分子植物病理學(xué)

分子植物病理學(xué)第1頁(yè)/共198頁(yè)3、主要研究方法（mainstrategy）

◆從“里”到“外”：以研究寄主和病原物的基因?yàn)橹饕獙?duì)象，闡明寄主－病原物相互作用的有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、調(diào)控及其產(chǎn)物功能。

◆方

法導(dǎo)向：先以分子克隆的方法鑒定與致病性有關(guān)的基因，然后根據(jù)該基因產(chǎn)物及其對(duì)生物表型的影響，確定該基因的類型和作用。

◆在分子（DNA）水平上通過(guò)互補(bǔ)分析和缺失研究，從個(gè)體到群體分析有關(guān)基因的作用和功能表現(xiàn)的調(diào)節(jié)。第2頁(yè)/共198頁(yè)4、分子植物病理學(xué)的發(fā)展（history）

分子植物病理學(xué)是植物病理學(xué)中最年輕的分支，是在遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物物理學(xué)等現(xiàn)代學(xué)科發(fā)展和影響下逐漸形成的。然而，由于各種病原物的分類地位及其所從屬的學(xué)科不同，因此，在各種植物病害的研究中，運(yùn)用分子植物病理學(xué)觀點(diǎn)和方法對(duì)其進(jìn)行研究的水平是不平衡的?！镏参锊《静『Φ姆肿由飳W(xué)研究

1935，W.M.Stanley成功分離出TMV結(jié)晶，并證明結(jié)晶的大部分組成是protein.1937,E.C.Borden﹠N.w.Pirie報(bào)道了TMV的化學(xué)組成，提出該病毒由95％protein和5％RNA組成．第3頁(yè)/共198頁(yè)

1955～1956，H.Frankel-Conrat對(duì)TMV的蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行了重組研究，為證明核酸作為一種遺傳物質(zhì)的作用提出了令人信服的證據(jù)．可被TMV抗體純化不能被HR抗體純化侵染植物RNA供體病毒的特征分離出的病毒顆粒能被HR抗體鈍化雜合病毒TMVCPHRRNA1958,Giereretal,用亞硝酸誘變獲得TMV突變株,使壞死病斑從0.2%增加到15%,進(jìn)一步說(shuō)明病毒RNA的突變與致病功能的關(guān)系.第4頁(yè)/共198頁(yè)★

植物細(xì)菌病害的分子生物學(xué)研究

植物病原細(xì)菌中歐氏桿菌歸屬于腸桿菌科，這類病原菌的分子遺傳研究在20世紀(jì)70年代初才開(kāi)始，較肺炎雙球菌的分子遺傳學(xué)研究遲了近40年，較DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)晚了將近20年。

20世紀(jì)50～70年代是植物病原細(xì)菌基因操作技術(shù)積累的時(shí)期。

1953～1956，D.T.Klein﹠R.M.Klein發(fā)現(xiàn)根癌土壤桿菌的基因轉(zhuǎn)化與致病性有關(guān)的現(xiàn)象。

1957，R.R.Corey﹠M.P.Starr發(fā)現(xiàn)了菜豆黃單胞的轉(zhuǎn)化作用與其對(duì)鏈霉素抗性和菌落形態(tài)變化之間的關(guān)系。

1966，日本學(xué)者完成了水稻白葉枯病菌的轉(zhuǎn)化研究。第5頁(yè)/共198頁(yè)農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）

1944,發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌侵染的植物組織可以在不加激素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

1970，G.Moreletal.發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌致病菌有兩種類型，其區(qū)別在于對(duì)兩種不常見(jiàn)Arg衍生物章魚(yú)堿（octopine）和胭脂堿（nopaline）的代謝不同。

1973,J.A.Lippincoot證明，無(wú)致病力菌株喪失對(duì)上述兩種Arg衍生物的利用能力，因此，農(nóng)桿菌有3種類型。typetoxicoctopinenopalineoctopineopaline

A++－+－

B+－+－+C－－－－－

細(xì)菌利用腫瘤組織合成第6頁(yè)/共198頁(yè)1974～1978，農(nóng)桿菌菌株的遺傳轉(zhuǎn)化研究。其中，1977，M.D.Chilton證明農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上只有一小段DNA與腫瘤誘發(fā)有關(guān)系，而且可以從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞；1978，J.Schell首次以Ti為載體把帶有抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)座子Tn7轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中去，開(kāi)創(chuàng)了以Ti質(zhì)粒為載體轉(zhuǎn)移外源DNA進(jìn)入植物的植物基因工程研究日益興旺，同時(shí)對(duì)Ti質(zhì)粒的精細(xì)分析和與寄主植物互作的研究成為分子植物病理學(xué)研究熱點(diǎn).歐氏桿菌(Erwiniaspp)

歐氏桿菌與大腸桿菌相近,同時(shí)也是重要植物病原細(xì)菌,因此開(kāi)始分子遺傳學(xué)研究較早。20世紀(jì)70年代,M.P.Starr實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了歐氏桿菌Hfr菌株的結(jié)合遺傳學(xué)研究，，利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記轉(zhuǎn)移法對(duì)其致病基因進(jìn)行作圖,結(jié)果表明,致病基因位于染色體上his和thr兩個(gè)基因之間.第7頁(yè)/共198頁(yè)

自1984年N.T.Keen首次報(bào)道從菊歐氏桿菌(E.Chrysanthemi)中克隆到果膠裂解酶基因后,發(fā)表了有關(guān)歐氏桿菌中2個(gè)種pel基因克隆的報(bào)道,其中涉及編碼5個(gè)主要同工酶的5個(gè)pel基因.假單胞細(xì)菌(Pseudomonas.spp.)

茄青枯假單胞(P.solanacearum)丁香假單胞(P.syringae)

大豆斑點(diǎn)病菌(P.s.pv.glycinea)大豆假單胞(P.glycinea)★

植物真菌病害的分子生物學(xué)研究傳統(tǒng)植物病理學(xué)中許多重要的理論和學(xué)說(shuō)都是以真菌病害為模式發(fā)展起來(lái)的,但在分子病理學(xué)方面的進(jìn)展明顯滯后.1979年M.E.Case在粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)和J.Tilburn在巢曲霉(Aspergillus)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)試驗(yàn)相繼取得成功后,絲狀植物病原真菌的分子生物學(xué)研究發(fā)展迅速.第8頁(yè)/共198頁(yè)5、分子植物病理學(xué)研究進(jìn)展（Review）

GeneforGeneHypothesis

植物對(duì)某種病原菌的特異性抗性取決于它是否具有抗性基因，即寄主分別含有感病基因（r）和抗病基因（R），病原分別含有有毒基因（vir）和無(wú)毒基因（avr），只有當(dāng)具有抗性基因的植物與具有無(wú)毒基因的病原相遇時(shí)，才能激發(fā)植物的抗病反應(yīng)，其他情況下二者表現(xiàn)親和，即寄主表現(xiàn)感病。第9頁(yè)/共198頁(yè)5.1病原菌致病相關(guān)基因的研究進(jìn)展

致病性基因(Pathogenicitygenes)是病原均與寄主植物互作過(guò)程中決定對(duì)植物致病性的基因。它決定著病原菌在寄主植物過(guò)程中與植物建立寄生關(guān)系，破壞寄主植物細(xì)胞正常生理代謝功能以及調(diào)控對(duì)植物的吸附、侵染、定植擴(kuò)展和最終顯癥等過(guò)程。致病基因主要包括毒性基因和無(wú)毒基因,前者決定對(duì)植物表現(xiàn)親和性,即調(diào)控病害的發(fā)生與發(fā)展;后者決定病原菌小種與含相應(yīng)抗病基因的寄主植物品種表現(xiàn)?；圆挥H和。無(wú)毒基因(Avirulentgenes)廣泛存在于寄主植物的病原中，Staskawiczetal（1984）通過(guò)把含無(wú)毒基因avrA的大豆丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)6號(hào)小種的Cosmid克隆接合轉(zhuǎn)移到不含avrA的小種中，以遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，克隆了avrA，這是克隆的第一個(gè)無(wú)毒基因。隨后，許多研究者通過(guò)類似的方法從不同的病原(包括細(xì)菌、真菌和病毒)中克隆了50多個(gè)無(wú)毒基因，涉及40～50種病原物。第10頁(yè)/共198頁(yè)5.1.1植物病毒無(wú)毒基因的研究

TMV等近10種病毒的無(wú)毒基因已得到研究，現(xiàn)已明確的病毒無(wú)毒基因產(chǎn)物均為病毒致病相關(guān)功能蛋白，包括病毒外殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白。

1986,Beachy,etal.將TMVU1株的外殼蛋白cDNA轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞，獲得了高抗性的煙草植物，此后，利用外殼蛋白基因獲得抗病毒病植物的方法很快被應(yīng)用到其他病毒和植物上。病毒：TMV，ALMV，CMV，TRV，

