儀器分析第講 色譜法引論

儀器分析第講色譜法引論2023/3/13第一頁，共五十三頁，2022年，8月28日一、色譜法的特點、分類和作用

1.概述

分離、分析混合物最有效的方法。俄國植物學家茨維特在1901年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖?！羯V法首先是一種分離技術(shù)，同時也是一種分析技術(shù)。

試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在色譜分離柱中兩相間不斷進行著的分配過程其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。2023/3/13第二頁，共五十三頁，2022年，8月28日

當流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。

兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)2023/3/13第三頁，共五十三頁，2022年，8月28日2.色譜法分類

(1)氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）。按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜2023/3/13第四頁，共五十三頁，2022年，8月28日(2)液相色譜：流動相為液體（也稱為淋洗液）。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。

離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動相。2023/3/13第五頁，共五十三頁，2022年，8月28日(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡單的色譜方法凝膠色譜法：

測聚合物分子量分布。超臨界色譜:CO2流動相。高效毛細管電泳:九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。2023/3/13第六頁，共五十三頁，2022年，8月28日3.色譜法的特點（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。2023/3/13第七頁，共五十三頁，2022年，8月28日氣固色譜的固定相:多孔性的固體吸附劑顆粒。

固體吸附劑對試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液色譜的固定相:由擔體和固定液所組成。

固定液對試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的分離機理:

吸附與脫附的不斷重復(fù)過程；氣液色譜的分離機理：

氣液兩相間的反復(fù)多次分配過程。二、色譜分離過程

色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的。以氣相色譜為例，氣固色譜和氣液色譜，兩者的分離機理不同。2023/3/13第八頁，共五十三頁，2022年，8月28日1.氣相色譜分離過程當試樣由載氣攜帶進入色譜柱與固定相接觸時，被固定相溶解或吸附;隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附;揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動時又再次被固定相溶解或吸附;隨著載氣的流動，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)地進行。2023/3/13第九頁，共五十三頁，2022年，8月28日2.分配系數(shù)（partionfactor）K

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：2023/3/13第十頁，共五十三頁，2022年，8月28日分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。2023/3/13第十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日3.分配比（partionradio）k

在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。3.分配比可以由實驗測得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；2023/3/13第十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日4.分配系數(shù)與分配比的關(guān)系

式中β為相比率，β＝Vm/

VS。

Vm為流動相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

VS為固定相體積。是反映各種色譜柱柱型特點的又一個參數(shù)。填充柱β：6～35；毛細管柱β：50～1500。K=k.2023/3/13第十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日5.分配比k與保留時間的關(guān)系

分配比k可直接從色譜圖測得。若組分和流動相通過長度為L的分離柱，需要的時間分別為tr和t0，則：2023/3/13第十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日三、色譜流出曲線與術(shù)語1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.保留值

（1）時間表示的保留值

保留時間（tr）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間；死時間（tM或t0）：不與固定相作用的物質(zhì)（如空氣）的保留時間；

調(diào)整保留時間（tr

＇）：tr＇=tr－t0

2023/3/13第十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

Vr=tr×F0F0為柱出口處的載氣流速，單位：mL/min。

死體積（V0）：

V0=t0×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

r＇=Vr－V0

2023/3/13第十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日3.相對保留值r21（選擇因子）組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′r2

/t′r1=V′r2/V′r1相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對這兩種組分的選擇性，又稱選擇因子，廣泛用作色譜定性的依據(jù)！2023/3/13第十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日4.分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子α的關(guān)系對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：α=tr(B)/tr(A)=k(B)/k(A)=K(B)/K(A)

通過選擇因子α把實驗測量值k與熱力學性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來，α對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。2023/3/13第十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日5.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標準偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2或W1/2)：色譜峰高一半處的寬度W1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：Wb=42023/3/13第十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日6.色譜流出曲線的數(shù)學描述

色譜峰為正態(tài)分布時，色譜流出曲線上的濃度與時間的關(guān)系為：2023/3/13第二十頁，共五十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)色譜理論基礎(chǔ)一、塔板理論platetheory二、速率理論ratetheory三、分離度resolution

