發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用

發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用第1頁/共43頁20世紀70年代以后，以DNA重組技術(shù)的建立為標志，形成了一個以基因工程為主導(dǎo)，發(fā)酵工程為中心，包括細胞工程和酶工程的現(xiàn)代生物技術(shù)體系。第2頁/共42頁第2頁/共43頁第一節(jié)基因工程菌發(fā)酵一、基因工程技術(shù)通過對核酸分子的插入、拼接和重組而實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，借助載體將重組的目的基因轉(zhuǎn)移新的宿主細胞體系，并使目的基因在新的宿主體系細胞中進行復(fù)制擴增和表達所需的目的產(chǎn)物。第3頁/共42頁第3頁/共43頁基因工程菌的制備一、目的基因的制備

1.鳥槍法選用合適的內(nèi)切酶，在Mg2+的激活下，切開供體DNA鏈獲得目的基因，根據(jù)酶切末端特點分為a、b兩類。第4頁/共42頁第4頁/共43頁基因工程菌的制備2.cDNA法又稱反轉(zhuǎn)錄法，從細胞內(nèi)提取目的基因的mRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA反轉(zhuǎn)錄互補的cDNA。

3.人工合成在電腦控制下通過合成儀合成獲得的DNA片段。第5頁/共42頁第5頁/共43頁二、載體的準備目前常用的基因克隆載體：

1.質(zhì)粒：嚴密性質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒2.pBR322和pUC：去除原有質(zhì)粒的非必須功能，引入選擇標記和在適宜的位置設(shè)置限制酶單一切點。

3.噬菌體載體有λ噬菌體和M13噬菌體第6頁/共42頁第6頁/共43頁三、基因與載體的連接外源DNA與載體DNA之間連接方式：

1.粘性末端連接先用一種酶切割外源DNA并將擬插入的那個片段用凝膠電泳分離出來，再用同一種酶去切載體DNA，這樣可以通過粘性末端連接起來。第7頁/共42頁第7頁/共43頁2.平末端連接

3.在DNA片段末端加上均聚寡核苷酸后連接：末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化DNA末端的3′-OH上添加單核苷酸的反應(yīng)，形成寡聚核苷酸連，如果在一個DNA片段的3′-OH末端上添加寡聚T，那么另一DNA片段的3′-OH末端上一定添加與T互補的寡聚A。第8頁/共42頁第8頁/共43頁四、目的基因?qū)胧荏w細胞取決于是否用合適的受體細胞、合適的克隆載體和合適的基因轉(zhuǎn)移方法第9頁/共42頁第9頁/共43頁2、干熱滅菌法進行干熱滅菌時，微生物細胞發(fā)生氧化，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮引起中毒等作用，其中氧化作用導(dǎo)致微生物死亡是主要依據(jù)。由于微生物對干熱的耐受力比對濕熱強得多，故干熱滅菌所需的溫度要高，時間要長，一般160～170℃，1～1.5h。實際應(yīng)用時，對一些要求保持干燥的實驗器具和材料可以采用干熱滅菌法。第10頁/共42頁第10頁/共43頁第11頁/共42頁第11頁/共43頁濕熱滅菌法利用飽和蒸汽進行滅菌的方法稱為濕熱滅菌法。其原理是借助于蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。由于蒸汽有很強的穿透能力，濕熱滅菌對耐熱芽孢桿菌來說，溫度升高10℃時，滅菌速度常數(shù)可增加8～10倍，對營養(yǎng)細胞更高。蒸汽來源方便，價格低廉，滅菌效果可靠，是目前最為常用的滅菌方法。一般的濕熱滅菌條件為121℃，30min。第12頁/共42頁第12頁/共43頁濕熱滅菌法煮沸滅菌法將要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～20min，一般微生物的營養(yǎng)細胞都可以殺死，但不能殺死芽孢。巴氏消毒法法國微生物學(xué)家、化學(xué)家巴斯德首創(chuàng)的低溫消毒法。加熱到62℃，經(jīng)過30分鐘，以殺死不耐高溫的物質(zhì)中的微生物和病原體的消毒法。牛奶、啤酒、黃酒、醬油和醋等用此法消毒。第13頁/共42頁第13頁/共43頁濕熱滅菌法間歇滅菌法

反復(fù)幾次的常壓蒸汽滅菌，以達到殺死微生物營養(yǎng)體和芽孢的目的。操作步驟：100℃，30-60min；37℃，1h；同上重復(fù)三次…

適用于不宜高壓滅菌的物質(zhì)，如糖類明膠牛奶培養(yǎng)基。方法簡單，但卻麻煩；工作周期長。

第14頁/共42頁第14頁/共43頁濕熱滅菌法高壓蒸汽滅菌法使用密閉的高壓蒸汽滅菌鍋，使滅菌鍋內(nèi)蒸汽不外溢，增加壓力，由于壓力的增高，溫度也隨之增高，從而提高殺菌力，縮短滅菌時間。最有效而廣泛應(yīng)用的滅菌方法實驗室常用的是0.1MPa，121℃，15～30min第15頁/共42頁第15頁/共43頁應(yīng)用范圍