PVX，PVY，SMV，BMV，RSV

寄主：煙草，番茄，馬鈴薯，大豆，水稻第11頁(yè)/共198頁(yè)5.1.2植物病原細(xì)菌無(wú)毒基因的研究

自第一個(gè)植物病原細(xì)菌無(wú)毒基因avrA從丁香假單胞菌大豆致病變種6號(hào)生理小種中被克隆后，目前已從丁香假單胞菌、甘藍(lán)黑腐黃單胞桿菌的不同變種和青枯假單胞菌等植物病原細(xì)菌中克隆了40多個(gè)無(wú)毒基因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)從其它植物病原菌中克隆到的無(wú)毒基因。細(xì)菌無(wú)毒基因產(chǎn)物在植物細(xì)胞內(nèi)的定位及氣與激發(fā)子HR的關(guān)系是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。研究結(jié)果表明，無(wú)毒基因產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)其激發(fā)子功能的場(chǎng)所不在胞外空間，而是依賴于功能性hrp(Hypersensitiveresponsesandpathogeni-city)基因產(chǎn)物直接將無(wú)毒基因產(chǎn)物從菌體內(nèi)轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)其激發(fā)子功能。第12頁(yè)/共198頁(yè)

應(yīng)用植物基因工程技術(shù)將具有能激活植物自身防御系統(tǒng)的無(wú)毒基因與適合于植物背景、非專一性的病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子組合成嵌合基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中。通過(guò)農(nóng)桿菌或基因槍的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物,可篩選出高效廣譜的抗真菌和細(xì)菌病害的轉(zhuǎn)基因植株。楊希才等(2001)從病原細(xì)菌PseudomonassyringaePV.tomato中獲得的無(wú)毒基因avrD(0.93kb)和從病原真菌Phytophthoraparasitica中獲得的無(wú)毒基因Elicitin(0.294kb)分別與非專一性病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子Pill和BG組成含2個(gè)嵌合基因(Pill-avrD,BG-Elicitin)的植物表達(dá)載體pYH144和pYHEt。通過(guò)農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯,其中用pYH144載體轉(zhuǎn)化2個(gè)品種(克新1號(hào),2號(hào)),用pYHEt載體轉(zhuǎn)化3個(gè)品種(Desiree,克新2號(hào),4號(hào)),通過(guò)組織培養(yǎng)分別獲得潮霉素(HygromycinB)標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯試管苗,對(duì)馬鈴薯晚疫病具有明顯的抗性。第13頁(yè)/共198頁(yè)5.1.3植物病原真菌無(wú)毒基因的研究

由于缺乏簡(jiǎn)便有效的克隆方法,真菌無(wú)毒基因的克隆已落后于細(xì)菌無(wú)毒基因以及相應(yīng)植物抗病基因的克隆,這已成為進(jìn)一步研究克隆抗病基因與真菌無(wú)毒基因產(chǎn)物互作及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的制約因素之一。第14頁(yè)/共198頁(yè)番茄葉霉病菌（Cladosporiumfulvum）的無(wú)毒基因

現(xiàn)已從不同番茄品種中鑒定了許多抗性基因，這些基因的近等位基因系對(duì)已知的病原小種表現(xiàn)明顯的不同反應(yīng)被侵染葉片的非原生質(zhì)體汁液中含有真菌結(jié)構(gòu)蛋白和定植期間被誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白。其中之一是無(wú)毒基因avr9的產(chǎn)物，與番茄抗病基因cf9的產(chǎn)物特異性互作。目前，已對(duì)avr9基因產(chǎn)物進(jìn)行了純化和測(cè)序，明確了其分子結(jié)構(gòu)，為一個(gè)63個(gè)AA的前體蛋白，C末端含有28個(gè)AA的成熟激發(fā)子，因此，可以從蛋白質(zhì)到基因的克隆途徑來(lái)鑒定基因。所分離的基因克隆表明，avr9的ORF中有一個(gè)59bp的短內(nèi)含子。能在cf4基因型的番茄上誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的小種?；图ぐl(fā)子及無(wú)毒基因avr4的產(chǎn)物也已被純化和測(cè)序并以相同的方法克隆到無(wú)毒基因avr4。第15頁(yè)/共198頁(yè)稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）的無(wú)毒基因

稻瘟病是世界性重要病害，現(xiàn)已作為模式病害，從經(jīng)典遺傳學(xué)、分子生物學(xué)核細(xì)胞生物學(xué)等不同的角度進(jìn)行了全方位的分子病理學(xué)研究。

《RiceBlastDisease》Zeigler,etal.1994

在已鑒定克隆的8個(gè)pwi基因（pathogenicityofweepinglovegrass,對(duì)畫(huà)眉草致病）。pwi1基因是從馬唐與畫(huà)眉草菌株雜交后鑒定出來(lái)的，對(duì)畫(huà)眉草的致病性發(fā)生了變化，因此，根據(jù)經(jīng)典的無(wú)毒基因控制一種寄主植物品種轉(zhuǎn)化性的概念預(yù)測(cè)pwi2基因有阻止對(duì)畫(huà)眉草侵染的作用。目前用染色體步查的方法已克隆了pwi2基因，并進(jìn)行了測(cè)序。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)水稻菌株含有1到數(shù)個(gè)pwi2拷貝。通過(guò)研究具有不同寄主專化性的稻瘟病菌株pwi2同源序列的分布，發(fā)現(xiàn)pwi是一個(gè)多基因家族。第16頁(yè)/共198頁(yè)亞麻柵銹病菌（Melampsoralini）無(wú)毒基因

亞麻銹病的寄主－病原物關(guān)系是研究最充分的病例。目前已鑒定出34個(gè)抗病基因分別存在于7個(gè)群中。用?射線進(jìn)行缺失誘變克隆到4個(gè)無(wú)毒基因。但目前對(duì)亞麻銹病菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)還不十分成熟。大麥云紋病菌（Rhynchosporiumsecalis）無(wú)毒基因大麥近等位基因系A(chǔ)tlas對(duì)小種US138.1是感病的，Atlas46帶有抗病基因Rrs1是對(duì)小種US138.1抗病的。Atlas╳Atlas46第一代、第二代對(duì)小種US138.1抗性遺傳分析表明，這種抗性是由單個(gè)共顯性基因控制的。小種US138.1產(chǎn)生的3種能誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的多肽NIP1、NIP2和NIP3在兩個(gè)品種上誘導(dǎo)壞死的能力是相同的。NIP1、NIP2的存在與不親和互作中壞死的發(fā)生有關(guān)，在親和互作中不產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。在小種US138.1的不親和互作中病程相關(guān)蛋白PRHv-1的mRNA的積累水平比在親和互作中高，而且只有US138.1產(chǎn)生的NIP1能特異地誘導(dǎo)帶Rrs1抗病基因的品種產(chǎn)生PRHv-1的mRNA。因此，NIP1可能是一種無(wú)毒基因。該基因的克隆和轉(zhuǎn)化研究正在進(jìn)行。第17頁(yè)/共198頁(yè)

5.2植物抗病基因的研究

自Johal,etal(1992)成功克隆出第一個(gè)玉米抗圓斑病R基因Hm1以來(lái)，迄今人們已經(jīng)從9種不同植物中成功地克隆出了22種R基因?？寺≈参颮基因一般采用產(chǎn)物導(dǎo)向法(product-orientatedapproaches)、鳥(niǎo)槍射擊法(shot-guncomplementation)、扣除雜交法(subtractivehybridization)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)記法(transposontagging)和圖位克隆法(map-basedcloning)等7種方法，但只有轉(zhuǎn)座子標(biāo)記法和定位克隆法取得了成功。上述22種R基因都是采用這兩種方法克隆的。第18頁(yè)/共198頁(yè)已克隆的植物抗病基因第19頁(yè)/共198頁(yè)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)在分子植物病理學(xué)中的廣泛應(yīng)用，尤其是抗病基因的成功克隆與分析，對(duì)植物抗病基因的分子功能已有一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。B.Baker和K.E.Hammond-Kosack等（1997）分別從寄主－病原物相互作用和克隆分離的抗病基因結(jié)構(gòu)特征闡述了植物抗病基因的功能即識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和進(jìn)化。

有待解決的問(wèn)題：

∮在抗病基因產(chǎn)物中那些結(jié)構(gòu)決定病原物的特異性識(shí)別？

∮其下游信號(hào)物質(zhì)是什么？這些物質(zhì)又是如何起作用的？

∮被誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)對(duì)不同病原物為什么具有特異性抗性？

∮自然界中新的抗性基因是如何產(chǎn)生的？第20頁(yè)/共198頁(yè)第一章病原物致病相關(guān)基因第一節(jié)病原物基因組的結(jié)構(gòu)特征植物病原真菌基因組植物病原細(xì)菌基因組植物病毒基因組植物線蟲(chóng)基因組第21頁(yè)/共198頁(yè)第二節(jié)病原物致病基因的類型