Fundamentalofchromatographtheory

2023/3/13第二十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日色譜理論

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學和動力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關(guān)系。組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制；（兩相中的運動阻力，擴散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；2023/3/13第二十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日一、塔板理論-柱分離效能指標

1.塔板理論（platetheory）半經(jīng)驗理論；將色譜分離過程比擬作精餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于精餾塔塔板上的平衡過程）。2023/3/13第二十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日塔板理論的假設(shè)1.在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。2.以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）。3.所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4.分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。2023/3/13第二十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H色譜柱的理論塔板數(shù)：n則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系（重要公式）：2023/3/13第二十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在t0時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：（重要公式）2023/3/13第二十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日3.塔板理論的特點和不足(1)當色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。2023/3/13第二十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日3.塔板理論的特點和不足(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。2023/3/13第二十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日二、速率理論-影響柱效的因素1.速率方程（也稱范.弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)減小A、B、C三項可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項各與哪些因素有關(guān)？2023/3/13第二十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日A─渦流擴散項

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒直徑dp↓，填充的越均勻，則A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。2023/3/13第三十頁，共五十三頁，2022年，8月28日B/u—分子擴散項

B=2

γDg

γ：彎曲因子，反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散;(2)擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)分子擴散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴散↑;(4)擴散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。2023/3/13第三十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日

k為容量因子；Dg、DL為擴散系數(shù)。

減小擔體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。C·u—傳質(zhì)阻力項對GC，傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即：

C=（Cg+CL）2023/3/13第三十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日2.載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時：

傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時：

分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。2023/3/13第三十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日3.速率理論的要點(1)組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。(2)通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。2023/3/13第三十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日3.速率理論的要點(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。2023/3/13第三十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日三、分離度（分辨率）

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學因素；

區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動力學因素。色譜分離中的四種情況如圖所示：2023/3/13第三十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日討論：色譜分離中的四種情況的討論：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。2023/3/13第三十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日分離度的表達式：R=0.8：兩峰的分離程度可達89%；R=1：分離程度98%；R=1.5：達99.7%，相鄰兩峰完全分離的標準2023/3/13第三十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日R的定義并未反映影響分離度的諸因素。

實際上，R受柱效n、相對保留值r21

（選擇因子a

）和容量因子k三個參數(shù)的控制，它們之間的關(guān)系可以用基本色譜分離方程式來表示。四、基本色譜分離方程式2023/3/13第三十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日推導可得基本色譜分離方程式：

2023/3/13第四十頁，共五十三頁，2022年，8月28日式中，a為選擇性因子，a=r21．或：2023/3/13第四十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日

在實際應(yīng)用中，往往用neff代替n，可得基本色譜分離方程式的又一表達式．：

或：2023/3/13第四十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日或上式更加常用！2023/3/13第四十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日1、分離度與柱效的關(guān)系

當固定相確定，被分離物質(zhì)對的α確定后，分離度將取決于n。這時，對于一定理論板高的柱子，分離度的平方與柱長成正比，即

(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2

說明用長的色譜柱可以提高分離度，但延長了分析時間。因此，提高分離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板高，以提高分離度。2023/3/13第四十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日2.分離度與選擇因子的關(guān)系

由基本色譜方程式判斷，當α=1時，R=0。這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分分離。顯然，α大，選擇性好。一般通過改變固定相和流動相的性質(zhì)和組成或降低柱溫，可有效增大α值。

2023/3/13第四十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日2.分離度與選擇因子的關(guān)系增大α是提高分離度的最有效方法。

研究證明α的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。計算可知，在相同分離度下，當α增加一倍，需要的n有效減小10000倍。

增大α的最有效方法是選擇合適的固定液。2023/3/13第四十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日

在實際中，基本色譜分離方程式是很有用的公式，它將柱效、選擇因子、分離度三者的關(guān)系聯(lián)系起來了，知道其中兩個指標，就可以計算出第三個指標。五、基本色譜分離方程式的應(yīng)用2023/3/13第四十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日例題1：

有一根1m長的柱子，分離組分1和2，得到如下圖所示的色譜圖。圖中，橫坐標l為記錄筆走紙距離，若欲得到