培養(yǎng)基，水，發(fā)酵罐等其他不適合干熱滅菌的物品。高壓蒸汽滅菌法的注意事項：完全排除鍋內(nèi)冷空氣滅菌完畢后要緩慢減壓壓力降為零后打開蓋子第16頁/共42頁第16頁/共43頁二、輻射滅菌法利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺死微生物以紫外線最常用。紫外線對芽孢和營養(yǎng)細胞都能起作用，但細菌芽孢和霉菌孢子對紫外線的抵抗力強。紫外線的穿透力低，僅適用于表面滅菌和無菌室、培養(yǎng)間等空間的滅菌，且距照射物不超過1.2m；對固體物料滅菌不徹底，也不能用于液體物料的滅菌。第17頁/共42頁第17頁/共43頁三、化學(xué)藥品滅菌法某些化學(xué)藥品與微生物發(fā)生反應(yīng)（蛋白變性、酶失活、細胞通透性）而具有殺菌的作用?；瘜W(xué)藥劑適于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等，不適用于培養(yǎng)基?；瘜W(xué)藥品的滅菌使用方法，根據(jù)滅菌對象的不同有浸泡、添加、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏蒸等。第18頁/共42頁第18頁/共43頁⑴高錳酸鉀

高錳酸鉀溶液的滅菌作用是使蛋白質(zhì)、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.1％～0.25％的溶液。⑵漂白粉

漂白粉的化學(xué)名稱是次氯酸鹽(次氯酸鈉，NaOCl)，它是強氧化劑，也是廉價易得的滅菌劑。它的殺菌作用是次氯酸鈉分解為次亞氯酸，后者不穩(wěn)定，在水溶液中分解為新生態(tài)氧和氯，使細菌受強烈氧化作用而導(dǎo)致死亡，對殺死細菌和噬菌體均有效。第19頁/共42頁第19頁/共43頁⑶75％酒精溶液

75％酒精溶液的殺菌作用在于使細胞脫水，引起蛋白質(zhì)凝固變性。對營養(yǎng)細胞、病毒、霉菌孢子均有殺死作用，但對細菌的芽孢殺死作用較差。常用于皮膚和器具表面殺菌。⑷新潔爾滅新潔爾滅是表面活性劑類潔凈消毒劑。它在水溶液中以陽離子形式與菌體表面結(jié)合，引起菌體外膜損傷和蛋白變性。10min能殺死營養(yǎng)細胞，但對細菌芽孢幾乎沒有殺滅作用。一般用于器具和生產(chǎn)環(huán)境的消毒，不能與合成洗滌劑合用，不能接觸鋁制品。第20頁/共42頁第20頁/共43頁⑸甲醛

甲醛(HCHO)是強還原劑，它能與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，對氨基和蛋白質(zhì)的變性有較強活性，這是用甲醛作為滅菌劑的根據(jù)。使用時可以以2份37％甲醛溶液與1份KMnO4混合，或者將37％甲醛溶液直接加熱，產(chǎn)生氣態(tài)甲醛用于滅菌。甲醛滅菌的缺點是穿透力差。⑹過氧乙酸

過氧乙酸是強氧化劑，它是廣譜、高效、速效的化學(xué)殺菌劑，對營養(yǎng)細胞、細菌芽孢、真菌孢子和病毒都有殺滅作用。第21頁/共42頁第21頁/共43頁⑺戊二醛在酸性條件下，不具有殺死芽孢的能力，只有在堿性條件下，才具有殺死芽孢的能力，常用2％的溶液，常用于器具、儀器和工具等滅菌。⑻酚類苯酚毒性較大，易污染環(huán)境，且水溶性差，使應(yīng)用受到限制，而酚類衍生物的使用，擴大了作為消毒劑的使用范圍。第22頁/共42頁第22頁/共43頁四、臭氧滅菌利用臭氧的氧化作用殺死微生物細胞。氧化分解葡萄糖所必需的酶，從而直接破壞其細胞膜，從而將細菌殺死。無污染消毒劑對細菌、霉菌等殺菌效果好安全，殺菌效果明顯，安裝靈活等特點用于潔凈室、凈化設(shè)備的消毒。第23頁/共42頁第23頁/共43頁五、過濾除菌法利用過濾方法阻留微生物，也可達到除菌的目的，這就是過濾除菌法。此法僅適用于澄清液體和氣體的除菌。工業(yè)上常用過濾法大量制備無菌空氣，供好氧微生物培養(yǎng)過程使用。第24頁/共42頁第24頁/共43頁第25頁/共42頁第25頁/共43頁第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的濕熱滅菌一、滅菌條件的選擇選擇的原則：達到滅菌的目的，同時使培養(yǎng)基成分破壞減至最小。1、滅菌溫度和滅菌時間的選擇