1決定親和性的基因

1.1編碼致病因子的基因：胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)合成有關(guān)酶的基因、編碼未知產(chǎn)物的基因。病原菌中還有正向調(diào)控寄主范圍的基因，將這些基因轉(zhuǎn)移到相關(guān)細(xì)菌中，可使受體菌擴(kuò)大寄主范圍，使原來(lái)的不親和互作變?yōu)橛H和互作，這在植物病原細(xì)菌的小種和致病變種中都有發(fā)現(xiàn)。

1.2克服寄主防衛(wèi)反應(yīng)的基因：目前已報(bào)道的有植物病原真菌對(duì)植保素解毒酶基因（pda）。

第22頁(yè)/共198頁(yè)2決定不親和性的基因2.1無(wú)毒基因（avr）

無(wú)毒基因編碼特異性激發(fā)子與抗病基因產(chǎn)物受體互作。病原無(wú)毒基因編碼的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)有些是直接起激發(fā)子的作用，如番茄葉霉病菌的無(wú)毒基因avr9編碼63個(gè)AA的多肽。而有些是編碼激發(fā)子合成的酶，如番茄丁香假單胞菌的無(wú)毒基因avrD的產(chǎn)物是3.4×104u的蛋白，在合成激發(fā)子中具有酶的功能。

TMV的外殼蛋白在含有N’抗病基因的煙草中是過(guò)敏反應(yīng)的激發(fā)子；其avr表型決定因子可能是復(fù)制酶蛋白，有些植物病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白基因也具有無(wú)毒基因的功能（Padgettetal，1993）。2.2決定非寄主不親和性基因（寄主?；曰颍?/p>

目前，在植物病原細(xì)菌和真菌中都已分離到非寄主專化性的激發(fā)子。韋忠民（1993）證明梨火疫病菌hrpN的編碼蛋白（harpin）具有激發(fā)子功能，能誘導(dǎo)非寄主植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。第23頁(yè)/共198頁(yè)第二節(jié)植物病毒的侵染過(guò)程

與致病相關(guān)基因1侵染過(guò)程（自學(xué)）王金生.《分子植物病理學(xué)》.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.肖火根.病毒在植物體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn).病毒學(xué)報(bào),2001,17(3):282-287.張振臣.植物病毒胞間運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)蛋白基因介導(dǎo)的抗病性研究進(jìn)展.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2000,8(4):403-408.曹雪松.植物病毒在胞內(nèi)和胞間運(yùn)動(dòng)的研究.萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，

2002,19(4):251-252.第24頁(yè)/共198頁(yè)2植物病毒致病相關(guān)基因2.1外殼蛋白基因（coatproteingene）

R.Beachy(1986)首次將TMV的CP基因轉(zhuǎn)入煙草，培育出穩(wěn)定遺傳的抗病毒工程植物以來(lái)，已經(jīng)克隆了至少15個(gè)病毒組中30種病毒的CP基因，并成功轉(zhuǎn)化了20多種植物，其中一些植株已經(jīng)進(jìn)入田間試驗(yàn)。

CP基因的抗性機(jī)理：（1）抑制病毒脫殼。（2）干擾病毒的復(fù)制。（3）限制病毒粒子的擴(kuò)展與運(yùn)轉(zhuǎn)。（1）CP基因所表達(dá)的mRNA與侵入病毒RNA之間相互作用（RNA介導(dǎo)的病毒抗性）。存在的問(wèn)題（1）多表現(xiàn)為延遲發(fā)病和降低發(fā)病嚴(yán)重度，免疫類型和高抗類型較少。（2）具有潛在危險(xiǎn)性。第25頁(yè)/共198頁(yè)2.2復(fù)制酶基因（replicasegene）

病毒編碼的復(fù)制酶蛋白存在多個(gè)保守序列，其中一個(gè)是存在于所有RNA聚合酶中的Gly-Asp-Asp三肽基元序列（GDDmotif）,對(duì)維持聚合酶活性必不可少。另一個(gè)保守序列是三磷酸核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NTPbindingdomain），在病毒復(fù)制時(shí)的解螺旋過(guò)程中起重要作用。

Zaitlinetal(1990)將TMV的54KD蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草并獲得抗性煙草后，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了此類由病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因介導(dǎo)的植物對(duì)病毒的抗性。

復(fù)制酶介導(dǎo)抗性的特點(diǎn)：

（1）對(duì)完整病毒粒子和裸露病毒RNA均具有高度抗性。（2）抗性水平與整合到染色體上的基因拷貝數(shù)無(wú)關(guān)。（3）抗性持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并對(duì)高溫（31℃）不敏感。

（4）具有明顯的株?；?。第26頁(yè)/共198頁(yè)

抗性機(jī)理：

（1）在蛋白質(zhì)水平上，復(fù)制酶蛋白在病毒的侵染過(guò)程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮正常功能，從而打破了病毒正鏈和負(fù)鏈復(fù)制的平衡或干擾了控制復(fù)制酶活性的反饋抑制途徑。

（2）在RNA水平上，轉(zhuǎn)錄出的mRNA與病毒的復(fù)制酶進(jìn)行了無(wú)效結(jié)合而抑制其正常功能，或者是mRNA誘導(dǎo)了植物的自然抗性。

缺損型復(fù)制酶基因也可以介導(dǎo)抗性。T.M.Andersonetal(1992)將TMVFny株系的RNA內(nèi)部缺失94個(gè)核苷酸后導(dǎo)入煙草，結(jié)果，缺失造成ORF的移碼，其翻譯產(chǎn)物只有完整的97KD蛋白的75％左右，但仍然表達(dá)對(duì)CMV的高度抗性。第27頁(yè)/共198頁(yè)2.3運(yùn)動(dòng)蛋白基因（movementproteingene）

病毒基因編碼的基因產(chǎn)物MP能與胞間連絲結(jié)合，使胞間連絲可以通過(guò)物質(zhì)的孔徑增大，以允許病毒粒子或基因組核酸進(jìn)入鄰近細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)。

研究證明，完整的TMV基因表達(dá)并不能介導(dǎo)抗性的產(chǎn)生。M.Lapidotetal(1993)&SIMalyshenkoetal（1993）將TMV的缺陷型MP（dMP）基因轉(zhuǎn)入煙草后能獲得抗TMV植株，進(jìn)一步研究表明，轉(zhuǎn)dMP基因的煙草不僅對(duì)TMV，還對(duì)其他病毒如CMV、BMV等具有不同程度的抗性。由此可見(jiàn)，各種病毒MP之間雖然缺乏同源性，但具有相同的功能。

抗性機(jī)制：由于缺陷型MP與野生型MP競(jìng)爭(zhēng)胞間連絲上的結(jié)合位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的。第28頁(yè)/共198頁(yè)2.4衛(wèi)星病毒（satelliteRNA）

某些病毒除基因組外，還伴有一些小片段RNA，它們本身并沒(méi)有編碼外殼蛋白的遺傳信息，稱為衛(wèi)星RNA。攜帶衛(wèi)星RNA的病毒稱為輔助病毒。迄今已報(bào)道有6組共26種植物病毒帶有衛(wèi)星RNA。衛(wèi)星RNA對(duì)植物病毒的影響有3種表現(xiàn)：加重癥狀；無(wú)調(diào)節(jié)作用；減輕癥狀。1986年，Baulcombe等首次將CMV的satRNA克隆轉(zhuǎn)入煙草，獲得了抗CMV的基因工程植株。

抗性機(jī)制：衛(wèi)星RNA與病毒基因組爭(zhēng)奪病毒復(fù)制酶。由于衛(wèi)星RNA能更有效地占據(jù)RNA復(fù)制酶，而且其分子小、復(fù)制周期短，因此，隨著復(fù)制循環(huán)的增加，satRNA的復(fù)制量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組RNA復(fù)制量，最終是病毒基因組的復(fù)制受阻。

雖然衛(wèi)星RNA只需低水平表達(dá)，不產(chǎn)生異源蛋白，但這種抗性僅在侵染晚期發(fā)揮作用，而且轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)減輕癥狀的衛(wèi)星RNA有可能突變成加重癥狀的衛(wèi)星RNA，因此具有一定的潛在危險(xiǎn)性。第29頁(yè)/共198頁(yè)2.5核酶基因（ribozymegene）

核酶是一類具有特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)、能特異性催化切割自身及其它RNA分子的小分子RNA。廣泛存在于一些類病毒和病毒衛(wèi)星RNA序列中。根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)可分為錘頭型和發(fā)夾型，其中錘頭型核酶較為普遍。人們可根據(jù)核酶可切割任何生物的RNA，而且對(duì)底物作用位點(diǎn)的堿基序列要求不嚴(yán)格這一特性，設(shè)計(jì)出切割已知序列的病原性RNA人工核酶。目前，人工核酶已成功應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞，在體外實(shí)現(xiàn)了對(duì)HIV等有害基因轉(zhuǎn)錄物的特異性切割。在植物抗病毒方面，也成功地在體外合成了能切割馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTV）等的基因組RNA的核酶、能切割蘋果銹果類病毒的核酶等，但是，在轉(zhuǎn)基因植物水平上的進(jìn)展緩慢。體內(nèi)表達(dá)不如體外表達(dá)有效。

