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摘經(jīng)過前期驗證，由我室研發(fā)的核糖體區(qū)（rDNA）打靶載體（pHrn）能有效介導外源定點整合至多種細胞系的rDNA區(qū)并有效表達并且一系列臨BFIXCre-loxP重組系統(tǒng)，設計出了打靶小鼠rDNA區(qū)的新一代載體pMrn和具有糾正疾病表型目的的質(zhì)粒hFIX-loxP。同時，聯(lián)合的組編輯技術(shù)TALEN,可以更加高效地將pMrn源Neo的mESCs克隆然后經(jīng)由Cre-loxP重組系統(tǒng)介導Neo與hFIX替換，得到表達hFIX的小鼠胚胎干細胞。下一步計劃將定點整合凝血因子hFIX-loxP的mESCs內(nèi)是否能長期穩(wěn)定表達和體內(nèi)治療的療效進一步推動rDNA區(qū)打靶干細胞在治療臨的應用。目的（1）設計并構(gòu)建定點切割小鼠核糖體區(qū)位點的TALEN質(zhì)粒對，共轉(zhuǎn)pMrn質(zhì)粒獲得mESCs克隆，鑒定出陽性克隆（2）利用Cre-loxP重組系統(tǒng)介導Neo與hFIX發(fā)生同源重組互換，通過PCR篩選出表達hFIX的mESCs陽性克隆。方法（1）按照SiDanSi公司的快速構(gòu)建TALEN試劑盒說明，設計并構(gòu)建以共轉(zhuǎn)pMrn質(zhì)粒和pmaxGFPG418篩選，大部分細胞脫落，挑取邊界清晰的mESCs單克隆，用PCR、SouthernBlot和測（3）hFIX-loxP（4）mESCs陽性N28、T2N10T2N21A-30pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒和凝血因子hFIX-loxP質(zhì)粒挑取其中表達熒光的mESCs克隆培養(yǎng)數(shù)天后抽取gDNA，通過PCR鑒定其中陽性克隆。（1），照組挑取26個克隆，其中PCR陽性克隆只有1個，正確（2）從獲得的mESCs陽性克隆挑選6個樣本進行SouthernBlot鑒定，結(jié)果均有Neo定點T2N21pCAG-Cre:GFPhFIX-loxP396個克隆，經(jīng)過PCR鑒定暫時沒有得到發(fā)生同源重組替換的mESCs陽性克隆。，定點整合，并且TALEN（2）尚未鑒定出可以表達hFIX-loxP的mESCs陽性克隆。：小鼠胚胎干細胞；小鼠核糖體區(qū)；打靶；TALEN技術(shù)Cre-loxPBythepreliminaryverification,OurlaboratoryhasbeensuccessfullyconstrutedtheHumanribosomalgeneregiontargetingvectorsmid（pHrn）,whichcansite-specificallyintegrateexogenousgenestoavarietyofcelllines’rDNAregionandexpressefficiently.Duringtheclinicalandscientificresearchofcellgenetics,ithadfoundthattheribosomalDNA(rDNA)regioncouldbeasafeandeffectivegenetargetingsiteforforeigngenes.Givenonthebasis,ashaemophiliaBisdueto factorhFIXdeficient,WeconstructanewgenerationvectorsmidtargetingMouseribosomalDNA(rDNA),pMrn,whichinvolvingloxPandloxP2272sequencecanberecognizedbyCre binaseforhomologous bination.Withthemostadvancedgeneeditingtechnology,TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornucleases),thesmidcanbe nucleofectedintomouseEmbroyicStemCells(mESCs)moreefficiently, infavorofNeogeneintegratingintomESCs.ThenhFIX-loxPsmidandCresmidwillbenucleofectedintothesemESCspositiveclones.AsCre binasecameintoy,hFIX-loxPgenewouldreceNeogeneandexpressinmESCs.Inthenextstep,thehFIX-loxPgeneintegratedmESCspositivecloneswillbecultivatedintoChimericmicemodelthroughmicroinjectionortetraploidembryocomplementation.Hereby,wewillgetaconclusionthattargetingrDNAregioncouldbeasafeandeffectivemethodforgenetherapy.Besides,wecanobservewhetherintegratedexogenoushFIX genescanexpressinvivooverthelongterm.Futhermore,theeffectofthetreatmentwillgivemoreimpetustorDNAregionresarchaboutgenetherapyinclinical.Objective:（1）TheTALENsmidswereconstructedtocuttheribosomalgeneregion forpromotingthepMrnsmidtargetingefficiency.Identifythepositiveclones.(2)Cre binasemediateshFIX-loxPsmidreceNeogenebyhomologous bination.IdentifyrecedmESCspositiveclones.Method:（1）AccordingtheinstructionofFastTALETALENassemblykitfromSidansaiBiotechnologyCO.,,wedesignedandcostructedTALENsmids.(2)TALENandpMrnsmidswerebothnucleofectedintomESCsasanexperimentalgroup.Meanwhile,pmaxGFPandpMrnsmidswerenucleofectedintomESCsasacontrolgroup.FosteredthemESCsseveraldaysuntilltheyadheredtothewallwell.ThenaddG418untillthemajorityofcellsfellofftodeath.Pickedupafewsingleclonesfromtheremainingcloneswithmorphologicalintegrity.IdentifiedthepositiveclonswithPCR、SouthernBlotandsequencingtechnique.