克隆基因治療

克隆基因治療第1頁/共65頁第2頁/共65頁二、動(dòng)物的核移植試驗(yàn)

（一）移植開端

1938年漢斯.施佩曼提出他稱之為“奇異的實(shí)驗(yàn)”的設(shè)想：從發(fā)育到后期的胚胎（成熟的或未成熟的胚胎均可）中取出細(xì)胞核，將其移植到一個(gè)卵子中。

1952年，研究細(xì)胞全能性的第一個(gè)人R.Briggs（羅伯特.布里格斯）豹紋蛙→囊胚期細(xì)胞核→去核的同種蛙卵→卵發(fā)育成個(gè)體（即克?。┡咛ズ笃诘津蝌?、成蛙的細(xì)胞→細(xì)胞核去核的同種蛙卵→失敗.

認(rèn)為胚胎早期細(xì)胞核具有全能性，而胚胎以后各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞核難以體現(xiàn)全能性，即分化難以逆轉(zhuǎn)，多數(shù)生物學(xué)家轉(zhuǎn)向以未成熟的胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物的領(lǐng)域。第3頁/共65頁二、動(dòng)物的核移植試驗(yàn)（二）胚胎細(xì)胞核移植—胚胎細(xì)胞克隆胚胎早期（囊胚期）的細(xì)胞核移入去核的異種動(dòng)物的受精卵中，使受精卵發(fā)育成個(gè)體的過程。鯉魚囊胚細(xì)胞鯽魚受精卵↓↓具有生殖能力取核去核受精卵肌肉蛋白含量比鯉魚高↘↙3.78%

融合→培育→雜交魚→脂肪含量比鯉魚高

5.58%第4頁/共65頁1除核2注核3注核4注核5

注核6電擊第5頁/共65頁（三）體細(xì)胞核移植—體細(xì)胞克隆

動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)又稱體細(xì)胞核移植技術(shù)或無性繁殖技術(shù)，它是用動(dòng)物特定發(fā)育階段的核供體（體細(xì)胞核）及相應(yīng)的核受體（去核的原核胚或成熟的卵母細(xì)胞、卵細(xì)胞）不經(jīng)過有性繁殖過程，進(jìn)行體外重構(gòu)，并通過重構(gòu)胚的胚胎移植，從而達(dá)到擴(kuò)繁同基因型動(dòng)物種群的目的。

1、體細(xì)胞克隆的類型

（1）同種體細(xì)胞核移植：科學(xué)家用取自一只6歲成羊的乳腺細(xì)胞培育成功一只克隆羊。

（2）異種體細(xì)胞核移植：陳大元等將大熊貓的子宮上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核的兔卵母細(xì)胞后，分別有9.9%、6.8%和11.7%的重構(gòu)卵發(fā)育到囊胚，染色體、線粒體DNA和核DNA分析均證實(shí)異種重構(gòu)胚的核遺傳物質(zhì)來自大熊貓供體細(xì)胞。這不僅開創(chuàng)了大熊貓?bào)w細(xì)胞移核的先例，而且也是首次大熊貓?bào)w細(xì)胞核的異種移核。對(duì)大熊貓的快繁及保護(hù)提供了一線希望。第6頁/共65頁（三）體細(xì)胞核移植—體細(xì)胞克隆2、體細(xì)胞克隆的一般方法

胎兒細(xì)胞或成年動(dòng)物已分化的細(xì)胞作為核供體，進(jìn)行細(xì)胞核移植，得到與供體細(xì)胞具有同性質(zhì)動(dòng)物的過程?？寺⊙颉岸嗬颉钡目寺》椒ㄈ缦拢篈羊乳腺細(xì)胞B羊未受精卵↓↓取出細(xì)胞核除去細(xì)胞核的卵

↘融合

↙顯微注射↓電擊融合早期胚胎發(fā)育↓胚胎移植到C羊子宮↓

C羊分娩產(chǎn)下“多莉”與A羊同第7頁/共65頁山東皮膚細(xì)胞克隆牛北京克隆牛欣欣欣欣之母萊陽農(nóng)學(xué)院克隆牛第8頁/共65頁（四）關(guān)于克隆人