該方法也存在潛在危險(xiǎn)性，即核酶可能將細(xì)胞RNA作為靶RNA切割而破壞細(xì)胞正常功能。第30頁(yè)/共198頁(yè)第三節(jié)植物病原細(xì)菌的致病相關(guān)基因1基因克隆的策略和研究方法1.1基因克隆策略1.2突變誘變方法1.2.1物理誘變1.2.2化學(xué)誘變1.2.3轉(zhuǎn)座子誘變第31頁(yè)/共198頁(yè)突變方法1.物理誘變紫外線（UV）、X射線和、γ射線誘變；離子束誘變，離子束是元素的離子經(jīng)高能加速器加速后獲得的放射線；中子

2.化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑：堿基類似物、亞硝酸如亞硝基胍(NTG）、丫定橙染料、烷化劑如甲基磺酸乙脂（EMS）等3.轉(zhuǎn)座子插入突變第32頁(yè)/共198頁(yè)野生型細(xì)菌的基因組文庫(kù)物理和化學(xué)誘變獲得的突變體兩親交配或三親交配進(jìn)行功能互補(bǔ)獲得能恢復(fù)突變體表型的陽(yáng)性克隆克隆片段的亞克隆分析和進(jìn)一步功能互補(bǔ)驗(yàn)證基因的克隆、測(cè)序和序列分析第33頁(yè)/共198頁(yè)熱激或電激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)座子插入突變第34頁(yè)/共198頁(yè)轉(zhuǎn)座子誘變致病性測(cè)定，獲得致病性發(fā)生變化的突變體獲得相應(yīng)的突變體以轉(zhuǎn)座子的側(cè)端序列為探針進(jìn)行Southern雜交，確定轉(zhuǎn)座子插入的拷貝數(shù)，明確突變表型是由于轉(zhuǎn)座子的插入引起得突變體的遺傳穩(wěn)定性分析第35頁(yè)/共198頁(yè)Fig.Symptomsexpressedoncitrusleaves2

weeksafterinoculationwithX.

campestrispv.citriXW47(A),XT906(B),orXT906(pUW906XAp)(C).RequirementforPhosphoglucoseIsomeraseofXanthomonascampestrisinPathogenesisofCitrusCanker.Appl.Envir.Microbiol.1999;65:5564-5573

第36頁(yè)/共198頁(yè)Fig.Structuralorganizationofthepgi(A)andhrpX(B)lociofX.

campestrispv.citriandofplasmidsderivedtherefrom.(A)Restrictionmapofthegenomicregioncontainingpgishowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthesiteoftransposoninsertioninthemutantXT906.(B)RestrictionmapofthegenomicregioncontaininghrpXshowingtheorientationofthegene(horizontalarrow)andthestructureoftheplasmidpUW10PGUS,whichcontainsanhrpX::gusfusiongene.

第37頁(yè)/共198頁(yè)WeiQianetal.Comparativeandfunctionalgenomicanalysesofthepathogenicityofphytopathogen

Xanthomonascampestrispv.CampestrisGenomeRes.2005;15:757-767AschematicillustrationoftheexperimentallydeterminedinteractionbetweenXccandhostcell第38頁(yè)/共198頁(yè)1.3基因文庫(kù)的構(gòu)建

?

構(gòu)建基因文庫(kù)常用的載體有質(zhì)粒（plasmid）、黏粒（cosmid）和λ噬菌體(phaseλ)。適用于作基因克隆的質(zhì)粒載體必須具備3個(gè)共同的組成部分，即復(fù)制因子、選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。

?理想基因文庫(kù)應(yīng)具備的條件：（1）以一種穩(wěn)定的形式含有基因組DNA的序列。（2）克隆總數(shù)不宜過(guò)大。（3）文庫(kù)的克隆片段大小必須足夠包含一個(gè)完整的基因。（4）克隆片段大小適應(yīng)于載體的容納能力，便于進(jìn)行酶切圖譜分析。（5）應(yīng)從少量的起始材料進(jìn)行構(gòu)建并易于篩選理想的片段。（6）克隆片段之間需要有部分片段重疊以利于chromosomewalking。（7）克隆片段應(yīng)易于從載體上切下而不帶有任何載體序列。（8）文庫(kù)應(yīng)能在克隆不損失的情況下得到擴(kuò)增，而且能長(zhǎng)期保存。第39頁(yè)/共198頁(yè)1.4基因克隆1.4.1轉(zhuǎn)座子表簽法第40頁(yè)/共198頁(yè)1.4.2鳥(niǎo)槍法

在已獲得標(biāo)記基因突變體和基因文庫(kù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，用基因庫(kù)互補(bǔ)突變體篩選使圖變體表型恢復(fù)的克隆。該克隆含有目的基因功能片段的序列，并將此克隆轉(zhuǎn)移到E.coli中得到純系克隆，在與突變體互補(bǔ)進(jìn)行驗(yàn)證。1.4.3基因功能互補(bǔ)法常用來(lái)克隆控制寄主范圍的基因如無(wú)毒基因。第41頁(yè)/共198頁(yè)第42頁(yè)/共198頁(yè)1.5克隆片段的亞克隆分析第43頁(yè)/共198頁(yè)2與病理過(guò)程有關(guān)的基因

植物病原菌的侵染過(guò)程一般包括趨化性、吸附、定植和侵入。已鑒定出土壤農(nóng)桿菌的一條染色體基因chvE與其細(xì)菌的趨化性有關(guān)，此外，該細(xì)菌染色體上的picA基因還影響細(xì)菌的聚集而與毒性有關(guān)。

A.Kelman等用轉(zhuǎn)座子誘變方法獲得了青枯假單胞菌類似多型性表型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，并在分子水平上進(jìn)行了研究，該基因?yàn)閜hcA.2.1與病原菌侵染有關(guān)的基因

第44頁(yè)/共198頁(yè)2.2決定顯癥的基因

植物病原細(xì)菌的癥狀類型與其致病生化因子有密切關(guān)系。如細(xì)胞降解酶與組織浸離癥狀有關(guān)；產(chǎn)生壞死癥狀的病菌如丁香假單胞引起的各種葉斑病都涉及到毒素的作用；毒素和多糖還和植物萎蔫癥狀有關(guān)。有關(guān)這些基因的克隆、結(jié)構(gòu)鑒定和功能分析早已展開(kāi)并取得很大進(jìn)展。

?

黃單胞菌中一個(gè)800bp的opsX基因參與LPS的生物合成和修飾以及誘導(dǎo)水漬狀反應(yīng)；柑桔黃單胞的pthA基因是引起增生性潰瘍癥狀所必需的。D.W.Gabriel,etal(1995)第45頁(yè)/共198頁(yè)2.3決定寄主范圍的基因2.3.1正向調(diào)控寄主范圍的基因根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）青枯假單胞菌（Pseudomonassolanacearum）黃單胞菌水稻白葉枯枝病致病變種（X.Oxyzaepv.oxyzae）第46頁(yè)/共198頁(yè)2.3.2負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因

植物病原細(xì)菌的無(wú)毒基因是負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因，無(wú)毒基因直接產(chǎn)物或間接產(chǎn)物作為激發(fā)子與相應(yīng)抗病基因產(chǎn)物識(shí)別誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)基因表達(dá)，從而表現(xiàn)小種－品種互作的不親和。無(wú)毒基因失活或缺乏相應(yīng)的無(wú)毒基因則表現(xiàn)小種－品種互作的親和反應(yīng)，所以無(wú)毒基因的作用是病原菌小種對(duì)不同品種的寄主范圍的負(fù)向調(diào)控基因。此外，負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因也可以表現(xiàn)在不同致病變種的致病能力上。第47頁(yè)/共198頁(yè)植物病原細(xì)菌無(wú)毒基因的克隆

B.J.Staskawica（1984）首先通過(guò)基因互補(bǔ)法從大豆丁香假單胞6號(hào)小種中篩選到一個(gè)具有無(wú)毒基因功能的克隆，Napoli（1987）將此基因命名為avrA。此后，已從丁香假單胞菌、甘藍(lán)黑腐黃單胞桿菌的不同變種和青枯假單胞中克隆到40多個(gè)無(wú)毒基因。第48頁(yè)/共198頁(yè)第49頁(yè)/共198頁(yè)無(wú)毒基因的表達(dá)和調(diào)控

以P.syringaepv.glycinea中avrB為代表，其不能在富加培養(yǎng)基上表達(dá)，但可以在基本培養(yǎng)基上表達(dá)。其表達(dá)水平依賴于碳源。在侵染期間，avrB在感病或抗病寄主上都能高水平表達(dá)，在非寄主植物上也能表達(dá)，說(shuō)明表達(dá)不受特異性植物因子調(diào)控。以X.campestrispv.VesicatoriaavrBs3為代表，能在富加、基本培養(yǎng)基以及植物上組成性表達(dá)。這類基因的表達(dá)不依賴于hrp基因簇，但無(wú)毒表型的出現(xiàn)需要有功能的hrp基因，可能是需要hrp基因編碼的無(wú)毒蛋白通道。第50頁(yè)/共198頁(yè)無(wú)毒基因的生理功能