為什么選擇高溫快速滅菌？溫度升高，反應(yīng)速率升高，微生物死亡速率遠大于營養(yǎng)成分的的破壞速率滅菌程度與滅菌時間的影響微生物的熱死規(guī)律——對數(shù)殘留定律第26頁/共42頁第26頁/共43頁滅菌程度與滅菌時間的影響

微生物的熱死規(guī)律——對數(shù)殘留定律微生物受熱死亡的主要原因是高熱能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)可認為是單分子反應(yīng)，死亡速率可視為一級反應(yīng)，即與殘存的微生物數(shù)量成正比。第27頁/共42頁第27頁/共43頁式中N－經(jīng)時間t后殘存的活菌濃度（個/L)，N0—開始滅菌時原有活菌濃度（個/L)；t－滅菌時間（s,min）K－滅菌速率常數(shù)或比死亡速率常數(shù)（s-1,min-1）它的大小與微生物的種類和加熱溫度有關(guān)。在同等溫度下，其值小，微生物的耐熱性強。從上式得出：t,N之間的關(guān)系為對數(shù)式中N/N0菌體存活率，而N0/N為滅菌度。t=（2.303/K）㏒(N0/N)第28頁/共42頁第28頁/共43頁⒉影響培養(yǎng)基滅菌的因素⑴培養(yǎng)基成分

油脂、糖類；低質(zhì)量分數(shù)(1％～2％)的NaCl溶液⑵pH值

pH值6.0～8.0，微生物最耐熱；pH<6.0，氫離子易滲入微生物細胞內(nèi)，從而改變細胞的生理反應(yīng)促使其死亡⑶培養(yǎng)基中的顆粒⑷泡沫泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，熱難穿透過去殺滅微生物第29頁/共42頁第29頁/共43頁二、培養(yǎng)基的滅菌方法（1）分批滅菌分批滅菌是在每批培養(yǎng)基全部流入發(fā)酵罐后，就在罐內(nèi)通入蒸汽加熱至滅菌溫度，維持一定時間，再冷卻到接種溫度。實罐滅菌時，發(fā)酵罐與培養(yǎng)基一起滅菌。不需要附屬設(shè)備，操作簡便，常用的滅菌方法加熱和冷卻時間較長，營養(yǎng)隨時間降低，罐利用率低；不能采用高溫快速滅菌工藝。第30頁/共42頁第30頁/共43頁發(fā)酵罐溶積越大，加熱冷卻時間越長

T總=t1+t2+t3

式中t1、t2、t3分別為加熱、維持、冷卻所需要的時間其他滅菌設(shè)備一般采用蒸汽滅菌，如設(shè)備十分耐壓，則可采用較高的溫度，但必須注意設(shè)備內(nèi)部的凹處及露出的小配管等蒸汽不能到達的部位。第31頁/共42頁第31頁/共43頁（2）連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌也叫連消，是指培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的滅菌工藝流程。其溫度一般以126～132℃為宜，總蒸汽壓力要求達到0.044～0.049MPa以上。優(yōu)點營養(yǎng)成分破壞少；發(fā)酵罐非生產(chǎn)占用時間短，溶積利用率提高；蒸汽負荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便；適用于自動化控制，降低勞動強度。第32頁/共42頁第32頁/共43頁缺點不適用于黏度大或固形物含量高的培養(yǎng)基的滅菌；增加了一套連續(xù)滅菌設(shè)備，增加了操作環(huán)節(jié)，增加了染菌的概率。按設(shè)備和工藝條件分（1）蒸汽直接加熱（2）蒸汽間接加熱第33頁/共42頁第33頁/共43頁1、蒸汽直接加熱連續(xù)滅菌系統(tǒng)定義：蒸汽通入培養(yǎng)基中，快速加熱至殺菌溫度，維持一段時間，后冷卻至發(fā)酵溫度的過程。分兩種形式：（1）由連消塔、維持罐和冷卻器組成●配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱60-70℃，防止培養(yǎng)基在殺菌時料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲?！襁B消塔使培養(yǎng)基迅速(20s)升溫(126-132℃)?！窬S持罐：使培養(yǎng)基溫度保持在滅菌溫度下一段時間。2-7min.●冷卻管：將培養(yǎng)基迅速冷卻到40-50℃，輸送到滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)第34頁/共42頁第34頁/共43頁連續(xù)滅菌流程培養(yǎng)基配料配料罐加熱器維持罐冷卻器無菌培養(yǎng)基第35頁/共42頁第35頁/共43頁（2）噴射加熱連續(xù)滅菌流程由噴射加熱、維持罐和真空冷卻器組成的連續(xù)滅菌系統(tǒng)。蒸汽直接噴入待滅菌的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液急劇升溫到預(yù)定的滅菌溫度，培養(yǎng)基在該溫度送入維持管維持一段時間后，通過一膨脹閥進入真空冷卻器冷卻。保證培養(yǎng)基先進先出，避免過熱或者滅菌不徹底升溫快、營養(yǎng)損失小隨著蒸汽的冷凝使培養(yǎng)基稀釋第36頁/共42頁第36頁/共43頁第37頁/共42頁第37頁/共43頁2、蒸