(3)ConstructhFIX-loxPsmid.(4)WiththeA-30program, pCAG-Cre:GFPandhFIX-loxPsmidwerenucleofectedintoN28/T2N10/T2N21. CultivatedthenucleofectedmESCsonthedishlaidMEFcellsasfeederlayerseveraldays.PickuptheexpressingGFPclones.Cultivateuntilltheseclones’ gDNAcanbeextracted.IdentifyhFIX-loxPrecedpositivemESCsbyPCR.Results:(1)TheTALENsmids,L4andR21,weresuccessfullyconstructedandverifiedcorrectbysequencing.(2)Afternucleofecting,pickup48clonesfromTALENexperimentalgroup,20ofthemwereidentifiedpositivebyPCRandsequencing.Moreover，thecontrolgroupwithoutTALEN,only1of26wasidentifiedcorrectbyPCRandsequencing.(3)Itwasconfirmedthatthesepositivecloneswereallsite-specificallyintegratedwithNeogenebySouthernBlot.(4)theGbandkaryotypeofthemdetectednormalandcorrect,showingthatrDNAregiontargeteddidnotcausechromosomekaryotyperearrangement.(5)AfternucleofectingCreandhFIX-loxPsmidsintoN28/T2N10/T2N21severaltimes,wefoundthatrecementdidnotoccurein396clones.Conclusion:(1)Thepositiveclones(N28,T2N10,T2N21etc) areallintegratedwithNeogenesite-specifically.Indeed,TALENtechiquecanimprovethepMrnsmidtargetingefficiency.(2)WedidnotidentythepositivecloneswhichcanexpresshFIX.:Mouseembryonicstemcells;Themouseribosomalgeneregion;Genetargeting;TALENtechnique;Cre-loxP binationsystem性.......................................................................................................摘 英文縮略詞 前 核糖體區(qū)打靶載 (1)編輯技術(shù) Cre-loxP重組系 材 小鼠細胞系、菌株以及載體質(zhì) 實驗儀 主要實驗試劑及耗 限制性核酸內(nèi)切酶及DNA聚合 試劑 引 主要試劑的配 方 實驗路 設計并構(gòu)建TALEN質(zhì)粒 pMrn質(zhì)粒抽提及酶切鑒 mESCs的培 pMrn打靶小鼠胚胎干細 G418篩選獲得抗性克 rDNA區(qū)定點整合mESCs陽性克隆鑒 mESCs定點整合克隆核型檢 pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒的抽提及功能鑒 hFIX-loxP質(zhì)粒構(gòu)建及線性 共轉(zhuǎn)pCAG-Cre:GFP和hFIX- 挑取單克隆并抽提 PCR鑒定hFIX-loxP定點整 結(jié) 構(gòu)建TALEN質(zhì) pMrn質(zhì)粒酶切鑒定及線性 核轉(zhuǎn)并篩選mESCs抗性克 mESCs定點整合PCR鑒 Southernblot鑒定結(jié) mESCs打靶后核型分 Cre質(zhì)粒的抽提及鑒 共轉(zhuǎn)pCAG-Cre:GFP和hFIX-loxP后mESCs培 PCR鑒定hFIX-loxP定點整 結(jié) 討 參考文 綜 參考文 致 mouseembryonicstemcells mouseembryonicfibroblasts FactorVIII 凝血因子VIII ribosomal Fetalbovine 胎牛 dimethyl

deoxyribonucleicacidRiboNucleicAcid

deoxynucleosidetriphosphate ethylenediaminetetraaceticacid 慶大霉素418 greenfluorescence neomycinphosphotransferase 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 internalribosomeentrysite basepair longhomologous shorthomologous phosphatebuffered polymerasechain dulbecco'sminimumessential （氏 bovineserum 牛白蛋 non-essentialamino L- L- L-dd 治療是一場醫(yī)學，在21世紀將真正臨床，為人類造福。治療從開始就作為治療、心血管疾病、單遺傳疾病、性疾病等重要疾病的新方法。自從1990年9月第一例SCID-ADA的接受治療臨床試驗開始后，科學界就掀起了治療的研究熱潮0。根據(jù)TheJournalofGeneMedicine1989201437個國家，已經(jīng)有2142例治療實驗進入了臨床階段，超過了47種的治療載體開發(fā)更是1。核糖體區(qū)打靶載治療（genetherapy）是將外源性遺傳物質(zhì)導入到靶細胞中，從而出相應的表型變化，來治療疾病的法。介導遺傳物質(zhì)靶入的載體研究一直是治療需要突破的重要環(huán)節(jié)。由我組構(gòu)建的人源性核糖體（rDNA）區(qū)打靶載體是一種新型的非（pHrn入突變，可以有效表達外源并且穩(wěn)定遺傳下去。目前，利用pHrn攜帶治療，如凝血因子FVIII、FIX等，打靶了多種細胞系，如人纖維肉瘤細胞HT1080HL7702，都獲得了大量定點整合的重組克隆細胞。其中，HT1080的絕對打靶效率達到了10-4，比迄今所的效率要高出30倍，且所有的外源均能長期并穩(wěn)定的表達。近期，本組還成功利用該載體把FVIII和FIX導入到人胚胎干細胞中，并獲得定點整合胚胎干細胞株，且凝血因子在體外能夠正常表達，這一結(jié)果為該載體在遺傳性疾病的治療應用2，3，4。為推進rDNA區(qū)打靶結(jié)合干細胞在治療臨床前的應用，對該策略實施后體內(nèi)安全性驗證就顯得尤為重要。而自1979年Mintz等人將SV40DNA導入小鼠早期胚胎的囊胚腔，得到了第一個承載有人工導入的外源的嵌合5，6。