1997年,克隆(即無性繁殖)羊“多莉”的問世,讓人們聽到了克隆人的腳步聲。由于克隆人不單純是科技問題,更是對(duì)人類社會(huì)及其未來命運(yùn)有著非同尋常影響,所以國(guó)外各界人士紛紛從科學(xué)、哲學(xué)(包括科技哲學(xué)、價(jià)值哲學(xué)、倫理學(xué)、宗教哲學(xué))、社會(huì)學(xué)、法學(xué)、心理學(xué)等不同角度，對(duì)克隆人問題展開了廣泛的探討?？寺∪恕叭傋印钡目茖W(xué)家是：美國(guó)“克隆基金”主任布瓦瑟利耶、肯塔基州列克星頓大學(xué)激素學(xué)院院長(zhǎng)扎沃斯和意大利科學(xué)家安蒂諾里。由于此三人是克隆人的堅(jiān)定推崇者，因此被學(xué)術(shù)界稱為“科學(xué)瘋子”。第9頁/共65頁（四）關(guān)于克隆人

1、克隆人就在我們身邊（1）體細(xì)胞克隆人的過程—人造人（2）同卵雙胞胎的產(chǎn)生過程—天然的克隆人

同卵雙胞胎—由同一個(gè)受精卵一分二，而二個(gè)細(xì)胞各自發(fā)育形成二個(gè)獨(dú)立個(gè)體，二個(gè)人不但細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)完全相同，而在完全相同的子宮環(huán)境發(fā)育成長(zhǎng)，比由克隆技術(shù)產(chǎn)生的克隆人有更完美的吻合度。這個(gè)完美的天然的克隆人是一種更為完美的克隆人，真正意義上的克隆人—同卵雙胞胎第10頁/共65頁（四）關(guān)于克隆人第11頁/共65頁天然的克隆人第12頁/共65頁（四）關(guān)于克隆人

2、治療性克隆與生殖性克隆

治療性克隆:體細(xì)胞核→卵細(xì)胞→新的細(xì)胞→“桑椹”→胚胎干細(xì)胞→克隆人體器官，供醫(yī)學(xué)研究，解決器官移植供體不足問題等。

例如：治療性克隆希望使用病人自己細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)來產(chǎn)生胰島以治療糖尿病,或者產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞來修復(fù)受損的脊髓。第13頁/共65頁2、治療性克隆與生殖性克隆

生殖性克隆:即通常所說的克隆人。體細(xì)胞核→卵細(xì)胞→新的細(xì)胞→“桑椹”(胚胎干細(xì)胞)→胚胎植入到一個(gè)女性子宮→嬰兒如果干細(xì)胞保留時(shí)間超過14天，它就可能長(zhǎng)出神經(jīng)元，此時(shí)，這一細(xì)胞就有了生命意義。據(jù)報(bào)道，1999.11（1998.11）美國(guó)科學(xué)家在馬薩諸塞州的細(xì)胞技術(shù)公司，用人的皮膚細(xì)胞克隆出首個(gè)人類胚胎，12天后把它焚化燒毀。目前國(guó)際上已對(duì)治療性克隆規(guī)定了三條原則。一是取得的材料卵子、體細(xì)胞，必須是自愿的，不能是騙來的，不能是買來的，提供者有知情權(quán)。二是胚胎細(xì)胞保留時(shí)間不能超過14天，超過了，就被視為動(dòng)機(jī)不純，有克隆人之嫌。三是不能將克隆的胚胎細(xì)胞植入人體子宮。第14頁/共65頁遼寧省計(jì)劃生育研究院王彤博士等人在我國(guó)首次完成人類全胚胎體外培養(yǎng)取得成功。目前止共培養(yǎng)成活28例人類胚胎.存活最常至今22天.左圖是培養(yǎng)液中的約1cm長(zhǎng)的人胚胎。受精后20-50天胚胎長(zhǎng)度2mm-1cm.2004年4月19日錢江晚報(bào)第15頁/共65頁（五）體細(xì)胞克隆目前存在的問題