研究表明,許多植物病原細(xì)菌中存在著無(wú)毒基因的隱性同源序列,但這種同源序列已喪失了誘導(dǎo)過(guò)敏性壞死反應(yīng)的功能。說(shuō)明無(wú)毒基因除了有誘導(dǎo)過(guò)敏性壞死反應(yīng)的功能外，還有其自身的生理功能。

無(wú)毒基因是病原物遺傳因子，除誘導(dǎo)寄主植物（含抗性基因）產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)外，還具有決定病原物致病性或適應(yīng)性的功能。無(wú)毒基因的概念是相對(duì)的，在一種病原物中起無(wú)毒基因作用而在另一種病原物中起致病作用。第51頁(yè)/共198頁(yè)無(wú)毒基因與hrp基因互作

無(wú)毒基因通常在體外、腐生或非致病細(xì)菌中并不表達(dá)。因此，一般情況下無(wú)毒基因產(chǎn)物不足以在植物中誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)，必須依賴于一個(gè)具有完全功能的hrp基因介導(dǎo)的機(jī)制分泌。近年來(lái)的研究表明，作為效應(yīng)分子，無(wú)毒基因產(chǎn)物是通過(guò)hrp基因簇所編碼的Ⅲ型通道分泌系統(tǒng)運(yùn)送至細(xì)菌細(xì)胞外與寄主發(fā)生相互作用的。第52頁(yè)/共198頁(yè)2.4決定病原菌致病性或毒性的基因2.4.1胞壁降解酶基因

◆

果膠酶基因

果膠酶是軟腐歐氏桿菌的重要致病因子，并在萎蔫性病害（P.solanacearum

）中也起作用，現(xiàn)已在至少5種病原細(xì)菌中克隆到果膠酶基因。除此之外，在青枯假單胞菌已鑒定出4種胞外酶基因。第53頁(yè)/共198頁(yè)第54頁(yè)/共198頁(yè)

◆

纖維素酶基因

◆

蛋白酶基因

編碼纖維素酶基因已在軟腐歐氏桿菌和青枯假單胞中得到克隆，其主要類型都是內(nèi)聚葡聚糖酶基因。

在熒光假單胞（P.flouorescens）胞外酶對(duì)馬鈴薯塊組織的浸離作用研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶有軟化薯塊組織的浸離作用。王金生等（1984）研究表明，3中軟腐病菌產(chǎn)生的蛋白酶在離體條件下對(duì)馬鈴薯塊組織有較強(qiáng)的浸離力。目前已從軟腐歐氏桿菌中克隆了許多蛋白酶基因并對(duì)其產(chǎn)物特征進(jìn)行了研究，但這些基因在致病過(guò)程中的作用及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。第55頁(yè)/共198頁(yè)第56頁(yè)/共198頁(yè)2.4.2毒素基因

植物病原細(xì)菌的毒素一般是低分子量的非寄主?；远舅?。這一特征有利于對(duì)毒素進(jìn)行遺傳分析，又由于生物測(cè)定是可以敏感微生物代替寄主植物進(jìn)行生物測(cè)試，因此篩選程序簡(jiǎn)單、快速。目前已對(duì)4種丁香假單胞致病變種的毒素進(jìn)行了遺傳分析。

致病變種／毒素TOX菌株類型毒性表現(xiàn)pv.tomato/coronatineTn5突變體僅產(chǎn)生小病斑，菌群增長(zhǎng)不大

pv.phaseolicola/phaseolotoxinUV突變體菌群發(fā)育正常，但無(wú)癥狀出現(xiàn)pv.syringae/syringomycinTn5突變體在櫻桃上降低毒性或完全喪失毒性pv.tabaci/tabtoxin自然突變體接種3d細(xì)菌生長(zhǎng)曲線與野生型不同第57頁(yè)/共198頁(yè)2.4.3胞外多糖基因

研究證明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米細(xì)菌性枯萎病菌和甘藍(lán)黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖與其致病性有關(guān)。2.4.4植物激素基因

致病細(xì)菌誘導(dǎo)植物組織過(guò)度生長(zhǎng)是由于細(xì)菌產(chǎn)生植物激素的作用。這些激素的遺傳決定因子在油橄欖癌腫病假單胞菌和根癌土壤桿菌中已有詳細(xì)研究。第58頁(yè)/共198頁(yè)2.4.5hrp

基因

?Hrp基因的鑒定P.B.Lindgren(1986)用轉(zhuǎn)座子Tn5對(duì)菜豆暈斑病菌（P.syringaepv.phaseolicola）進(jìn)行隨機(jī)插入誘變，篩選出6個(gè)突變體，它們既失去在感病菜豆品種上的致病性，同時(shí)也不再引起非寄主植物如番茄、大豆、煙草和豇豆的過(guò)敏性壞死反應(yīng)。Southern雜交和標(biāo)記交換分析證明，這些突變體表型改變是由于單個(gè)Tn5插入的結(jié)果。從野生型基因文庫(kù)中篩選到一個(gè)黏粒pPL6，可以恢復(fù)所有6個(gè)突變體的hrp突變表型，說(shuō)明該黏粒上帶有hrp基因，且hrp基因是由多個(gè)基因組成的基因簇。第59頁(yè)/共198頁(yè)?Hrp基因的結(jié)構(gòu)和功能保守性

以P.s.pv.syringae的hrp基因?yàn)樘结樑c該病原的其他8個(gè)致病變種的基因組DNA進(jìn)行雜交，結(jié)果都表現(xiàn)出同源性，但不同致病變種間的雜交信號(hào)強(qiáng)度有差別。研究證明，不同病原細(xì)菌的hrp之間也存在同源性，E.amylovora

的hrp至少與8種植物病原細(xì)菌基因組DNA有同源性，其中包括在植物中不引起HR的E.stewartii和E.chrysanthemi。此外，還發(fā)現(xiàn)非病原細(xì)菌E.coli也含有一些能互補(bǔ)E.amylovora

hrp突變體的基因。第60頁(yè)/共198頁(yè)

根據(jù)hrp基因的DNA雜交和異源互補(bǔ)研究結(jié)果，植物病原細(xì)菌可以歸類為兩組（1）包括青枯假單胞和甘蔗黑腐黃單胞的致病變種，其hrp基因簇是共線性的，以相對(duì)較高的嚴(yán)謹(jǐn)度相互雜交，且同源性涉及到hrp基因的大部分；（2）包括丁香假單胞的致病變種和梨火疫病菌，其hrp基因在同一組菌之間具有同源性，但兩組菌之間的hrp基因不存在同源性。植物病原菌中的hrp基因的廣泛存在及保守性說(shuō)明了許多不同植物病害具有共同的機(jī)制，并且可能編碼與病害表達(dá)有關(guān)的具有致病功能的因子，但其隨病原細(xì)菌的不同而有差異，hrp基因的DNA序列在不同類型生物體之間的相似性也說(shuō)明了它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育中的高度保守性。第61頁(yè)/共198頁(yè)?Hrp基因的表達(dá)和調(diào)控環(huán)境誘導(dǎo)和抑制信號(hào)植物成分的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)基因第62頁(yè)/共198頁(yè)?Hrp基因產(chǎn)物及其功能

Hrp基因是一類基因產(chǎn)物未知的基因，已報(bào)道的產(chǎn)物多是根據(jù)Hrp基因的DNA序列分析推測(cè)出來(lái)的。

1992年韋忠民等首先從E.amylovora中分離出一個(gè)激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的蛋白，定名為HarpinEa

由Hrp基因編碼。該蛋白為細(xì)菌外膜相關(guān)蛋白，富含Gly，熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感，不具泌出蛋白特性。功能：（1）調(diào)節(jié)蛋白的功能；（2）跨膜蛋白泌出功能；（3）編碼無(wú)毒基因功能；（4）調(diào)節(jié)無(wú)毒基因表達(dá)功能；（5）信號(hào)識(shí)別功能。第63頁(yè)/共198頁(yè)2.4.6dsp基因

只影響寄主植物的侵染能力，而不影響在非寄主植物上誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)能力的基因稱為dsp基因。它們與病菌的侵襲力和代謝能力有關(guān)。一般認(rèn)為，dsp基因在其基因組中是分散排列的，而在質(zhì)粒上是成簇排列的。2.4.7外泌基因2.4.8致病性調(diào)控基因

是指那些不直接編碼致病因子但對(duì)致病因子產(chǎn)生的總體水平發(fā)生影響的基因。如globalregulatorygene和phenotypeconversion,PC。第64頁(yè)/共198頁(yè)2.4.9編碼未知產(chǎn)物的基因3質(zhì)粒及其在致病中的作用3.1質(zhì)粒的特征及分離3.2質(zhì)粒在決定致病性或毒性中的作用