因此，為驗證人核糖體區(qū)打靶今后應用于內(nèi)的安全性，同時鑒于人和小鼠核糖體轉(zhuǎn)錄區(qū)高度的保守性（經(jīng)生物信息學分析兩者序列同源性>99%，小鼠rDNA拷貝數(shù)約50-100個，我們團隊擬聯(lián)合的編輯技術(shù)TALEN，打靶小鼠胚胎干細胞（mESCs）rDNA區(qū)，再將打靶成功后的小鼠胚胎干細胞(mESCs)發(fā)育為嵌合體小鼠，進而觀察rDNA區(qū)打靶是否對mESCs的rDNA區(qū)，設計并構(gòu)建打靶載體pMrn和定點切割小鼠rDNA區(qū)的TALEN質(zhì)粒對。然后，打靶mESCs以獲得rDNA區(qū)定點整合外源的mESCs。其載圖1.小鼠核糖體區(qū)打靶載體pMrn質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意(1)編輯技術(shù)TALEN技術(shù)（Transcriptionactivator–likeeffectorsnucleases）是一種嶄新的Xanthomonassp.的TAL蛋白內(nèi)的核酸7。所以將編碼TALE蛋白質(zhì)的序列模塊以不同的方式組裝，就能特異性地結(jié)合到相對應DNA序列上去，從而達到靶向操作內(nèi)源性的目的。TALEN技術(shù)已經(jīng)成為功能強大的工具。2TALEN34個TALEN12、13位點雙連氨基A、G、C、TNGT，HD識別C，NIA，NNG8,9TALEDNATAL單元串聯(lián)克隆即可10,11,12,13。由于物種組大小的不同，選擇的特異序列長度也不同，對于哺乳16-20bpDNA序列作為識別靶點。黃色的區(qū)域為核定位信號，綠色的區(qū)域是一個轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，棕色的區(qū)域是FokI酶編碼區(qū)。FokI酶是一種存在于細菌海床黃桿菌（Flavobacteriumokeanokoites）的typeIIS限制酶，含有位于NDNA結(jié)合域（N-terminalDNA-bindingCDNA14。當FokI酶結(jié)合域識別并結(jié)合于識別位點時（recognitionsite，切割區(qū)域?qū)盐挥诮Y(jié)合位置下游913個核苷酸切除（不需特定序列）15,16。FokI的特點是需要二聚化后才會擁有切割的能力，所以FokI的非特異性切割區(qū)域可以被應用于同識別特定DNADNA17,18。所以TALENDNA序列的TALE和FokI酶相結(jié)19,20。根據(jù)上述TALEN技術(shù)的原理，如果在目的兩邊設計出一對TALEN質(zhì)TALEN融合蛋白中的FokI酶靠近形成二聚體，就能發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活DNA（Spacer）21DNABreaks（Non-HomologousEndJoining）或HR（Homologous DNA，在此修過程中刪除或插入了一定數(shù)目的堿基，可實現(xiàn)靶敲或者外源的導入22,23。所以本實驗組為了提高小鼠核糖體區(qū) SiDanSi公司快速構(gòu)建TALEN試劑盒,設計并構(gòu)建了定點切割的TALEN一對質(zhì)粒TALEN-L4和TALEN-R21，共轉(zhuǎn)pMrn質(zhì)粒以期望能提高獲得小鼠胚胎干細3TALENCre-loxP重組系Cre-loxPP1P1侵染宿主后，這個系統(tǒng)可以促使噬菌體P1組的環(huán)化，并在宿主不斷的過程中始終24,25,26。這個系統(tǒng)由Cre重組酶和特異性識別位點loxP構(gòu)成，在Cre重組酶識別loxP位點后，可以有效地造成特定片段的切除、倒位或者定點整合，并且不需其它蛋白質(zhì)、DNA24。37度附近，不向FLP/FRT30DNA修飾工27。Cre34338kDaCausebination的縮寫，其編碼全長1029bp。像限制性內(nèi)切酶一樣，Cre重組酶具有酶切活性，能特異性識別loxP位點進行剪切和拼接。之所以Cre重組酶可以介導loxP位點之間的序列刪除或者重組，這與loxP位點的特殊性有關(guān)。loxP的名稱來自于LocusofcrossingoverinP1的縮寫，它是一段長度為34bp的DNA序列，由兩個13bp8bp的不對稱間隔區(qū)組成。一般Cre重組酶會結(jié)合在反向重復序列區(qū)域，然后特異性的切割不對loxP位點具有了方向性，DNA28。Cre-loxP2個loxP位點方向相同時，在Cre重組酶的介導下處于DNA2個loxP位點的方向相反時，在CreloxPDNA2個loxPDNA鏈上，比如一個質(zhì)粒上帶有一個loxP位點，某段上還有一個loxP位點，那么在Cre重組酶的介導下，質(zhì)粒上loxPDNA片段便可以整合到中l(wèi)oxP29。同時Cre不僅可以識別野生型的loxP8bp的不對稱間隔區(qū)發(fā)loxP511-I，511，F(xiàn)AS，2272，5171等等。文獻當同種突變型loxP序列配對使用后，Cre重組酶介導的同源重組像野生型loxP2272和FAS-loxP序列配合野生型loxP序列共用的時候卻表現(xiàn)的非常不兼容，幾乎不發(fā)30,31。推測，其突變位點改變后不能像原來那樣堿基互補配對，影所以當方向相同的野生型loxP序列和突變型2272-loxP引入到外源兩端，通過同源重組整合到小鼠rDNA區(qū)中，然后用另一個外源載體，兩端同樣攜帶方向相同的野生型loxP2272-loxP序列，聯(lián)合Cre重組酶共轉(zhuǎn)，則可以介導兩個不同loxP序列之間的替換32,33,34。基于以上思路，我們構(gòu)建了pMrn載體，并且在外源Neo兩端分別引入野生型loxP和2272-loxP位點，然后先用pMrn打靶載體打靶小鼠胚胎干細胞，利用啟動子陷阱，富集同源重組子。然后，再利用Cre-loxP系統(tǒng)，把hFIX-loxP質(zhì)粒和Cre重組酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到篩選過的重組子中，介導外源FIX替換Neo基因，最終獲得表達凝血因子FIX的mESCs。圖4.cre-loxP系統(tǒng)介導的外源之間的替材小鼠細胞系、菌株以及載體質(zhì)mESCs系

D18大腸桿 TOP10大腸桿 JM109大腸桿 PGEM- 本室構(gòu)建的小鼠核糖體區(qū)打靶載 本室構(gòu)建的TALEN質(zhì)粒hFIX- 9 攜帶FIX表達框的小鼠核糖體區(qū)靶向 NeoFIXrDNA靶向 實驗儀CO2孵育 ThermoNanoDrop1000分光光度 Thermo冰 海超凈工作 蘇州凈化工程公電泳 隔水式電熱恒溫培養(yǎng) 躍進醫(yī)療器械細胞計數(shù) 生物儀器制冰 Forma420型空氣搖 ThermoPCR Applied超純水 倒置顯微 高速離心 水浴 主要實驗試劑及耗0.05%胰 0.1% 0.22um500ml過濾 1.5mlEP 100mm培養(yǎng) 10ml無菌吸 10ml移液 15ml離心 24孔 50ml離心 6孔 Dispanse分散 DL2000DNA LA Knockout/ L- Mitomycin PCR T25培養(yǎng) T75培養(yǎng) 巴斯德 蛋白酶 高糖 酵母提取 檸檬酸 胰蛋白 限制性核酸內(nèi)切酶及DNA聚合NotI限制性內(nèi)切酶PvuII限制性內(nèi)切酶EcoRI限制性內(nèi)切酶AvrII限制性內(nèi)切酶