體細(xì)胞克隆已在牛、綿羊、山羊、小鼠和豬等動(dòng)物中取得了成功，但在其它動(dòng)物上還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。其總體水平仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，走向?qū)嵺`運(yùn)用還面臨許多問題，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1.費(fèi)用高、效率低：通過體細(xì)胞克隆動(dòng)物的費(fèi)用非常高，如僅用于制作“多莉”的費(fèi)用就超過了200萬英鎊，同時(shí)效率很低。根據(jù)目前的研究報(bào)道情況綜合來看，克隆綿羊只有3%左右的重組胚能發(fā)育為正常后代。在克隆牛的研究中，重組胚的囊胚發(fā)育率最高能達(dá)49%，約有80%的移植胚能發(fā)育為正常胎兒，但胎兒出生后的死亡率達(dá)50%?？寺⌒∈笱芯恐?，只有2%～3%的重組胚能發(fā)育產(chǎn)仔，仔鼠死亡率也高達(dá)40%。以上結(jié)果說明，體細(xì)胞克隆技術(shù)僅處于初步研究階段，還需要在其它動(dòng)物上進(jìn)一步充分研究，以提高生產(chǎn)效率。第16頁/共65頁（四）體細(xì)胞克隆目前存在的問題2.克隆胎兒初生體重增加，質(zhì)量差：由于培養(yǎng)基中血清的存在，導(dǎo)致早期胚胎基因表達(dá)發(fā)生改變，致使許多克隆動(dòng)物初生重增加，很難自然分娩，大多數(shù)需人工輔助。初生兒還伴有各種缺陷，死亡率增高。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因還不清楚，目前只能從優(yōu)化培養(yǎng)條件及操作程序入手以減少胎兒死亡率。3.克隆動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育不正常，非正常死亡率高：研究發(fā)現(xiàn)，有些用修飾過的細(xì)胞培育出的克隆動(dòng)物存在缺陷，它們?cè)谏L(zhǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)難以預(yù)料的后果?！岸嗬颉毖蛟谏L(zhǎng)過程中就出現(xiàn)了比同齡羊提前衰老的現(xiàn)象，而且現(xiàn)已死亡。亦有研究表明，克隆鼠成年后?；加蟹逝职Y的原因與早期胚胎階段的細(xì)胞缺陷有關(guān)。第17頁/共65頁（五）成功率低的原因盡管也有少數(shù)成功率較高的報(bào)道,但目前公認(rèn)的體細(xì)胞克隆成功率在1%～3%?？寺∨咛ヒ浦埠蟮某錾势骄坏?0%。胎兒異常、流產(chǎn)和圍產(chǎn)期死亡率高,出生后一周的死亡率最高可達(dá)100%。原因七方面:1.不能高效率的去除受體卵母細(xì)胞的染色體：現(xiàn)有的各種去核技術(shù)都要損失部分卵母的細(xì)胞質(zhì)。2.重組胚的融合和卵母細(xì)胞質(zhì)的激活3.供體核與受體胞質(zhì)細(xì)胞周期同步的問題：供體核與受體胞質(zhì)細(xì)胞周期同步與否是影響克隆胚胎發(fā)育的重要因素之一。目前通用的受體胞質(zhì)是M期的卵母細(xì)胞。目前一般認(rèn)為,除了S期以外,其它各時(shí)期細(xì)胞均可作為核供體。第18頁/共65頁（五）成功率低的原因4.線粒體來源問題：無論直接注射還是細(xì)胞融合,供體核都帶入一部分細(xì)胞質(zhì)。于是,就出現(xiàn)了移核胚胎的線粒體來源問題。結(jié)論不一致：來源于受體；來源于共體與受體雙方。5.端粒的問題：端粒(telomere)是染色體端部特化部分,因無黏性而能防止染色體黏著。細(xì)胞每復(fù)制一次端粒核苷酸就減少50～100bp。端粒復(fù)制要靠端粒酶(telomerase)。正常細(xì)胞缺乏此酶,故端粒隨細(xì)胞分裂而變短,細(xì)胞衰老。而生殖細(xì)胞和癌細(xì)胞則都有此酶,因此不衰老。那么,克隆動(dòng)物是否會(huì)遺傳供核細(xì)胞縮短的端粒而提前衰老呢?不一致：多莉短；克隆牛不短。第19頁/共65頁（五）成功率低的原因6.X-染色體滅活問題：雌雄哺乳動(dòng)物的基因劑量補(bǔ)償是通過滅活雌性動(dòng)物的一條X-染色體來實(shí)現(xiàn)的。正常情況下,著床前胚胎的兩條X染色體都活動(dòng)。后來,上胚層中X染色體隨機(jī)滅活,而滋養(yǎng)層細(xì)胞則專門滅活父系X染色體。死亡克隆胎盤X染色體隨機(jī)滅活,但活克隆為父親X染色體滅活。7.克隆胚胎某些基因的再程序化異常：已經(jīng)證明,受精后父系和母系基因組都發(fā)生廣泛的去甲基化。有人證明,牛著床前移核胚胎中有些重復(fù)序列的甲基化異常,某些胚胎基因往往不能再激活。這說明,大多數(shù)克隆胚胎的后成性再程序化異常,不徹底的再程序化可能是造成克隆成功率低的原因。第20頁/共65頁醫(yī)用細(xì)胞工程——基因?qū)?/p>