植物病原細(xì)菌決定致病性或毒性的基因可以在染色體上，也可以在質(zhì)粒上。質(zhì)?；蚩砂o(wú)毒基因、hrp基因以及編碼毒素和植物生長(zhǎng)素的基因。第65頁(yè)/共198頁(yè)3.3質(zhì)粒編碼的非致病特性3.3.1生態(tài)適應(yīng)和進(jìn)化作用

質(zhì)粒的存在使植物病原菌對(duì)環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)能力。一方面是質(zhì)粒在群體中的轉(zhuǎn)移，使許多可利用的基因得以傳播和擴(kuò)散，同時(shí)提高了細(xì)菌群體DNA復(fù)制的效果。另一方面，質(zhì)粒編碼的性狀如產(chǎn)生細(xì)菌素和營(yíng)養(yǎng)能力，增加了細(xì)菌在新環(huán)境中的適應(yīng)和與其他細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)的能力，對(duì)抗生素、重金屬和紫外線輻射的抗性增加了細(xì)菌在不良環(huán)境中存活的機(jī)會(huì)。

質(zhì)?；虻膹?fù)雜性是細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)化的產(chǎn)物。第66頁(yè)/共198頁(yè)3.3.2細(xì)菌素（bactrocin）的產(chǎn)生

自1946年Fredericq報(bào)道大腸桿菌素（colocin）后，至今已報(bào)道了100多種細(xì)菌素。澳大利亞學(xué)者Kerr(1972)分離到一株能產(chǎn)農(nóng)桿菌素84（Agrocin84）的放射土壤桿菌菌株84，該菌株發(fā)酵后產(chǎn)生的A84對(duì)蘋果屬、梨屬、山楂屬和薔薇屬等許多屬植物的根癌并具有較強(qiáng)防治作用，目前該技術(shù)已在澳大利亞、美國(guó)、加拿大、英國(guó)、意大利和希臘等國(guó)家實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)而應(yīng)用于大田防治。第67頁(yè)/共198頁(yè)3.3.3用重組質(zhì)粒向病原細(xì)菌導(dǎo)入新的基因

將從費(fèi)氏弧菌（Vibriofischeri）分離的熒光素基因?qū)胫参锊≡?xì)菌后可使這些細(xì)菌的細(xì)胞形成生物熒光，因此可以利用它們的發(fā)光性來(lái)監(jiān)測(cè)其在植物和環(huán)境中的分布和存活。目前已由實(shí)驗(yàn)室把含有Bt殺蟲(chóng)蛋白基因的重組克隆導(dǎo)入生防菌構(gòu)建成病蟲(chóng)兼治的生防制劑。第68頁(yè)/共198頁(yè)

雙組分調(diào)控系統(tǒng)是生物中普遍存在的和相當(dāng)保守的一種重要調(diào)控機(jī)制。細(xì)菌細(xì)胞在環(huán)境變化是通過(guò)這種調(diào)控系統(tǒng)直接或間接地感受和傳遞信號(hào)，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)有關(guān)基因的表達(dá)或有關(guān)蛋白的活性，從而對(duì)環(huán)境的變化作出反應(yīng)，使細(xì)胞能適應(yīng)環(huán)境的變化?；趯?duì)蛋白質(zhì)AA序列的同源性比較，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近30個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)。

4植物病原細(xì)菌致病基因的調(diào)控機(jī)制

第69頁(yè)/共198頁(yè)4.1雙組分系統(tǒng)的基本組成和調(diào)節(jié)控制組成

典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)有感受蛋白（sensor,modulator,tranmitter）和調(diào)節(jié)蛋白（regulator,effector,receiver）組成。分別由兩個(gè)不同的基因編碼。所有雙組分調(diào)控系統(tǒng)的感受蛋白和調(diào)節(jié)蛋白在AA序列上具有高度的同源性。感受蛋白：C末端250個(gè)AA序列具有明顯的同源性，在這一區(qū)域中，有5個(gè)小區(qū)表現(xiàn)高度的保守性；N末端雖然不具同源性，但是均有2個(gè)疏水區(qū)。調(diào)節(jié)蛋白：N末端120個(gè)AA序列是高度保守的，一些調(diào)節(jié)蛋白的C末端區(qū)也具有同源性。根據(jù)其同源性，可將目前已發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)蛋白分成5類，其中3類C末端具有一定的保守性；一類無(wú)保守性；另一類其分子量較小，近又保守的C末端區(qū)域組成。第70頁(yè)/共198頁(yè)調(diào)控機(jī)制

感受蛋白通過(guò)N末端感受信號(hào)。然后保守的C末端與調(diào)節(jié)蛋白的保守N末端互相作用，將信號(hào)傳遞給調(diào)節(jié)蛋白。這種信號(hào)的傳遞是通過(guò)磷酸化或去磷酸化作用實(shí)現(xiàn)的。在不少雙組分調(diào)控系統(tǒng)中，已經(jīng)證實(shí)感受蛋白是磷酸化激酶，其活性區(qū)正是C末端的保守區(qū)。在這一區(qū)域中，有一個(gè)完全保守的His蛋白激酶，是感受蛋白自身磷酸化位點(diǎn)。感受蛋白在接受環(huán)境信號(hào)后，能將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到調(diào)節(jié)蛋白上，使調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，被磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白即具有了調(diào)節(jié)其他相關(guān)基因表達(dá)的活性。有的感受蛋白還具有磷蛋白磷酸酶的活性，可以通過(guò)去磷酸化作用是被磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白失去活性。輸入信號(hào)感受蛋白調(diào)節(jié)蛋白NCCNP輸出信號(hào)HP第71頁(yè)/共198頁(yè)4.2土壤農(nóng)桿菌毒性基因的調(diào)控植物釋放的信號(hào)物質(zhì)糖ChvE酚類膜外周質(zhì)細(xì)胞質(zhì)PACGBDEVirG無(wú)活性受體有活性VirA跨膜蛋白1跨膜蛋白2第72頁(yè)/共198頁(yè)5植物病原細(xì)菌的致病島（毒力島）5.1概念

毒力島（Pathogenicityisland,PAI）是指細(xì)菌染色體上一段具有典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基因簇，主要編碼與細(xì)菌毒力及代謝等功能相關(guān)的產(chǎn)物。毒力島最早是用來(lái)描述泌尿道致病大腸桿菌（UeropathogenicE.coli,UPEC）染色體上兩個(gè)分子量很大，編碼許多毒力相關(guān)基因的，不穩(wěn)定的外源DNA片段（HackerJ,1997）。隨著研究的不斷深入，現(xiàn)已在動(dòng)植物病原細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了30多個(gè)毒力島。第73頁(yè)/共198頁(yè)5.2毒力島的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能（1）存在于病染菌軟色體上，編碼毒力相關(guān)基因簇的一個(gè)分子量較大的DNA片段。（2）兩端具有RS和IS。（3）位于染色體的tRNA位點(diǎn)內(nèi)或附近，或者與質(zhì)粒、噬菌體整合有關(guān)的位點(diǎn)。（4）其G-C含量、密碼使用與宿主染色體具有明顯的差異。（5）不穩(wěn)定并含有一些潛在的可移動(dòng)成分。（6）編碼的產(chǎn)物多為分泌性蛋白和細(xì)胞表面蛋白。第74頁(yè)/共198頁(yè)第四節(jié)植物病原真菌的致病相關(guān)基因1病原真菌基因克隆的策略和研究方法1.1差異雜交法

分離兩個(gè)菌株的mRNA群體，并用其中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后互相雜交，分離出沒(méi)有被雜交的特異性mRNA，再將此mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA構(gòu)建探針，從基因組文庫(kù)中釣取目的基因克隆。

該方法已被成功地用于克隆巢曲霉（Aspergillusnidulans）的發(fā)育調(diào)節(jié)基因。第75頁(yè)/共198頁(yè)1.2功能互補(bǔ)法以野生型菌株基因文庫(kù)為供體，缺失某種性狀的突變體為受體。突變體是已知目的基因所編碼性狀發(fā)生明顯改變?nèi)缰虏⌒詥适Ш团c致病性有關(guān)的致病生化因子的缺失。因此，用野生型菌株的基因文庫(kù)向突變體轉(zhuǎn)化可以篩選能使突變體性狀發(fā)生恢復(fù)的基因克隆，獲得克隆即含有能互補(bǔ)突變體功能的片段。

該方法已成功用于篩選玉米小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)交配型基因、玉米瘤黑粉病菌(Ustilagomaydis)的b位點(diǎn)和豌豆根腐病菌（Nectriahaematococca）pda基因。第76頁(yè)/共198頁(yè)1.3根據(jù)蛋白質(zhì)克隆基因法從純化的蛋白質(zhì)氨基酸序列推測(cè)基因序列合成探針，標(biāo)記后從基因文庫(kù)中或cDNA文庫(kù)中釣取有關(guān)基因。