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Phusion高保真DAN聚合 試劑QIAqickGelExtractionKitQIAGENEndo smidMaxikit

Amaxa?MouseESCellNucleofector? TheE.Z.N.A.?GelExtractionKitsmidminiKit

FastTALETALENassemblykitfromSidansai DIGhighprimednalabelingkit 1.6引由序列F1-F2-F-F9-F9-hFIX-loxP- 1.7主要試劑的配 1）固體LB培養(yǎng)基 酵母提取 瓊脂 2）液體LB胰蛋白 酵母提取 3）1x2MTris.Cl(pH 2MEDTA(pH 4M 10mg/mRNA 4）10xTBETris 硼 小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)基Knock-out200mML-0.22um500ml過濾器過濾除菌，4237小鼠胚胎成纖維細胞MEF培養(yǎng)基 胎牛 200mML-谷氨酰 0.22um500ml過濾器過濾除菌，42371mg/ml分散酶/膠原酶分散 膠原酶 0.22um378）C（Mitocycin2mg溶解于4mL的PBS中，配制成0.5mg/mL的母液，長期則應4℃MEF10ug/ml，0.22um濾膜過濾除菌，4（<2周）,37方Cre-loxP重系表達的rDNArDNA區(qū)定點整合mESCs陽性克隆鑒挑取單克隆并抽提共轉(zhuǎn)pCAG-Cre:GFP和hFIX-hFIX-loxP質(zhì)粒構(gòu)建及線性G418篩選并挑取mESCs抗性單克mESCs的培養(yǎng)及核轉(zhuǎn)pMrn質(zhì)粒抽提及酶設計并構(gòu)建TALEN質(zhì)粒PCR鑒定定點整圖5.小鼠核糖體區(qū)打靶實驗技術(shù)路線設計并構(gòu)建TALEN質(zhì)粒將小鼠核糖體區(qū)位點附近的序列導入到專門設計TALEN質(zhì)粒的行計算最優(yōu)的TALEN切割序列，挑選的Spacer需要涵蓋位點上（EcoRI酶切位點的GAATTC，是打靶載體pMrn長短同源臂的連接位點。另法是在網(wǎng)頁計算得到在UCSCspacer切割序列：TTGCAATTATTCCCCATgaacgaggaattccCAGTAAGTGCGGGTCATAA6。示，將TALEN分為9個模塊，左側(cè)TALEN鏈：TG1CA2AT3T4A5T6TC7CC8右側(cè)TALEN鏈TA1TG2AC3CC4GC5AC6TT7AC8圖6.定點切割小鼠核糖體區(qū)的TALEN質(zhì)粒從試劑盒中取出相應編號的9個模塊，每個模塊取1.5ul，并將其加入同一個PCR管中（注：取模塊的過程請務必在無菌操作臺中進行，打開蓋前請短暫離心混勻）將溶液1、溶液2從-20℃冰箱里取出置于冰盒上，溶液3放置于37℃水浴鍋中溶解（注意：請完全混勻。按如系加樣，先加入相應的TALEN骨架載體，然后將溶液3、溶液1、溶液2依次加入步驟3的PCR管中，最后加水20ul，短暫離心混勻。左臂TALEN右臂TALEN9個模塊總體積：9個模塊總體積：左臂TALEN右臂TALEN1.53:3:1：1：2：2：ddH2O:ddH2O:總體積： 總體積：將混勻后的PCR管放入PCR儀中進行連接反應。連接程序如下：37℃5min16℃10min80℃10min12℃1min（請注意關(guān)掉PCR取出PCR41ul50.5ul（537℃預先融化PCR37℃孵育一小時。預先融化）的EP管中，混勻，在冰上放置30min，然后放入42℃水浴鍋中熱激45s，再迅速放置于冰上3min。在超凈工作臺中向步驟4的EP管中加入500ulSOC溶液37℃，250rpm的搖床中培養(yǎng)30min。將步驟5的EP管取出，在4000rpm的離心機中離心5min在超凈工作臺中棄去EP管中的大部分上清，留下約100ul，并將沉打混勻，均勻涂布于卡納霉素抗性（Ka+）的平板中，置于37℃培12-16次日挑取24個單克隆將單克隆接種于裝有5mlLB培養(yǎng)（含Ka+）15ml離心管中。 10Buffer 2 BamH 1Pst 1.5總體積：司，與設計的標準序列進行比對。將返回的結(jié)果輸入以下與設計的標準序列進行比對，見8pMrn質(zhì)粒抽提及酶切鑒pMrn質(zhì)粒轉(zhuǎn)1)DH5α感受態(tài)細胞（全程必須在冰上處理DH5α菌液融化后劃線，3712h②15ml3ml液體LB280rpm,378h小時左右，可見淡云霧狀細菌懸液（OD0.43ml50ml液體LB中，280rpm,2h3000rpm，410min10ml（0.1MCacl2+10％甘油重懸，冰置12h3000rpm，410min5mlCacl2+10每管分裝，標記后-852)pMrn質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中擴100ul感受態(tài)DH5α②將100ngpMrnDH5α③42902④加入500ulLB液體培養(yǎng)基，37℃搖，180rpm，培養(yǎng)45分鐘⑤室溫，5000rpm離心5分鐘,殘100ul養(yǎng)基，輕柔打勻重懸沉淀細菌，轉(zhuǎn)移至鋪于氨芐青霉素抗性的固體LB培養(yǎng)皿，用涂布棒均勻平⑥37℃12-16hpMrn質(zhì)粒DNA的小量抽提 smidminiKit-15ml3-5mlLB50~100ug/ml②將15ml離心管固定于搖，280rpm，37℃震蕩培養(yǎng)約12個小③13000rpm，4℃1min，250ul250ulSolution350ulSolution5-6⑥13000rpm，10min2ml13000rpm，1min。700ulPEbuffer,13000rpm，離1min。500ulWashingbuffer,13000rpm，1min。⑩棄收集管中廢液，13000rpm，2min?20ulddH2O后，13000rpm，1min?NanoDrop1000質(zhì)粒酶切鑒pMrn9164bp,EcoRI74041760bpDNA EcoR 37℃溫箱，3pMrn質(zhì)粒DNA大量抽提質(zhì)粒（Endo smidMaxiKit(QIAGEN,CatNo.12362)）100-200ulpMrn300mlLB鈉（50~100ug/ml37℃,280rpm12-164℃，6000g，離心10mlBufferP150ml10mlBufferP2，4-65minQIAfilter10mlBufferP3，4-610min，試管中。2.5mlBUFFERER1030min10mlBUFFERrQBTQIAGEN-TIP8QIAGEN-tip⑩2×30mlBufferQCQIAGEN-tip，使依靠重力流過濾柱?15mlbufferQNDNA，50ml?