基因治療

GeneTherapy

第21頁/共65頁內(nèi)容提示基因治療(genetherapy)體細(xì)胞基因治療、生殖細(xì)胞基因治療基因轉(zhuǎn)移方法靶細(xì)胞特點(diǎn)、靶細(xì)胞種類反義寡核苷酸技術(shù)自殺基因與旁觀者效應(yīng)第22頁/共65頁基因治療（Genetherapy

）

基因治療（Genetherapy

）：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的，實(shí)施相應(yīng)的策略。第23頁/共65頁一、基因治療策略策略：直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療：糾正突變基因

在原位修復(fù)缺陷的基因，以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實(shí)現(xiàn)）第24頁/共65頁2、間接療法：以正常的基因替代致病基因。

導(dǎo)入外源正?；颍嬗腥毕莸幕?。而對(duì)靶細(xì)胞而言，沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。用DNA重組技術(shù)設(shè)法修復(fù)患者細(xì)胞中有缺陷的基因，使細(xì)胞恢復(fù)正常功能而達(dá)到治療遺傳病的目的。

第25頁/共65頁途徑:

就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同，基因治療有兩種途徑：

1、生殖細(xì)胞基因治療

2、體細(xì)胞基因治療第26頁/共65頁

1、生殖細(xì)胞基因治療將正常基因轉(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞（精細(xì)胞，卵細(xì)胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個(gè)體。為理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。

第27頁/共65頁但還存在某些問題：1）靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展；2）基因轉(zhuǎn)移效率不高，只能用顯微注射方法；3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動(dòng)物，很難適用于人類。（但目前輔助生殖技術(shù)的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細(xì)胞的辦法。一次可獲取少者3-5個(gè)，多者十幾個(gè)。）第28頁/共65頁2．體細(xì)胞基因治療

somaticcellgenetherapy

將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。第29頁/共65頁

措施：（1）正?；蜣D(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細(xì)胞，有效表達(dá)后，再回輸?shù)襟w內(nèi)。（2）正?；?qū)氚屑?xì)胞，定位整合到染色體上，準(zhǔn)確的替換異?；颍抢硐氲拇胧?。（3）隨機(jī)整合，非特定座位，只要有效的表達(dá)即可達(dá)到治療的目的。（4）體細(xì)胞基因治療理論上不必矯正所有的體細(xì)胞。第30頁/共65頁存在的問題

對(duì)特定座位基因轉(zhuǎn)移，目前還存在較大困難；隨機(jī)插入可能引起后代的基因突變。第31頁/共65頁二、基因治療的方法基因治療的關(guān)鍵性步驟----

目的基因的獲得與轉(zhuǎn)移

第32頁/共65頁基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離

基因克隆↓定位↓表達(dá)↓評(píng)價(jià)表達(dá)情況一）目的基因的獲得—

正?；虻姆蛛x與克隆第33頁/共65頁二）外源基因的轉(zhuǎn)移通過不同方法，將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。第34頁/共65頁1）物理方法（1）電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。

瞬間細(xì)胞細(xì)胞膜核膜通透性增加

高壓脈沖

DNA滲入細(xì)胞第35頁/共65頁（2）顯微注射法（microinjection）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核

第36頁/共65頁例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

重組基因DNA

微注射（體外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

動(dòng)物模型：轉(zhuǎn)基因鼠

(每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)第37頁/共65頁第38頁/共65頁clonesheepDolly體細(xì)胞提取核重組細(xì)胞回植Dolly卵細(xì)胞去核細(xì)胞第39頁/共65頁（3）微粒子轟擊法

利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。第40頁/共65頁2）化學(xué)法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。第41頁/共65頁磷酸鈣+DNA→混合微細(xì)顆?！?/p>

沉淀反應(yīng)20~30min

↓

細(xì)胞在沉淀物中暴露5~24h

方法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低。第42頁/共65頁3）脂質(zhì)體法（liposome）應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜性結(jié)構(gòu)——脂質(zhì)體，包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其表達(dá)。