從黑曲霉（Aspergillusniger）克隆果膠裂解酶基因D和從番茄葉霉病菌(Cladosporiumfulvum)克隆無(wú)毒基因avr9就是利用這一方法。第77頁(yè)/共198頁(yè)1.4染色體步查（chromosomewalking）法用與目的基因緊密連鎖的RFLP標(biāo)記為探針，從基因文庫(kù)中鑒定出同源片段，再以此片段克隆為探針鑒定出編碼目的基因的基因組重疊區(qū)，將這些克隆在進(jìn)行RFLP分析，從而得到新的RFLP，因?yàn)檎婢蚪M較大，必須一步一步反復(fù)巡查，使克隆的功能片段逐步縮短，才能最終獲得必需的目的基因。

該方法已用于克隆鑒定控制小種－品種轉(zhuǎn)化性的基因即無(wú)毒基因，如萵苣霜霉病菌（Bremialactucae）、稻瘟病菌（Magraparthegrisea）。第78頁(yè)/共198頁(yè)2病原真菌致病過(guò)程的相關(guān)基因2.1參與真菌發(fā)育調(diào)節(jié)的基因游動(dòng)孢子侵染寄主的發(fā)育調(diào)節(jié)基因

鞭毛菌亞門的植物病原真菌的游動(dòng)孢子是主要侵染結(jié)構(gòu)，主要從根的生長(zhǎng)區(qū)、根毛發(fā)生區(qū)和根冠或傷口等處侵染。其侵入并不是隨機(jī)發(fā)生的而是由根和游動(dòng)孢子表面特殊的誘導(dǎo)因子和受體介導(dǎo)的。第79頁(yè)/共198頁(yè)分生孢子侵染寄主的發(fā)育調(diào)節(jié)基因

植物病原真菌的分生孢子一般在水中即可萌發(fā)，但有時(shí)除環(huán)境條件外還受外源物質(zhì)的影響。噬菌體或有機(jī)酸等化學(xué)物質(zhì)可影響孢子萌發(fā)和附著胞的分化甚至組織侵染發(fā)生；番茄葉霉病菌在抗感品種中都可以侵入，但在抗病品種中菌絲在進(jìn)入氣孔后在氣孔腔內(nèi)就被抑制，不能在細(xì)胞內(nèi)形成菌絲網(wǎng)絡(luò)以及從氣孔產(chǎn)生新的分生孢子；分生孢子萌發(fā)后芽管和附著胞中黑色素的沉積有利于增加結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，這對(duì)病菌侵染有時(shí)是必要的。第80頁(yè)/共198頁(yè)2.2編碼致病生化因子的基因編碼胞外酶基因

植物表面的角質(zhì)層是阻礙病原真菌侵入的主要障礙，所以在真菌入侵機(jī)制方面對(duì)角質(zhì)酶的功能及其作用機(jī)制研究較多。至少有22種植物病原真菌已被證明產(chǎn)生角質(zhì)酶。目前，對(duì)豌豆根腐病菌（Fusariumf.

sp.pisi）的角質(zhì)酶致病作用分子機(jī)制進(jìn)行了很深入的研究。許多真菌還產(chǎn)生其他胞外酶如果膠酶、纖維素酶等，但對(duì)這些酶基因的研究并不多。第81頁(yè)/共198頁(yè)編碼毒素的基因

關(guān)于真菌致病毒素的產(chǎn)生及其作用分子機(jī)制主要在玉米小斑病菌產(chǎn)生的T－毒素、燕麥根腐病菌產(chǎn)生的維多利亞毒素和交鏈孢產(chǎn)生的AM、AK和AT毒素等方面有較深入的研究。

T-毒素是一類聚乙醇酮化合物，其產(chǎn)生是由病原菌染色體上單一顯性遺傳位點(diǎn)Toxl決定的。

1947年發(fā)現(xiàn)維多利亞長(zhǎng)蠕孢產(chǎn)生的一種毒素稱為victorin或HV-毒素，由真菌中Tox3控制。與HV－毒素合成有關(guān)的酶和基因尚未鑒定出來(lái)。目前已知至少9種交鏈孢引起的病害與病原菌產(chǎn)生的寄主?；远舅赜嘘P(guān)。第82頁(yè)/共198頁(yè)由交鏈孢產(chǎn)生的寄主?；远舅氐?3頁(yè)/共198頁(yè)編碼植物保衛(wèi)素降解酶的基因

豌豆素為一種異黃酮類化合物，是豌豆產(chǎn)生的一種主要植物保衛(wèi)素。豌豆素在健康豌豆組織中不存在，但受病原菌侵染后幾天其積累量可大植物干重的5％。豌豆茄鐮孢能使豌豆素脫甲基而降低其毒性，這被認(rèn)為是病原菌侵入寄主的一種機(jī)制。強(qiáng)致病力菌株耐豌豆素而使其脫甲基，而弱致病力菌株則對(duì)其敏感而無(wú)脫甲基功能。豌豆素脫甲基酶的基因（pda）已經(jīng)克隆。2.3病原真菌的無(wú)毒基因（自學(xué)）第84頁(yè)/共198頁(yè)3病原真菌低致病力的分子遺傳基礎(chǔ)

低致病力（Hypovirulence）是由于細(xì)胞核遺傳決定因子或細(xì)胞質(zhì)因子如病毒、類病毒的因子、質(zhì)?；蚓€粒體的作用使真菌致病力降低的現(xiàn)象。所有真菌類群都已報(bào)道由病毒或類似病毒的因子。除少數(shù)外，大部分真菌病毒都是dsRNA。自20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)真菌病毒以來(lái)，由于病毒的侵染對(duì)真菌的表型特別是致病性的影響，引起許多植物病理學(xué)家的關(guān)注，并希望應(yīng)用于真菌病害的生物防治。3.1真菌低致病力的發(fā)生第85頁(yè)/共198頁(yè)3.2真菌低致病力與dsRNA的分子生物學(xué)關(guān)系栗疫病菌（Endothiaparasitica）的低致病力

研究表明，栗疫病菌低致病菌株中含有dsRNA，生物防治時(shí)低致病力菌株中的dsRNA可以自然傳遞給正常植株。低致病力植株dsRNA包含在細(xì)胞質(zhì)膜液泡中，并與依賴RNA聚合酶活性有關(guān)。序列分析表明，有些低致病力菌株中含有一個(gè)大的dsRNA分子稱為L(zhǎng)-RNA。同時(shí)還有許多小的dsRNA分子，它們被認(rèn)為是由L-RNA內(nèi)部缺失衍生而來(lái)的。R.Shapira(1990)從菌株EP713中分離和鑒定了L-RNA的全核苷酸序列，其中12.7kb的RNA含有poly-A鏈，有4個(gè)ORF，并研究證明了dsRNA與低致病力有關(guān)的直接證據(jù)。第86頁(yè)/共198頁(yè)

用與低致病力有關(guān)的病毒dsRNA的全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)化無(wú)dsRNA的毒性菌株，轉(zhuǎn)化后經(jīng)鑒定含有預(yù)期的12.7kb的dsRNA，因而使原來(lái)的毒性菌株變?yōu)榈椭虏×?。同時(shí)還證明這種轉(zhuǎn)化后低致病力菌株在數(shù)代產(chǎn)孢后代中仍能維持dsRNA的物理完整性和生物功能。這說(shuō)明cDNA的傳遞以及與低致病力有關(guān)的dsRNA可以經(jīng)分生孢子和子囊孢子穩(wěn)定遺傳。12.7kb的dsRNA有5個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域與馬鈴薯病毒組多聚蛋白中的保守區(qū)域相似，如與RNA聚合酶、蝸牛酶和蛋白酶有明顯的同源序列。第87頁(yè)/共198頁(yè)3.3真菌低致病力的生化特征

栗疫病菌含有dsRNA的低致病力菌株的菌落形態(tài)有所改變，與無(wú)dsRNA的菌株相比，低毒力菌株色素減少；產(chǎn)生分生孢子、氧化酶和蟲(chóng)漆酶，而且還抑制至少9種真菌poly(A)RNA和多肽的合成。研究表明，許多真菌都含有蟲(chóng)漆酶活性，它與木質(zhì)素降解、致病性、產(chǎn)孢和色素形成都有關(guān)系。dsRNA介導(dǎo)的低致病力菌株的蟲(chóng)漆酶的酚氧化活性明顯降低。第88頁(yè)/共198頁(yè)4植物病原真菌致病基因的調(diào)控機(jī)制

真菌致病基因的調(diào)控機(jī)制多數(shù)尚不清楚。目前對(duì)玉米瘤黑粉病菌（U.maydis）交配型的分子遺傳學(xué)研究比較充分。研究表明。玉米瘤黑粉病菌交配反映和交配后生長(zhǎng)發(fā)育受交配型a和b兩個(gè)位點(diǎn)控制。B位點(diǎn)控制有性階段和致病性的發(fā)生，因此是一個(gè)主要的致病基因?，F(xiàn)已證明，b位點(diǎn)中有兩個(gè)等位基因所編碼的兩個(gè)多肽分子互作控制性器官的發(fā)育在該種真菌中作為識(shí)別自我和非自我的雙組分調(diào)控系統(tǒng)。第89頁(yè)/共198頁(yè)第90頁(yè)/共198頁(yè)第二章寄主植物的抗病基因第一節(jié)基礎(chǔ)知識(shí)與基本概念