加入10.5ml室溫異丙醇到洗提的DNA中并混合，4℃，8000g，離心60min 離心，的去上清，盡量避免DNA沉淀破碎。?5ml70％40ml96-100％乙醇)DNA沉淀，8000g，30min離心，去上清，避免擾動沉?5-10min，DNA?NanoDrop1000mESCs的培MEF細胞13.5CF-1②用70%的乙醇噴灑小鼠全身，在無菌條件下用眼科剪呈V字形鉗間連接處，向上提拉，并剪斷頸，取出整個。血跡后轉(zhuǎn)移到新的10cmdish無菌眼科剪沿系膜側(cè)剪開用鑷子撕10cmdish。進一步用鑷子和剪刀，去除胚胎頭部和內(nèi)臟團,分離出軀干后，再用含有雙抗（100U/ml）的DPBS。50ml1mm31ml⑤加入5ml0.25%10ml吸管吹打均勻37℃消化5min。用10ml30s5ml37℃培養(yǎng)20min。組織，500g10min，室溫，棄去上清。MEF完全培養(yǎng)基，重懸細胞,5個胚胎一組接種到T225培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶補加MEF35ml為止，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。⑧待MEF80%-90%時，1:3MEF細胞的傳①當細胞融合度達80%-90%時，棄去培養(yǎng)基，用DPBS2遍②每個T2253ml0.25%胰酶消化液，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化2-3min，鏡下觀察可見細胞變圓時，輕輕拍打瓶壁，進一步使細胞脫落，10mlMEF完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復輕柔吹打成單細胞③將單細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，200g5minMEF1:2-3的比例傳代補加完全培養(yǎng)基到35ml，標記好代次名稱置于37℃，5%CO2，絲裂霉素C鈍化處理MEF細①當?shù)?代的MEF匯合度達90%左右，棄培養(yǎng)基，加入含10μg/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5h（絲裂霉素C的配制方法：2mg溶4mL的PBS0.5mg/mL的母液，4℃避光保存，使用前，用MEF培養(yǎng)基配制成10μg/ml，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存，用前37℃水棄培養(yǎng)液DPBS洗細胞3-5次,加入3ml0.25%胰酶消化2-3min，10mlMEF完全培養(yǎng)基終止消化，并用吸管反50ml離心管，細胞計數(shù)，200g5min30mlMEF完全培養(yǎng)基重懸細胞，200g離心5min，細胞。MEFmESCs的培養(yǎng)凍存液以1.5×106cells/ml或3×106cells/ml的濃度放入液氮中凍小鼠胚胎干細胞（mESCs）的復蘇和培1.5×106MEF細胞至10cmdish培養(yǎng)皿中。mESCs37℃循環(huán)水浴箱解凍復蘇，5mlmESCs15ml離心管，輕輕吹到幾下，避免氣泡產(chǎn)生，1000rpm5min。2mlmESCs培養(yǎng)基吹打重懸，避免氣泡產(chǎn)生，然后10cmdish10ml，每天換液。mESCs的傳代和凍3天左右就可②棄置培養(yǎng)皿培養(yǎng)基用10ml的DPBS3次,加入1ml的0.1%分（Dispanse5mlmESCs培養(yǎng)基終止消化，用大槍輕輕的把克隆吹洗下mESCs15ml的離心管中，1000rpm離心④的棄去上清液再加2mlmESCs培養(yǎng)基重懸細胞,補加培養(yǎng)基到10ml（若是需要凍存則以90%的mESCs培養(yǎng)基和10%的二甲基亞砜DMSOMEF10cmdish培養(yǎng)皿中,3-4天可再次傳代。pMrn打靶小鼠胚胎干細pMrn質(zhì)粒酶切線性化及純

Not 37℃溫箱，4EP320℃10②13000rpm，4℃1070%500ml,13000rpm5④棄去上清，13000rpm1TipEP10ulddH2O⑦NanoDrop1000pMrn核轉(zhuǎn)小鼠胚胎干細①核轉(zhuǎn)前先將小鼠胚胎干細胞mESCs傳代到matri膠包被的10cmdish培養(yǎng)皿中，以去除MEF細胞。培養(yǎng)3天之后，若細胞狀態(tài)良好則可以進行核4-12②棄去培養(yǎng)基，用DPBS3遍③加入1ml胰酶37度溫箱2-3分鐘用手輕輕拍打培養(yǎng)皿側(cè)壁，④加入5mlmESCs培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打，然后轉(zhuǎn)移到15ml5x1061000rpm，5min⑥棄去上清，加入5mlDPBS，1000rpm，離心5min液重（按說明書劑量配置82ulsolution試劑和18ulsupplement試劑使用前預溫到室溫然后加入6ugTALEN-L4TALEN-R21，6ug線性化的pMrn，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移到核轉(zhuǎn)杯中，避免有任何氣泡。另一對照組不TALEN6ugpMrn10ulpmaxGFPmESCs。Amaxa?NucleofectorA-013⑨核轉(zhuǎn)后加入500ul培養(yǎng)基混勻室溫靜置5min,然后用試劑盒中塑料pMEF37°溫箱培養(yǎng)。G418篩選獲得抗性克mESCs24等到細胞克隆形態(tài)完整（避免克隆之間相互接觸，大概2-3天左右，加入G418篩選，第一天的終濃度為100ug/ml，其后根據(jù)每天的細胞狀態(tài)酌量增加或減少G418的劑量，直至出現(xiàn)抗性克隆，一般篩選時間為一周左右。為避免加藥過重，導致抗性克隆，終濃度不要超過300ug/ml。②挑取克隆前，先用DPBS2遍有克隆的培養(yǎng)皿，并和24孔板一并換上新的培基。同時，取出巴斯德管噴灑70%，過火后將其前端平放于燈外焰上方灼燒，變軟后用消過毒的止血鉗快速拉開。去除多余的拉2cm90③用事先斯德管挑取單個mESCs克隆,接種到24孔板的一個孔④⑤將挑取至241:1gDNArDNA區(qū)定點整合mESCs陽性克隆鑒mESCs單克隆細胞gDNA抽①棄去培養(yǎng)基，用DPBS3遍，加入適量胰酶消化2-3分鐘EP13000rpm，5min③棄培養(yǎng)基，1mlDPBS，13000rpm，5min500ul1×細胞裂解液（RNase20μg/ml，加入蛋白酶K至終濃度200μg/ml，加入35μl20%SDS，震蕩重懸細胞，然后37℃搖100rpm消化，過夜。EP100液，13,000rpm，25℃，10min。1.5mlEP=1:1⑦將上層水相移至另一新的1.5mlEP管，加2倍體積-20℃預冷的無水乙醇，顛倒混勻。13,000rpm，4℃，離心10min，可見白色半透明狀DNA⑧棄上清，加入500ul70%乙醇gDNA沉淀。