DNA細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化細(xì)胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜第43頁/共65頁4）同源重組法

同源重組（homologusrecombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。

是將外源基因定位導(dǎo)入細(xì)胞的染色體上。

單交換

雙交換

第44頁/共65頁通過同源重組定點(diǎn)插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正?；蜃粠в兄榈鞍谆虻馁|(zhì)粒

C重組后，插入外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細(xì)胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，沒有插入新基因的細(xì)胞死亡，將有重組的細(xì)胞篩選出來。第45頁/共65頁5）病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtransfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細(xì)胞感染細(xì)胞重組病毒第46頁/共65頁

逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)

常用的病毒載體

DNA病毒

1)逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）

目前應(yīng)用最多、最成功.病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。第47頁/共65頁第48頁/共65頁例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結(jié)構(gòu)：

LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5

U3=增強(qiáng)子，R=啟動(dòng)子，U5=轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

Ψ=病毒包裝信號(hào)，gag=核心抗原，pol=逆轉(zhuǎn)錄酶，env=外殼蛋白。第49頁/共65頁逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)：①高效感染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)100%②病毒基因和所載的外源基因都可能表達(dá)③宿主范圍廣，可同時(shí)感染大量細(xì)胞并長(zhǎng)期存留第50頁/共65頁缺點(diǎn)

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒隨機(jī)插入靶細(xì)胞基因組中，因病毒具有強(qiáng)大的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，能使插入點(diǎn)附近的基因過度表達(dá)或失活，插入的外源基因可能不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；第51頁/共65頁③逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用，可能使受體細(xì)胞癌變。

根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點(diǎn)，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點(diǎn)，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包裝信號(hào)。第52頁/共65頁6）受體載體轉(zhuǎn)移法將含有目的基因的重組質(zhì)粒和某些細(xì)胞表面受體能識(shí)別的特異性多肽（配體）形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。重組質(zhì)粒配體細(xì)胞膜復(fù)合物第53頁/共65頁三）靶細(xì)胞的選擇靶細(xì)胞是指接受外源Gene的體細(xì)胞選擇靶細(xì)胞的原則是：1）必須較堅(jiān)固，便于體外培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳技術(shù)操作；2）易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)3）具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)（能存活幾月至幾年，或整個(gè)生命周期）4）易于受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。第54頁/共65頁常見的靶細(xì)胞外周血T淋巴細(xì)胞上皮細(xì)胞內(nèi)皮皮膚成纖維細(xì)胞造血干細(xì)胞——β地中海貧血、嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病等基因治療肝C——家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的基因治療肌細(xì)胞第55頁/共65頁第三節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控一、基因表達(dá)調(diào)控的例征（一）不同條件下的基因激活1、細(xì)菌和其他單細(xì)胞生物中，不同條件下可形成不同的酶是廣泛存在的現(xiàn)象。許多單細(xì)胞生物生活在水溶液中，溶液的溫度、pH、培養(yǎng)基成分經(jīng)常變化，細(xì)胞必須隨時(shí)改變酶的成分，才能適應(yīng)周圍環(huán)境的變化。2、酵母菌小菌落在缺氧、有氧條件下，均酵解；大菌落無氧酵解，有氧進(jìn)行有氧呼吸。3、人類的乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶都是誘導(dǎo)酶。第56頁/共65頁一、基因表達(dá)調(diào)控的例征（二）不同發(fā)育階段的基因活性多細(xì)胞生物的不同組織細(xì)胞的基因活性仍有很大差別。1、脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶的變化：LDH有五類：LDH1—LDH5。小鼠卵細(xì)胞中，只有LDH1，大約發(fā)育到第9天，主要是LDH5，再發(fā)育又出現(xiàn)LDH1，表明編碼LDH1和LDH5的基因在不同時(shí)期分別處于打開和關(guān)閉的狀態(tài)。2、人的血紅蛋白組成的變化：血紅蛋白用于氧的運(yùn)輸，在人發(fā)育的各個(gè)階段中，血紅蛋白的組成各不相同。早期胚胎（1-3個(gè)月）：HbGower1、HbGower2、HbPotland三種血紅蛋白。胎兒：HbF、HbA新生兒：HbF70—80%、HbA30—20%成人：HbA95%、HbA22.5%、HbF<1%第57頁/共65頁二、原核類基因表達(dá)的調(diào)控*