植物抗病表型：植物與抗病有關(guān)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與生理生化特征。

垂直抗性（verticalresisitance）：由單基因作用，對(duì)病原物某些小種具有較高的抗性而對(duì)其它小種不具抗性。

水平抗性（horizontalresistance）：由多基因作用，對(duì)病原物小種均具有一定程度的抗性。第91頁(yè)/共198頁(yè)

非寄主抗性（non-hostresistance,NHR）：植物對(duì)非自身病原物的抗性。過(guò)敏性反應(yīng)（HR）：植物在病原菌侵染的同時(shí)產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)如程序性細(xì)胞死亡、抗微生物代謝物（如植保素）的合成、對(duì)病原有害物（如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶）的合成以及感染區(qū)域植物細(xì)胞壁的強(qiáng)化。系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）：特定的植物自我保護(hù)信號(hào)傳遞過(guò)程，主要特點(diǎn)是壞死斑的形成，繼而產(chǎn)生廣譜而系統(tǒng)的抗性，其區(qū)別于其他抗性反應(yīng)的標(biāo)志是對(duì)病原的廣譜抗性和相關(guān)基因表達(dá)的變化。第92頁(yè)/共198頁(yè)

抗病基因：其直接產(chǎn)物或間接產(chǎn)物與相應(yīng)的無(wú)毒基因的直接或間接產(chǎn)物相互識(shí)別，從而誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的迅速表達(dá)。防衛(wèi)基因：非親和病原侵染植株后，其無(wú)毒基因產(chǎn)物與寄主相對(duì)應(yīng)的抗病基因產(chǎn)物發(fā)生識(shí)別，會(huì)誘導(dǎo)一些新的基因表達(dá)，這些所表達(dá)的基因即是防衛(wèi)基因?？共』蚺c防衛(wèi)基因是兩個(gè)完全不同的概念，防衛(wèi)基因是直接作用于病原菌，限制病原菌增殖；而抗性基因的產(chǎn)物是直接或間接作用于無(wú)毒基因，將識(shí)別信號(hào)傳給防衛(wèi)基因，進(jìn)而誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的迅速表達(dá)。二者的作用和先后表達(dá)順序不同。第93頁(yè)/共198頁(yè)與病原物親和性因子有關(guān)的抗病性

病原物親和性因子指寄主－病原物親和性互作中，寄主植物表現(xiàn)敏感的病原物致病因子如毒素、胞壁降解酶等。阻止親和性因子作用的抗病性表現(xiàn)，如對(duì)毒素的減毒作用或?qū)Π饷敢种谱饔?，在遺傳上是穩(wěn)定的，因?yàn)橐朔枰@得一種新的親和性因子。

?說(shuō)明植物對(duì)親和性因子抗性機(jī)制的最好例子是玉米圓斑病菌（Cochlioboluscarbonum），該菌小種Ⅰ產(chǎn)生的HC－毒素是一種環(huán)狀多肽（親和性因子），只對(duì)小種Ⅰ敏感的玉米基因型起作用。玉米小種Ⅰ抗性受兩個(gè)核基因HM1和HM2調(diào)控，HM1在1號(hào)染色體上，HM2在2號(hào)染色體上。HM1提供在全生育期及全株抗性，HM2則為半顯性，幼苗是感病的，隨植物成熟度增加而增強(qiáng)抗性表達(dá)。分子克隆及抗性表達(dá)研究表明，HM1編碼HC-毒素還原酶（HCTR），鈍化毒素分子中的羰基。

?目前對(duì)其它類型

病原物親和性因子如胞壁降解酶的研究尚未導(dǎo)致有關(guān)酶抑制劑的分子克隆。第94頁(yè)/共198頁(yè)與病原物不親和性因子有關(guān)的抗病性

與病原物不親和性因子有關(guān)的抗性主要表現(xiàn)在geneforgene互作中。涉及到病原物無(wú)毒基因產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物－－激發(fā)子與寄主受體的特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致寄主防衛(wèi)基因的表達(dá)。病原無(wú)毒基因產(chǎn)物被認(rèn)為是寄主抗病基因產(chǎn)物所識(shí)別的抗原決定簇。無(wú)毒基因?qū)Σ≡纳媸遣焕?，它之所以被保留下?lái)是因?yàn)橄鄳?yīng)抗病基因出現(xiàn)的頻率低和在不帶抗病基因的品種上占優(yōu)勢(shì)。病原物無(wú)毒基因的產(chǎn)物，由于能與寄主植物抗病基因產(chǎn)物互作，進(jìn)而激發(fā)寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，所以又稱激發(fā)子。它可以是無(wú)毒基因的直接產(chǎn)物也可以是間接產(chǎn)物，在后一種情況下，可能包括對(duì)植物正常組分的轉(zhuǎn)化。第95頁(yè)/共198頁(yè)

普通激發(fā)子是指一種病原菌所有成員產(chǎn)生的，能激發(fā)一種植物所有基因型產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的物質(zhì)。常常是微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分，一般在非寄主抗性中也起作用，包括寡多糖、多糖和蛋白質(zhì)及糖蛋白。其中有些是由侵入真菌的牙管結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)的。小種?；约ぐl(fā)子是指表達(dá)一定無(wú)毒基因的病菌小種產(chǎn)生的，僅能激發(fā)那些互補(bǔ)抗病基因的植物品種產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的激發(fā)子。

◆

上述激發(fā)子應(yīng)與非特異性激發(fā)子相區(qū)別。非特異性激發(fā)子如真菌或植物細(xì)胞壁碎片能引起如植保素的合成而降低植物的病害反應(yīng)，但這些激發(fā)子與源于無(wú)毒基因的激發(fā)子有本質(zhì)區(qū)別，無(wú)毒基因激發(fā)子可激發(fā)R基因介導(dǎo)的植物抗病性反應(yīng)。第96頁(yè)/共198頁(yè)第二節(jié)植物抗病基因的克隆策略與方法

克隆基因的途徑分為2種——正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)途徑。前者是依據(jù)目標(biāo)基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ)，通過(guò)鑒定其產(chǎn)物或某種表型突變而進(jìn)行；反向遺傳學(xué)則著眼于基因本身，通過(guò)特定的序列或其在基因組中的位置進(jìn)行。然而，由于人們對(duì)R基因產(chǎn)物及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制、特性知之甚少，加之抗病突變體也難以確定或創(chuàng)造等原因，目前用此方法來(lái)克隆抗病基因尚屬起步階段。在植物抗病基因的克隆工作中，定位克隆或圖譜克隆(positionalcloning，map-basedcloning)和轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)(transposontagging)2種方法都得到了成功的應(yīng)用。第97頁(yè)/共198頁(yè)第98頁(yè)/共198頁(yè)1功能克隆

功能克隆即已知基因編碼產(chǎn)物的克隆方法。當(dāng)目的基因序列未知，但其編碼產(chǎn)物的生理生化及代謝途徑研究得比較清楚時(shí)就可以采用這種克隆方法。根據(jù)克隆基因的原理又可分為兩條路線，一條是分離純化已知的蛋白質(zhì)或多肽，制備該蛋白的特異抗體，利用標(biāo)記的特異蛋白抗體作為探針篩選由表達(dá)型載體建立的基因組文庫(kù)或者cDNA文庫(kù)，通過(guò)免疫雜交篩選到重組克隆，并最終克隆目的基因；第二條路線是將蛋白質(zhì)純化后測(cè)定其N端一段AA序列，根據(jù)蛋白質(zhì)密碼子編碼規(guī)律和密碼子偏愛(ài)原則，反向推算出mRNA序列，然后人工合成一段寡核苷酸作探針，利用同位素或其它方法標(biāo)記后篩選一般的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，篩選陽(yáng)性重組克隆，并最終克隆目的基因。除此之外,也可以用RT-PCR擴(kuò)增法,即根據(jù)已知的氨基酸序列，人工合成簡(jiǎn)并的寡聚核苷酸上游引物，下游引物為Oligo(dT)ｎ，以反轉(zhuǎn)錄cDNA的的第一條鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段連入合適的載體，進(jìn)而酶切或序列分析、鑒定重組子、測(cè)序，從而得到目的基因片段。第99頁(yè)/共198頁(yè)2定位克隆

定位克隆技術(shù)是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法，目標(biāo)基因精確定位在染色體特定位置之后，用目標(biāo)基因兩側(cè)緊密連鎖的標(biāo)記篩選含有大的插入片段的基因組文庫(kù)(如BAC和YAC)，通過(guò)染色體步行篩選到含有目標(biāo)基因的克隆，最后通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。其核心任務(wù)是染色體步行，如果能找到與目標(biāo)基因很近的標(biāo)記，以至于二者之間的距離小于基因組文庫(kù)中克隆的平均插入片段大小,就可以直接篩選到含有目標(biāo)基因的克隆,最終得到候選基因，最后通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，