4℃，5min⑩NanoDrop1000PCR鑒定mESCs陽性gDNAPCR模板，用兩對引物進行PCR擴增若為定點整合陽則擴增后PCR產(chǎn)物片段為661bp和1553bp,見圖7pMrnpMrnLHA（musrDNA:2527-5467SHA（musrDNA:5648-6875。兩個同源臂之間插入了一個表達框，包含了腦心肌炎（EI）的IRES序列、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NEO）編碼區(qū)和SV40多聚腺苷酸信號（SpA，其中NEO缺乏啟動rDNA區(qū)后借助其原位啟動子進行轉(zhuǎn)錄。rDNAHS表示同源重組到18SrRNA所需要的4.3kb同源重組引導序（musrDNA:2527-6875通過AvrⅡ酶切位點可以在打靶后的neo與gDNA組之間酶切出大小為6.10kb的片段，NEOSouthernBlotF1-pMrn,F2-pMrnNEO上，R2-pMrn位于短同源臂（SHA）上，R1-pMrn位于短同源臂（SHA）gDNA組上。F1-pMrn,R1-pMrn1553bp的目的片段，F(xiàn)2-pMrn,R2-pMrn661bp的PCRF1-pMrn,R1-pMrn)反應體系為2×GCBuffer LA-TaqDNApolymerase: PCRF2-pMrn,R2-pMrn)循環(huán)條件為95℃，595℃,303056℃,30 72℃,272℃,10 10℃5μlPCR0.8%PCRF2-pMrn,R2-pMrn)反應體系為2×GCBuffer LA-TaqDNApolymerase: PCRF2-pMrn,R2-pMrn)循環(huán)條件為95℃，5

95℃,30s30cycles72℃,1mins72℃,10 10℃5μlPCR0.8%PCR陽性克PCR對瓊脂糖膠中的目的片段采用OMEGA公司的TheE.Z.N.A.?ExtractionDNA膠部分，裝入EP管中，在電子天平上稱重。Bindingbuffer，55°65°72分鐘顛倒混勻直至EP③將回收柱置于2ml收集管中，把融化了的膠轉(zhuǎn)移到回收柱中，13000rpm1min④棄去收集管中廢液，加入300ul的Bindingbuffer，13000rpm1min。⑤棄去收集管中廢液，加入700ul的SPW兩次，13000rpm室溫離1min。13000rpm2minEP10ulddH2O，2min,13000rpm1min。PCRT2×ligase PCR回收產(chǎn)物 T T4 16℃將抽提后質(zhì)粒送公司進序SouthernblotpMrn定點整合（DIGHIGHPRIMEDNALABELINGKIT，Roche）試劑配制(DIG試劑盒提供①TS變性液(現(xiàn)配現(xiàn)用) ② 檸檬酸鈉

濃鹽酸調(diào)pH7.0③中和液(現(xiàn)配現(xiàn)用

調(diào)1×Washingbuffer現(xiàn)配現(xiàn)用)

⑤2×SSC/0.1%SDS現(xiàn)配現(xiàn)用) 0.1×SSC/0.1%SDS(現(xiàn)配現(xiàn)用) ⑦2×SSC/0.1%SDS現(xiàn)配現(xiàn)用) 1×Blockingbuffer現(xiàn)配現(xiàn)用)

50ml30ml1×Detectionbuffer現(xiàn)配現(xiàn)用)

DIGNeo-probePCRNeo-probe探針F-probe/R-probepMrn質(zhì)粒為模板。擴增片段約為402bp，下面PCR體系中的聚合酶①、dNTP②和10×Buffer③都來自DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI。PCR10×Buffer③F-probeR-probeDNAPCR95℃，294℃,3035 72℃,30 72℃,710℃PCR條件直至目的條帶特異。比較與marker條帶亮度大小估測PCR產(chǎn)物大致濃度。抽提大量陽性克隆細胞6cmdish2.7.1的方法抽提小鼠胚胎干細胞gDNA。NanoDrop1000分光光度計測度質(zhì)粒濃度并標記。AvrⅡ酶切陽性克隆細胞10×K 組 總體積 3712①待酶切完全按2.5.1的方法純化gDNA回收酶切產(chǎn)物或者做一②加適量6×loadingbuffer混勻點樣到1%的瓊脂糖凝膠中電（30V）16小時或者（150V）2小時；③電泳完畢后將瓊脂糖凝膠置于一個合適大小的容器內(nèi)在清水中3次，移動膠時輕放④將瓊脂糖凝膠置TS變性液中浸泡15min，并放在搖不斷溫和地搖動。換上新的TS變性液重復這一步驟。⑤取出瓊脂糖凝膠在清水中3次，然后放入中和液中浸泡15min，并放在搖不斷溫和地搖動。棄中和液，換上新的中和液。寬均比瓊脂糖凝膠略小，可以減去一個角作為正的標記，然后置于20×SSC中浸潤。夾取尼龍膜時只能用用干凈的鑷子四個邊角。（20×SSC作為轉(zhuǎn)膜液③2④瓊脂糖凝膠（正面朝下1層浸濕的濾紙，略小與10cm⑧200g10ml/100cm2DIGEasyHyb雜交DIGEasyHyb15ml42②取出尼龍膜，浸泡于2×SSC中15min，并放在搖不斷溫和地搖2802120℃烤箱烤膜0.5小時，固定DNA。同時將轉(zhuǎn)膜后的膠放在EB中染色，確認DNA⑥42℃水浴搖預雜交30min7ul1PCR管內(nèi)，事先向管內(nèi)加入43ulddH2O。PCR儀上995min，然后立即置冰水中冷5min。7ml42℃預溫的DIGEasy液，機封邊，去除氣泡。恒溫水浴搖42℃、80rpm雜交16小時。Southernblot①取出尼龍膜用2×SSC/0.1%SDS室溫漂洗3×5min，并放在搖不2×15min。1×Washingbuffer1×5min1:15000Anti-Digoxigenin-AP（2ul抗體）30ml封閉液中,30min1×Washingbuffer2×15min30ml1×Detectionbuffer5min15-20CDP-Star,ready-to-use到尼5min后拭去多余的顯影液。X1-10min后取mESCs定點整合克隆核型檢①mESCs6cmdish5ml②提前4-6,加入10-20ul秋水仙素(20ug/ml)至5ml培養(yǎng)基中③棄去培養(yǎng)基，DPBS細胞3遍0.5ml2-3min2mlMEF15ml1000rpm5min⑥再用DPBS細胞一遍1000rpm離心5min37℃15min。1500rpm10min，棄上清留少許殘液。?1-2,75℃3hG100ml1ml2.5%的胰酶，混勻后倒入立式染缸，滴加1-2NaOH溶液pH：7.2。同時取另一個立式染缸裝有Giemsa染液一同放置于37℃水浴箱中取烤好的玻片在胰酶溶液染缸溶液中，輕輕搖動30-90s，立即在Giemsa染缸中染色1-3min，最后用?鏡下觀察G顯帶的效果：如果邊緣發(fā)毛，那就是顯帶消化過?pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒的抽提及功能鑒pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒自Addgene利用酶切鑒定如果質(zhì)粒正確用HindⅢ和EcoRⅠ酶會切出2329bp和4234bp條帶然后按照2.3.4大量抽提質(zhì)粒凍存?zhèn)溆煤宿D(zhuǎn)。用jetPRIME?