細(xì)菌和噬菌體的基因調(diào)控多數(shù)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，操縱子是細(xì)菌主要的基因調(diào)控單位，即轉(zhuǎn)錄單位。

1960年雅各布和莫諾共同提出了乳糖操縱子模型。其調(diào)控機(jī)理：

乳糖操縱子=啟動(dòng)基因（P）+操縱基因（O）+結(jié)構(gòu)基因（lacZ、lacY和lacA三個(gè)）組成，操縱子的前邊有一個(gè)調(diào)節(jié)基因R。乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因R能產(chǎn)生一種阻遏物（阻遏蛋白），當(dāng)培養(yǎng)基中沒有乳糖時(shí)，阻遏蛋白與操縱基因相結(jié)合，阻值RNA聚合酶的前進(jìn)，mRNA轉(zhuǎn)錄就不能進(jìn)行，乳糖代謝所需三種酶就不能合成。當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖時(shí)，乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)型發(fā)生變化，失去與操縱基因結(jié)合的能力，這時(shí)結(jié)構(gòu)基因可轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)一步合成乳糖代謝所需三種酶利用乳糖。第58頁/共65頁三、真核類基因表達(dá)的調(diào)控（一）真核生物與原核生物基因表達(dá)調(diào)控的差異**1、分子水平上的區(qū)別：真核細(xì)胞基因組的含量和基因數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原核細(xì)胞，并且DNA與組蛋白結(jié)合成核小體結(jié)構(gòu)，同時(shí)與非組蛋白結(jié)合成染色體。2、細(xì)胞水平上的區(qū)別：真核細(xì)胞的染色體是被包在核膜內(nèi)，轉(zhuǎn)錄和翻譯分別在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。3、個(gè)體水平上的區(qū)別：絕大多數(shù)真核生物都是復(fù)雜的多細(xì)胞有機(jī)體，個(gè)體發(fā)育過程復(fù)雜，不同組織細(xì)胞的基因，總是在不同的時(shí)空序列中被活化或阻遏。因此，真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控是一種多層次的調(diào)控系統(tǒng)，它涉及到DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多個(gè)調(diào)控點(diǎn)。第59頁/共65頁三、真核類基因表達(dá)的調(diào)控（二）真核類基因不同層次的表達(dá)和調(diào)控類型1、染色體、DNA水平上的調(diào)控（1）染色質(zhì)丟失：在發(fā)育過程中，體細(xì)胞丟失某些基因，這些基因永不表達(dá)，這是一種極端的不可逆基因調(diào)控。如小麥癭蚊、馬蛔蟲：2n=2，染色體上排列許多著絲粒，在發(fā)育早期只有其中一個(gè)著絲粒起作用。當(dāng)個(gè)體發(fā)育到一定階段以后，除了將來發(fā)育成生殖細(xì)胞的體細(xì)胞外，其它體細(xì)胞均發(fā)生染色體斷裂形成許多小染色體。其中含有著絲粒的小染色體在以后的細(xì)胞分裂中保存下來，沒有著絲粒的在分裂中消失，致使最后85%的基因丟失。（2）基因擴(kuò)增：改變基因數(shù)量使之迅速增加而調(diào)節(jié)基因表達(dá)方式。即短期內(nèi)細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生某一基因拷貝的手段。如非洲爪蟾卵母細(xì)胞中rDNA的拷貝數(shù)可由平時(shí)的1500份急劇增加到200萬份。它是適應(yīng)胚胎發(fā)育時(shí)對(duì)核糖體的需求。（3）轉(zhuǎn)座因子：引起插入部位基因的開啟和關(guān)閉。第60頁/共65頁三、真核類基因表達(dá)的調(diào)控2、轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（1）非組蛋白的調(diào)控作用：小鼠染色質(zhì)重建實(shí)驗(yàn)說明非組蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄起著重要的作用。骨髓細(xì)胞染色質(zhì)→分離組分→DNA、組蛋白、非組蛋白胸腺胞染色質(zhì)→分離組分→DNA、組蛋白、非組蛋白骨髓DNA+骨髓組蛋白+胸腺DNA+胸腺組蛋白↓混合↓染色質(zhì)↙↘

胸腺非組蛋白骨髓非組蛋白↙↘轉(zhuǎn)錄胸腺RNA

轉(zhuǎn)錄骨髓RNA第6