度控制在18-22℃或<25℃。當前40頁，總共57頁。4.2.2.2光照的影響培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、以及光周期等方面：光周期：黑暗與光照交替的時間光量：光照強度光質(zhì)：光的波長當前41頁，總共57頁。1、光周期對植物細胞脫分化和再分化的效應(yīng)

例1：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的生長，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多。

例2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條件下才能分化成根。

例3：對日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成根。

結(jié)論：光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類、培養(yǎng)的目的來決定。當前42頁，總共57頁。離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)

最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。

愈傷組織誘導階段，一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類不同做法不同，多數(shù)植物適合全暗或周期性光照。

器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。當前43頁，總共57頁。2、光量的影響

光照強度對培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強度對外植物體、細胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。

離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為1000-4000lx（勒克斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達到4000lx，一般光量在2000-3000lx。光照強度的高低直接影響器官分化的頻率。

高光量可以降低植物體內(nèi)生長素水平，低光量使植物體內(nèi)生長素素水平較高，容易生根。當前44頁，總共57頁。3、光質(zhì)的影響

光質(zhì)對愈傷組織誘導，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，2周后，分化出愈傷組織。但在藍光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細。

離體培養(yǎng)條件下，一般用日光燈進行光照，光譜成分主要是藍紫光，波長為419-467nm。

對芽分化有效光譜成分為藍紫光，根分化則受600-680nm所刺激。當前45頁，總共57頁。4.2.2.3濕度組織培養(yǎng)中濕度的影響有兩個方面：

一是培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。

一是環(huán)境的濕度條件。環(huán)境的相對濕度一般要求70～80%。常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。當前46頁，總共57頁。4.2.2.4pH值不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的，大多在左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多數(shù)植物培養(yǎng)的需要。一般來說pH值高于6.5時，培養(yǎng)基全變硬；低于5時，瓊脂不能很好地凝固。因為高溫滅菌會降低pH值（約個pH值）因此在配制時常提高pH值單位。當前47頁，總共57頁。4.2.2.5滲透壓培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1-2個大氣壓對植物生長有促進作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而5-6個大氣壓植物生長就會完全停止，6個大氣壓植物細胞就不能生存。滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)

培養(yǎng)基各種物質(zhì)中，糖對培養(yǎng)基滲透壓起決定性作用。因此調(diào)節(jié)滲透壓往往從調(diào)節(jié)糖濃度著手。糖除了作為滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還是培養(yǎng)基重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也可以作為調(diào)節(jié)物質(zhì)。當前48頁，總共57頁。4.2.2.6氣體影響氧氣是培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。當前49頁，總共57頁。4.3外植體的選擇及消毒

外植體的選擇

植物材料的消毒當前50頁，總共57頁。外植體的選擇

外植體是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料。它是植物離體培養(yǎng)的基本材料?？傮w原則：

a.根據(jù)培養(yǎng)需求選擇植物部位。

b.多年生植物注意樹齡和季節(jié)。

c.在不影響培養(yǎng)目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體。

當前51頁，總共57頁。4.3.1.1取材部位的選擇外植