試劑盒將pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒核轉(zhuǎn)到293T細胞中，觀察得出pCAG-Cre:GFP是否可以正常發(fā)揮作用。Hind 0. 10×FD 371jetPRIME?轉(zhuǎn)染用jetPRIME?pCAG-Cre:GFP293T293T6cmdish1：390%（1525）②稀釋2ug(0.7ul,3281ng/ul)pCAG-Cre:GFP到jetPRIME 4ugjetPRIMEregant，吹打均勻，室溫靜置200ul37⑤4，24hFIX-loxP質(zhì)粒構(gòu)建及線以本實驗組先前構(gòu)建好的pHrn-FIXhFIX-loxP-F和hFIX-loxP-R在FIX片段兩邊引入野生型loxP位點和突變型loxP位點，將PCR產(chǎn)物連到T載體（Promega）上，轉(zhuǎn)化后鑒定陽性克隆。小劑量抽提質(zhì)粒命名為入hFIX-loxP質(zhì)粒，用PvuⅡ酶切線性化后，按照2.5.1（b）的實驗步驟純PCRhFIX-loxP-F,hFIX-loxP-R)2×GCBuffer LA-TaqDNApolymerase: hFIX-loxP- pHrn- PCRhFIX-loxP-F,hFIX-loxP-R)循環(huán)條件為95℃，595℃,303060℃,30 72℃,872℃,10 10℃5μlPCR0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。2.7.3實驗步驟進行，并且送公司測通質(zhì)粒。hFIX-loxP質(zhì)?？梢员籔vuⅡ(CAG-CTG)酶切成4098bp的目的片段和酶切體系 10×buffer hFIX- Pvu 37℃溫箱，4小時，反應結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳進利用Cre-loxP置換系統(tǒng)將FIX替換掉靶入的Neo，靶細胞為N28，T2N10，T2N21等mESCs陽性克隆。按照2.5.2的實驗步驟指導，通過pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒共同打靶T2N10細胞株，采用A-30核轉(zhuǎn)程序，靶入質(zhì)粒的量為1ug pCAG-Cre:GFP和1ughFIX-loxP（PvuⅡ線性化，靶細胞為1.5×106N28/T2N10/T2N2110cmdish挑取單克隆并抽提mESCs培養(yǎng)到合適的形態(tài)后，在熒光倒置顯微鏡下挑取包含有綠色熒光的mESCs，接種到事先鋪好matrix膠的96孔板中。培養(yǎng)幾天后用機械法1:1matrix96孔板中，一份保種，一2.7.1的實驗步驟抽取gDNA，留待PCR鑒定。PCR鑒定hFIX-loxP定點整利用引物F9-mF1和F9-mR1對挑取克隆的gDNA進行touchdown-PCR，如1681bp的條帶，則說明是陽性克隆。PCR2×GCBuffer LA-TaqDNApolymerase: F9- F9- PCR循環(huán)條件為97℃，597℃,301066℃,30s 72℃,2min97℃,302560℃,30 72℃,2 72℃,1010℃結(jié)根據(jù)SiDanSi公司快速構(gòu)建TALEN試劑盒,設計并構(gòu)建了定點切割小鼠核糖體區(qū)位點的TALEN質(zhì)粒對。小劑量抽提TALEN質(zhì)粒，通過酶切鑒4526bp2061bp8a9個質(zhì)粒酶切鑒定陽3261bp2367bp8b。結(jié)果共有4個質(zhì)粒酶切鑒定為陽性：R3，R8，R21，R26。酶切正確的質(zhì)粒L4,L5,L13,L21,L22;R3,R8,R21,R268cL4和TALEN-R212.3.4的方法大劑量抽提TALEN-L4和TALEN-R21圖 +-陽性條帶，M表示λDNA/HindⅢmarker。圖c表示TALEN質(zhì)粒結(jié)果與預期序列氨基pMrn質(zhì)粒酶切鑒定及線性將本室構(gòu)建的prn2.3.4的方法大劑量抽提后，用EoRI酶切鑒1760bp7404bp源時將靶入的質(zhì)粒線性化可以提高同源重組t（-prn-vtor2956bp6208bp5ul溶液通過瓊脂糖膠電泳檢測酶切完全后按照2.5.（的實驗步驟純化10。10pMrn1pMrnEcoRI2pMrnNotIMarker使用的都是λDNAHindmarker核轉(zhuǎn)并篩選mESCs抗性克將線性化的pMrn質(zhì)粒核轉(zhuǎn)到mESCs34天開始，往培養(yǎng)基中加入G418進行篩選，初始終濃度為100ug/ml，維持該濃度培掉落較多，進行適量的補充。加量后對細胞影響依舊不大，G418終濃度改為200ug/ml,維持該濃度培養(yǎng)2天后發(fā)現(xiàn)大部分細胞，克隆成團掉落，少數(shù)抗性克隆依舊生長,見圖11。第12天，停止加藥篩選，挑取單克隆克隆。TALEN實驗組挑取了培養(yǎng)皿中所有的克隆共計48個，標記為T2N1~48；對照組挑取了28個克隆標記為N1~28挑完后剩余的克隆數(shù)用Giemsa染色計數(shù)取直徑大于100um的克隆，共計剩余TALEN136106個克隆。11.mESCsGiemsamESCs克隆。mESCs定點整合PCR鑒將挑取的打靶后mESCs克隆以1:1傳代到24孔板，一份用來抽取gDNA,另一份用來保種。除去培養(yǎng)過程中染菌的mESCs克?。═2，T12，N7，N26，共抽36株細胞克隆的gDNA。利用F1-pMrn,R1-pMrnF2-pMrn,R2-pMrn兩對引物對獲得的33gDNA2.7.2中的PCR體系和條件操作。通過F2-pMrn,N4N5N6過F1-pMrn,R1-pMrn引物PCR1553bp小條帶的只有T3，T7，T8，T9，N28，見圖12。由于TALEN組所有mESCs都長菌，所以只能對N28mESCs克隆的PCR產(chǎn)物進行連接。經(jīng)過PCR-T驗證了N28號為陽性克隆，打成功。重新進行TALEN組打靶實驗打靶實驗，挑取48個克隆T2N1~48。通過F2-pMrn,R2-pMrn引物PCR檢測有44個陽性克T2N24，27，39,46；進一步使用F1-pMrn,R1-pMrn引物PCR檢測有20個陽性克?。篢2N3,6,9,10,14,16,17,19,21,23,25，29,30,33,38,40,41,43,44,48PCR-T連發(fā)現(xiàn)pMrn-T2N10，21,30,38為陽性克隆，打靶成功。將獲得的12mESCsPCRA圖是PCR電泳鑒定的陽性克隆條帶，M表示DL2000 marker，泳道1表示引物F2-pMrn,R2-pMrn短臂內(nèi)PCR鑒定定點整合陽性條帶，泳道2表示引物F1-pMrn,R1-pMrn跨整個短臂PCR鑒定定點整合陽性條帶。B、C圖是PCR產(chǎn)物T載體連接后的結(jié)果，圖中標出了外源DNA片段Neo與短同源臂SHA連接的位點，短同源臂SHA與后續(xù)小鼠rDNA區(qū)連接的位點。Southernblot鑒定結(jié)將稀釋后的pMrn質(zhì)粒作為PCR模板標記Southernblot的探針，由于試劑盒中標記的dNTP分子量比較大，所以標記探針較常規(guī)PCR產(chǎn)物在電泳中跑的更慢，見圖13A（配置嚴格體系DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit。從21PCR鑒定為陽性的克隆中挑選6個進行Southernblot鑒定：N28，T2N10，T2N14，T2N21，T2N25，T2N30。如圖7所示，如果pMrn質(zhì)粒打靶成功，標記的探針就會結(jié)合到6.1k的AvrII酶切后的組片段上，打13SouthernblotA圖中DIG為試劑盒標記探針，pMrn為對照組常規(guī)探針，M是 “+pMrn100pg500pg進行電泳。mESCs打靶后核型分對mESCs打靶后鑒定定點整合的陽性克隆N28擴增培養(yǎng)進行G顯帶核型分析。對照文獻中小鼠G帶區(qū)模式圖，小鼠打靶后細胞核型正常，40XY，表明質(zhì)粒打靶小鼠核糖體區(qū)沒有重排或畸變。見圖1414mESCsCre質(zhì)粒的抽提及鑒pCAG-Cre:GFPHindEcoR2329bp4234bp條帶,鑒定正確可用。用jetPRIME?試劑盒將pCAG-Cre:GFP293T細胞中，隨著B17Cre條帶，M是λDNA/HindmarkerBjetPRIMEpCAG-Cre:GFP轉(zhuǎn)染293T24h，50h，74h，96h顯微鏡下觀察熒光亮度驗證質(zhì)粒表達效果。共轉(zhuǎn)pCAG-Cre:GFPhFIX-loxPmESCs培通過pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒hFIX-loxP質(zhì)粒和共同打靶T2N10細胞株，培養(yǎng)在18hFIX-loxPT2N10AhFIX-loxP利用PvuIIBT2N10細胞系第PCR鑒定hFIX-loxP定點整當hFIX-loxP替換掉Neo后，利用引物F9-mF1和F9-mR1，對挑取克gDNAtouchdown-PCR，1681bp19。19PCRhFIX-loxP圖A是hFIX-loxP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，圖B是在mESCs的rDNA區(qū)hFIX與Neo互換結(jié)成功構(gòu)建了打靶小鼠rDNA區(qū)位點的TALEN質(zhì)粒對，并驗證其能有效提高同源重組打靶效率，但是TALEN切割多拷貝區(qū)會對細胞損傷很大甚至致獲得了N28，T2N10，T2N21等21株小鼠胚胎干細胞系細胞陽性克隆，并驗證確實獲得了Neo定點整合且核型正常。構(gòu)建hFIX-loxP質(zhì)粒并鑒定正確挑取396個克隆并抽提gDNA，目前沒有獲得陽性克隆18.2x10-40x10-20pMrn討本實驗組一直以利用核糖體區(qū)（rDNA區(qū)）打靶進行治療作為研究發(fā)出的針對核糖體區(qū)的打靶載體是利用同源重組的原理實現(xiàn)將外源靶入到核糖體區(qū)的目的這種方法的優(yōu)勢是避免了常見的逆轉(zhuǎn)錄或者腺相引起受體的。另外，隨著各種分子生物學技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)小鼠的方法和技術(shù)相當簡單成熟。除此之外，通過生物信息學分析人和小鼠核糖體 區(qū)序列同源構(gòu)建了小鼠核糖體區(qū)靶向載體，打靶小鼠胚胎干細胞，從而獲得定點整合的本研究設計pMrn質(zhì)粒時在外源Neo的兩側(cè)加入了同向的野生型loxP2272loxPCre-loxPhFIX-loxPFIX的序列及兩側(cè)的loxP位點。通過Cre酶介導同源重組可以快速有效地將凝血因子FIX的序列替換Neo，由此來驗證rDNA區(qū)治療血友病B的有效性和安全性。據(jù)文獻，TALEN作為的編輯技術(shù)，本研究將其引入以提高打靶效率。雖然成功的獲得了定點整合的mESCs13B6.1kd9k左右的非目的條帶我們推測一是靶入片段Neo上的AvrII酶切不完全造成的，和增加樣本量三個方面的優(yōu)化Addgene上重新訂購pCAG-Cre:GFP質(zhì)粒菌株，這種質(zhì)粒的特點是將CreGFP靶細胞后正常表達CrepCAG-Cre:GFPT2N10細胞株，分別采用核轉(zhuǎn)試劑盒pCAG-Cre:GFP1ughFIX-loxP（PvuⅡ線性化1.5×106T2N10細胞株。將打靶后細胞種在事先鋪好MEF細胞的10cmdish中培養(yǎng)。觀察細胞綠色熒光蛋白表達量，比較出A-30效果最好。21pCAG-Cre:GFPT2N10N28/T2N10/T2N21hFIX-loxP質(zhì)粒七次，挑取396PCR條件，目前尚無獲得可以表達hFIXmESCs96gDNA的過程中，由于細胞量太少，沒有獲得足夠量的gDNA甚至丟失，導致PCR模板量不足導致最后取gDNA進行PCRPCR的模板模式動物在血友病治療領(lǐng)域的應：XFVIII（A）或凝血因子FIX（血友病B突變導致凝血功能除非進行有效地預防，否則重型患者（凝血因子活性低于1%）將頻繁自發(fā)導致關(guān)節(jié)內(nèi)血腫畸形甚至意外目前主要的治療為靜脈注射重組體凝血因子或凝血因子濃縮劑，了患者的生活質(zhì)量因此治療在血友病治療中具備從根本上排除病因的優(yōu)勢，而狗體型大，血量多，可以進行治療方案的放大實驗，并且便于長期觀察。前病機制十分復雜同時和道德限制了我們無法以人類作為研究對象去深入了避免和對象上的局限，準確深入地研究發(fā)病機制和治療。從第一例SCID-ADA的接受治療到現(xiàn)在已經(jīng)有20多年了為了更合型載體導入到干細胞系內(nèi)，所有自帶細胞都將會攜帶供體，并長期持續(xù)細胞，肝細胞，這些細胞可以一直表達直至[2]。從1989到2014年，在全世界超過37個國家，已經(jīng)有2142例治療實驗進入了臨床，對于治療研究需求在運用了47種以上的載體方面可見一斑[3]。雖然不夸張地說已經(jīng)有許多模式動物型通過了有效的治療驗證論證但是大部分的治療研究對象都集中在少數(shù)幾種主要的遺傳疾病血友病便是單治療研究中最為常見的遺傳疾病。血友病ABX遺傳的血液病，分別是缺乏了凝血因子8和9，這兩個因子在肝中合成后分泌到血液中[4]。目前治療方法主要是在時注射血漿提純或重組體凝血因子。相，，比表達不需要在特定的靶向組織，表達產(chǎn)物也不需要精確調(diào)控。其優(yōu)勢在以得到明顯的治療效果有研究表明凝血因子的長期表達只要達到野生型的2-3%，就可以大幅減輕血友病的臨床表現(xiàn)[5]。如果超過30%的表達量在大多數(shù)環(huán)境下都能像正常人一樣[6]。另一個優(yōu)勢是，血友病B存在缺陷的凝血因子F9的cDNA大小只有約1.4k，有利于載體攜帶編碼序列進入靶細胞[7]。，，到目前為止已經(jīng)開展了多例不同的血友病治療進入了臨床階段按轉(zhuǎn)載體可分為反轉(zhuǎn)錄載體腺載體腺相關(guān)載體和非載體[8][9][10][1]。以反轉(zhuǎn)錄載體的治療在模式動物和實驗中，血友病A疾病表型都（1%-3.%依賴更高的劑量，并且需要誘導細胞進行組織[1][12][13][14]。近期反轉(zhuǎn)錄載體最重要的突破慢的開發(fā)